Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

요약

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

초록

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-β receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate ¹²⁵I-TGF-β2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

서문

Specific detection of proteins expressed during embryonic development is required to validate expression profiles obtained by measuring their cognate mRNAs with RT-PCR or in situ hybridization (ISH). This is commonly achieved by a western blot of embryo extracts followed by detection with specific antibodies. However, this approach is hard to apply to proteins that are in very low abundance, or that have properties that hamper their quantitative transfer during their blotting. Betaglycan, also known as the type III transforming growth factor β (TGF-β) receptor (TGFBR3), is an example of these difficulties. TGFBR3 is a part time membrane proteoglycan that binds TGF-β through its core protein¹, with notably higher affinity for the isoform TGF-β2, a property that distinguishes it from any other TGF-β binding protein². TGFBR3 in the zebrafish is expressed from 8 hpf on, reaching a maximum by 72 hpf, as detected by RT-PCR of its mRNA³.

However, despite the availability of a very specific antibody³, every attempt to detect its translated product by western blot proved unsuccessful. Reckoning that TGFBR3's proteoglycan nature, as well as putative low abundance may be accountable for this failure, a detection method, AFLIP, which takes advantage of TGFBR3 high affinity for TGF-β2 was devised. In this method a protein extract from pooled embryos is allowed to specifically bind ¹²⁵I-labeled TGF-β2 and the receptor-ligand complexes are purified by immunoprecipitation and cross-linked before separation by SDS-PAGE. The migration patterns observed by autoradiography of the gels revealed the presence and nature of the labeled receptor species. This approach combines the ligand specificity of affinity labeling with immunoprecipitation by specific antibodies, increasing detection range, avoiding the inefficient transfer blotting of TGFBR3. Due to its inherent properties, the AFLIP assay is not a quantitative assay but can be used to confidently gauge relative experimental differences in the analyzed receptor.

프로토콜

동물에서 수행 모든 실험은 CICUAL 프로토콜 번호로, 실험 동물 관리 및 멕시코의 자치 대학교 (UNAM)의 사용을위한위원회의 승인을했다 : FLC40-14. (CICUAL "Comité Institucional 파라 엘 Cuidado y를 USO 드 로스 짐승 같은 드하기 Laboratorio 델 연구소의 드 Fisiologìa Celular, 대학교 나시 오날 자치시 드 멕시코").

배아 단백질 추출물 1. 준비

1. 각 조건은 예를 들어 72 시간 포스트 수정 (HPF)를 위해, 원하는 단계에서 (morphants 대 야생형)을 비교하기 위해 200 배아 - (100)를 수집합니다.
2. 물고기의 물을 함유하는 배양 접시에 장소 배아는 (표 1 참조) 수동 뾰족한 집게를 사용하여 배아를 dechorionate. 이 대상 수용체을 소화 수 있으므로이 단계 (또는 프로토콜을 통해 다른 단백질 분해 효소) 동안 프로 나제​​를 사용하지 마십시오.
3. 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 넣어 배아 및 배아 TW 씻어1X 인산 완충 용액 (PBS)와 얼음 (표 1 참조).
4. deyolk 버퍼 500 μL를 추가 (표 1 참조).
5. (- 40 배 30) 용액에 배아를 부드럽게 아래로 피펫 팅에 의해 노른자의 대부분을 놓습니다. 72 HPF, 48 HPF의 배아를 들어 각각 파란색과 노란색 피펫 팁을 사용합니다. 노란색 끝은 약간 배아를 파괴하지 않도록 절단해야 할 수도 있습니다. 성공적인 노른자 자료는 현미경으로 배아를 관찰하여 확인할 수 있습니다.
6. 15 초 동안 600 XG에서 원심 분리하여 배아를 수집합니다.
7. 피펫을 사용하여 조심스럽게 상층 액을 버린다.
8. 워시 배아 회 500 ㎕의 세척 완충액으로 부드럽게 최저 속도 텍싱하여 (표 1 참조).
9. 15 초 동안 600 XG에서 원심 분리하여 배아를 수집합니다.
10. 여기에서 시작, 4 ° C에서 절차를 계속합니다.
11. 피펫을 사용하여 조심스럽게 상층 액을 버린다.
12. 용해 완충액 350 μL에 재현 탁 배아 (표 1 참조)과 플라스틱 유봉을 사용하여 균질화한다.
13. 4 ° C에서 테스트 튜브 로커에 용해 배아를 교반하면서 30 분을 품어.
14. 원심 분리하여 불용성 잔사를 제거하기 위해 15 분 동안 11,000 XG에서 배아를 용해.
15. 전송 신선한 튜브에 피펫을 이용하여 상층 액을 깨끗이 밀어 냈습니다.
16. 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석 ^(4), 또는 다른 적절한 방법에 의해 전체 단백질을 결정한다. 브래드 포드 분석법이 사용되는 경우가 ⁴ 표준 단백질의 과소 원인으로, 용해 버퍼에 세제 선물 동등한 농도의 존재 검량선을 수행한다.

2. 감지 내인성 수용체 단백질의

1. 선호도 라벨링 및 면역 침전 (모든 단계 4 ^O를 C에서)
   1. 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 총 배아 단백질의 500 μg의 버퍼 1 (표 1 참조) 1 μg의 / μL로 희석 - (400)를 배치합니다.
      주 : 약 100 배의 총 단백질 500 μg의 획득하기 위해서 - 200 배아 초기 처리되어야한다. 72 HPF 배아는 정기적으로 betaglycan 검출을위한 충분한 총 배아 단백질의 ~ 5 μg의를 얻을.
   2. 150 오후 최종 농도에 도달하고 4 ° C에서 테스트 튜브 로커 2 시간에 교반 배양 표시 TGF-β2 주식의 충분한 볼륨을 추가합니다. AFLIP이 시작되기 전에 Cheifetz 등. ^(5)에 의해 설명 된 바와 같이 TGF-β2는 클로라민 T 법에 의해 ¹²⁵ I로 표시해야합니다.
      주의 : 내가 리간드 레이블 ^(125)를 처리하는 동안 노출을 최소화하기 위해 차폐.
   3. (100) 희석 (배양이 O / N 수있다) 4 ° C에서 또 다른 2 시간 동안 배양을 계속 : 1에 도달하기 위해 관심있는 수용체에 대한 희석 항체의 충분한 볼륨을 추가합니다. 따라서 본 연구에서 사용하고 다른 ^3을 설명하지만,의 품질에 따라, 항혈청 번호 (31)의 최적의 희석이고tibody, 큰 또는 작은 희석 최적 일 수있다.
   4. 적절한 면역 글로불린 결합 구슬의 50 μl를 추가합니다 (예를 들어, 이전에 TNTE에서 평형 1 재현 탁 G 단백질 세 파로스, : TNTE에서 원래 볼륨의 5)를 4 °에서 테스트 튜브 로커에 교반과 함께 50 분 동안 품어 기음.
   5. 20 초 동안 11,000 XG에서 microcentrifugation으로 구슬을 복구 할 수 있습니다.
   6. 적절한 방사성 쓰레기 용기에 상층 액을 버린다.
   7. 20 초 때마다 11,000 XG에, 텍싱 및 microcentrifugation에 의해 IP 세척 버퍼 (표 1 참조) 1 ㎖로 IP-구슬 세 번 씻으십시오.
   8. 재현 탁 IP-구슬 IP 세척 버퍼 250 μL있다.
   9. (10 ㎎ / ㎖에서 DMSO에 용해 DSS) 숙신 이미 딜 수베의 1.5 μl를 추가합니다. 바로이 단계에서의 사용 전에 DSS 솔루션을 준비합니다.
   10. 교반 4 ° C에서 15 분 동안 품어.
   11. 가교 반응을 종결하기 위해, 500 ㎕의 O를 추가충분히 트리스 - CL pH 7.4의 재고 보충 F IP 세척 버퍼는 25 mM 트리스 - (CL)에 도달한다. 트리스의 유리 아미노산 그룹은 미 반응 DSS를 캡처합니다.
   12. 20 초 동안 11,000 XG에 원심 분리기는 IP-구슬을 수집하고 뜨는을 폐기합니다.
   13. 재현 탁 IP 비드 램리 완충액 30 μL 감소한다.
   14. 삶아 샘플 94 ° C에서 5 분.
   15. 선택적으로, 제조업 자의 프로토콜을 사용하여 감마 계수기에서 샘플을 분석한다.
2. 샘플 분석
   1. SDS-PAGE를 변성에 따라 샘플. 수용체의 질량에 해당하는 비율로 폴리 아크릴 아미드를 사용하여 표준 절차에 따라 젤을 실행합니다.
   2. 고정 제 용액에서 겔을 담그고 실온에서 30 분 동안 (표 1 참조).
   3. 15 분 동안 증류수로 젤을 씻으십시오.
   4. 이전에 수화 필터 종이에 젤을 놓고 사란 랩 필름 커버.
   5. 1 시간 동안 80 ° C에서 건조 젤.
   6. 흰색은 phosphorimager의 scre에 젤을 노출RT O / N에서 엉.
   7. 제조 업체의 프로토콜을 사용하여은 phosphorimager를 사용하여 노출 된 화면을 검색합니다.

결과

그림 1은 AFLIP 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. ¹²⁵ I-리간드에서 온 레인 1 신호는 공유 (150 kDa의 마커 아래 BG 코어) 제브라 피쉬 betaglycan 핵심 단백질 또는 글리코 사 미노 글리 칸의 첨부 파일 (GAG, 도말하여 프로테오글리칸 형태로 처리 된 BG 코어 중 하나에 연결된 ) 170 kDa 내지 겔의 상단까지. 마이그레이션이 패턴 날카로운 코어 단백질 플러스 (GAG ?...

토론

관심의 단백질에 대한 특이 항체와 서양 말의 사용은 배아 발생 동안 발현 ^7을 연구하는 유용한 도구입니다. 그러나, 높은 당화 단백질의 면역 인해 자신의 비효율적 인 전송 및 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 막 ^8,9 약한 결합을 매우 성공적으로되지 않았습니다.

프로테오글리칸 때문에 음전하를하고 폴리스티렌 표면 또는 소수성 블로 팅 막 중 하나에 잘 결합?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix