Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

Resumo

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Resumo

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-β receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate ¹²⁵I-TGF-β2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

Introdução

Specific detection of proteins expressed during embryonic development is required to validate expression profiles obtained by measuring their cognate mRNAs with RT-PCR or in situ hybridization (ISH). This is commonly achieved by a western blot of embryo extracts followed by detection with specific antibodies. However, this approach is hard to apply to proteins that are in very low abundance, or that have properties that hamper their quantitative transfer during their blotting. Betaglycan, also known as the type III transforming growth factor β (TGF-β) receptor (TGFBR3), is an example of these difficulties. TGFBR3 is a part time membrane proteoglycan that binds TGF-β through its core protein¹, with notably higher affinity for the isoform TGF-β2, a property that distinguishes it from any other TGF-β binding protein². TGFBR3 in the zebrafish is expressed from 8 hpf on, reaching a maximum by 72 hpf, as detected by RT-PCR of its mRNA³.

However, despite the availability of a very specific antibody³, every attempt to detect its translated product by western blot proved unsuccessful. Reckoning that TGFBR3's proteoglycan nature, as well as putative low abundance may be accountable for this failure, a detection method, AFLIP, which takes advantage of TGFBR3 high affinity for TGF-β2 was devised. In this method a protein extract from pooled embryos is allowed to specifically bind ¹²⁵I-labeled TGF-β2 and the receptor-ligand complexes are purified by immunoprecipitation and cross-linked before separation by SDS-PAGE. The migration patterns observed by autoradiography of the gels revealed the presence and nature of the labeled receptor species. This approach combines the ligand specificity of affinity labeling with immunoprecipitation by specific antibodies, increasing detection range, avoiding the inefficient transfer blotting of TGFBR3. Due to its inherent properties, the AFLIP assay is not a quantitative assay but can be used to confidently gauge relative experimental differences in the analyzed receptor.

Protocolo

Todos os experimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê de Laboratório Animal Care e Use da Universidade Nacional Autônoma do México (UNAM), sob o número CICUAL-Protocol: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México").

1. Preparação do extracto do embrião Proteína

1. Colete 100 - 200 embriões para cada condição para comparar (morphants vs. tipo selvagem) no estágio desejado, por exemplo 72 horas após a fertilização (hpf).
2. Embriões lugar em placas de Petri contendo água de peixe (ver Tabela 1) e dechorionate manualmente embriões usando uma pinça de ponta fina. Evitar o uso de pronase durante este passo (ou qualquer outra protease ao longo do protocolo), uma vez que podem digerir o receptor alvo.
3. embriões lugar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e lavar embriões twgelo com uma solução de tampão de fosfato de 1x (PBS) (ver Tabela 1).
4. Adicionar 500 ul de tampão deyolk (ver Tabela 1).
5. Liberar mais de gema de cuidado pipetando para cima e para baixo (cerca de 30 - 40 vezes) os embriões na solução. Para 72 hpf e 48 embriões HPF usar azul e amarelo pontas de pipeta, respectivamente. pontas amarelas pode precisar de ser ligeiramente cortada para evitar a destruição de embriões. O lançamento gema de sucesso pode ser verificado observando-se os embriões sob o microscópio.
6. Recolhe embriões por centrifugação a 600 xg durante 15 seg.
7. Elimine o sobrenadante cuidadosamente, usando uma pipeta.
8. Embriões lavar duas vezes com 500 ul de tampão de lavagem (ver Tabela 1) por vortex suavemente na velocidade mais baixa.
9. Recolhe embriões por centrifugação a 600 xg durante 15 seg.
10. A partir daqui, o processo continua a 4 ° C.
11. Elimine o sobrenadante cuidadosamente, usando uma pipeta.
12. Ressuspender embriões em 350 ul de tampão de lise (ver Tabela 1) e homogeneizar utilizando um pilão de plástico.
13. Incubar embriões lisadas 30 min, com agitação num agitador tubo de ensaio a 4 ° C.
14. Centrifugar embriões lisadas a 11000 xg durante 15 minutos a fim de remover os detritos insolúveis.
15. Transferência afastada sobrenadante utilizando uma pipeta para um tubo fresco.
16. Determinar a proteína total pelo ensaio de proteína de Bradford ^4, ou outro procedimento adequado. Se ensaio de Bradford é utilizado, realizar a curva de calibração na presença de concentrações equivalentes dos detergentes presentes no tampão de lise, uma vez que causam uma subestimação da proteína padrão ^4.

2. Detecção da proteína endógena do Receptor

1. Affinity Labeling e Immunoprecipitation (todos estes passos, a 4 ^° C)
   1. Coloque 400-500 ug de proteína total de embriões num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e diluir até 1 ug / uL com tampão 1 (ver Tabela 1).
      Nota: A fim de obter 500 mg de proteína embrião total, cerca de 100-200 embriões devem ser inicialmente processado. 72 hpf embriões rotineiramente obter ~ 5 ^ g de proteína total de embrião, o qual é suficiente para a detecção betaglicano.
   2. Adicionar um volume suficiente de estoque de TGF-β2 marcado para atingir uma concentração final de 150 pM e incubar com agitação em um tubo de ensaio balancim 2 h a 4 ° C. TGF-β2 deve ser marcado antes AFLIP é iniciado, com ¹²⁵ I pelo método da cloramina T como descrito por Cheifetz et ai. ^5.
      CUIDADO: O uso de blindagem para minimizar a exposição ao manusear ¹²⁵ I ligando marcado.
   3. Adicionar um volume suficiente de anticorpo não diluído contra o receptor de interesse, a fim de chegar a uma diluição de 1: 100 e continuar a incubação durante mais 2 horas a 4 ° C (de incubação pode ser O / N). Esta é a diluição óptima de anti-soro # 31, utilizado neste estudo e descrito noutro local ^3, mas, dependendo da qualidade do umtibody, uma diluição maior ou menor pode ser a ideal.
   4. Adicionar 50 ul de pérolas de ligação de imunoglobulina adequada (por exemplo, a proteína G-Sepharose ', que foi previamente equilibrada em TNTE e ressuspensas 1: 5 do seu volume original em TNTE) e incubar durante 50 minutos com agitação num agitador tubo de ensaio a 4 ° C.
   5. Recuperar os grânulos por microcentrifugação a 11000 xg durante 20 seg.
   6. Elimine o sobrenadante em um recipiente de lixo radioactivo apropriado.
   7. Lavam-se as esferas de IP-se três vezes com 1 ml de tampão de lavagem de IP (ver Tabela 1), por agitação em vórtice e microcentrifugação a 11000 xg durante 20 seg de cada vez.
   8. Ressuspender IP-grânulos em 250 ul de tampão de lavagem IP.
   9. Adicionar 1,5 uL de suberato de dissuccinimidilo (DSS, dissolvido em DMSO a 10 mg / ml). Preparar a solução de DSS imediatamente antes da sua utilização neste passo.
   10. Incubar durante 15 min a 4 ° C com agitação.
   11. A fim de parar a reacção de reticulação, adicionar 500 ul Otampão de lavagem f IP, suplementado com suficiente de Tris-Cl pH 7,4 estoque para atingir 25 mM de Tris-Cl. Os grupos amino livres em Tris capturar DSS que não reagiu.
   12. Centrifuga-se a 11000 xg durante 20 seg para recolher IP-grânulos e descartar o sobrenadante.
   13. Ressuspender IP-esferas em 30 ul de tampão redutor de Laemmli.
   14. Ferver as amostras 5 min a 94 ° C.
   15. Opcionalmente, analisar amostras em um contador gama usando o protocolo do fabricante.
2. Análise de amostras
   1. amostras submetido a uma desnaturação SDS-PAGE. Use poliacrilamida na percentagem adequada para a massa do receptor e executar gel sob procedimento padrão.
   2. Mergulhar em gel de solução fixadora (ver Tabela 1) durante 30 min à TA.
   3. Lavar o gel com água destilada durante 15 min.
   4. Coloque gel em papel de filtro previamente hidratado e cubra com filme de envolvimento Saran.
   5. gel seco a 80 ° C durante 1 h.
   6. Expor gel em um scre phosphorimager brancoen à TA S / N.
   7. Digitalizar tela exposta usando um phosphorimager usando o protocolo do fabricante.

Resultados

A Figura 1 mostra um resultado representativo obtido com AFLIP. Os sinais nas faixas 1 vêm do ^125I-ligando ligado de forma covalente, quer a proteína de peixe-zebra betaglicano núcleo (núcleo BG, abaixo da kDa marcador 150) ou o núcleo BG que foi processado para a sua forma de proteoglicanos por ligação de glicosaminoglicanos (GAG, esfregaço variando de 170 kDa para a parte superior do gel). Este padrão de migração, uma proteína núcleo afiado mais...

Discussão

O uso de transferências de Western com um anticorpo específico contra uma proteína de interesse é uma ferramenta valiosa para estudar a sua expressão ⁷ durante a embriogénese. No entanto, immunoblotting de proteínas altamente glicosiladas não tem sido muito bem sucedida, devido à sua transferência ineficiente e de ligação fraca para nitrocelulose ou PVDF membranas ^8,9.

Proteoglicanos são um bom exemplo desta lacuna, por causa de suas cadeias de glicosaminog...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix