ゼブラフィッシュ胚からの内因性受容体の親和性ラベリング検出

要約

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

要約

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-β receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate ¹²⁵I-TGF-β2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

概要

Specific detection of proteins expressed during embryonic development is required to validate expression profiles obtained by measuring their cognate mRNAs with RT-PCR or in situ hybridization (ISH). This is commonly achieved by a western blot of embryo extracts followed by detection with specific antibodies. However, this approach is hard to apply to proteins that are in very low abundance, or that have properties that hamper their quantitative transfer during their blotting. Betaglycan, also known as the type III transforming growth factor β (TGF-β) receptor (TGFBR3), is an example of these difficulties. TGFBR3 is a part time membrane proteoglycan that binds TGF-β through its core protein¹, with notably higher affinity for the isoform TGF-β2, a property that distinguishes it from any other TGF-β binding protein². TGFBR3 in the zebrafish is expressed from 8 hpf on, reaching a maximum by 72 hpf, as detected by RT-PCR of its mRNA³.

However, despite the availability of a very specific antibody³, every attempt to detect its translated product by western blot proved unsuccessful. Reckoning that TGFBR3's proteoglycan nature, as well as putative low abundance may be accountable for this failure, a detection method, AFLIP, which takes advantage of TGFBR3 high affinity for TGF-β2 was devised. In this method a protein extract from pooled embryos is allowed to specifically bind ¹²⁵I-labeled TGF-β2 and the receptor-ligand complexes are purified by immunoprecipitation and cross-linked before separation by SDS-PAGE. The migration patterns observed by autoradiography of the gels revealed the presence and nature of the labeled receptor species. This approach combines the ligand specificity of affinity labeling with immunoprecipitation by specific antibodies, increasing detection range, avoiding the inefficient transfer blotting of TGFBR3. Due to its inherent properties, the AFLIP assay is not a quantitative assay but can be used to confidently gauge relative experimental differences in the analyzed receptor.

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プロトコル

FLC40-14：動物で行わ全ての実験はCICUAL-プロトコル番号の下、メキシコ自治大学（UNAM）の実験動物管理使用委員会によって承認されました。 （CICUAL：「ComitéInstitucionalパラエルCuidado yの嘘・デ・ロス・Animales・デ・ラボラトリ・デル・研究所・デ・FisiologìaCELULAR、ナショナル大学自治・デ・メキシコ」）。

胚のタンパク質抽出物の調製

1. 各条件は、例えば72時間後に受精（HPF）のために、所望の段階で（モルファント対野生型）を比較するための200の胚 - 100を収集します。
2. 先の細いピンセットを使用して場所の魚の水を含むペトリ皿中の胚（ 表1参照）、手動dechorionate胚。それは、標的受容体を消化することができるように、この段階（またはプロトコルを通じて、他のプロテアーゼ）中にプロナーゼを使用しないでください。
3. 1.5mlマイクロチューブに入れ胚と胚TWを洗います1×リン酸緩衝溶液（PBS）と氷（ 表1参照）。
4. （ 表1を参照）deyolk用緩衝液500μlを追加します。
5. （ - 40倍、約30）溶液中で胚を優しく上下にピペッティングにより卵黄のほとんどをリリース。 72 HPFと48 HPFの胚については、それぞれ、青と黄色のピペットチップを使用します。黄色のヒントが少し胚を壊さないようにカットする必要があるかもしれません。成功した卵黄の放出は、顕微鏡下で胚を観察することによって確認することができます。
6. 15秒間600×gで遠心分離することによって胚を収集します。
7. ピペットを使用して、慎重に上清を捨てます。
8. 洗浄胚は二回500μlの洗浄バッファーで穏やかに最低速でボルテックスすることによって（ 表1参照します）。
9. 15秒間600×gで遠心分離することによって胚を収集します。
10. ここから出発し、4°Cで手順を続行します。
11. ピペットを使用して、慎重に上清を捨てます。
12. 溶解バッファー350μlの再懸濁胚（表1を参照）、プラスチック製乳棒を用いて均質化します。
13. 4°Cで試験管ロッカーに溶解させた胚を攪拌しながら30分間インキュベート。
14. 遠心分離機は、不溶性の破片を除去するために15分間、11,000×gで胚を溶解しました。
15. 転送が新しいチューブにピペットを用いて上清をクリア。
16. Bradfordタンパク質アッセイ^4、または他の適切な手順により総タンパク質を決定します。 Bradfordアッセイを使用している場合、彼らは⁴標準タンパク質の過小評価を引き起こすように、溶解緩衝液中の界面活性剤の提示の等価な濃度の存在下で較正曲線を実行します。

2.検出内因性受容体タンパク質の

1. 親和性標識および免疫沈降（すべての手順4 ^{O C}で）
   1. 1.5mlマイクロチューブに総胚タンパク質の500μgのバッファ1（ 表1を参照）を1μg/μlに希釈する- 400を置きます。
      注：総胚タンパク質500μgのを得るためには、約100から200胚が最初に処理されなければなりません。 72 HPFの胚は、日常的にβグリカンの検出のために十分である総胚タンパク質、の〜5μgのをもたらします。
   2. 試験管ロッカーに150 PMの最終濃度に達すると攪拌しながらインキュベートし、4℃で2時間標識TGF-β2株式の十分なボリュームを追加します。 AFLIPが開始される前にCheifetz ら ⁵によって説明したように、TGF-β2は、クロラミンT法によって¹²⁵ Iで標識されなければなりません。
      注意：使用して私は、リガンドを標識した^125の処理中^に露出を最小限にするためにシールド。
   3. 100希釈および（インキュベーションは、O / Nであってもよい）4℃でさらに2時間インキュベーションを継続：1に到達するために、目的の受容体に対する希釈していない抗体の十分なボリュームを追加します。これは、この研究で使用され、他の場所^3を説明するが、ANの品質に応じて、抗血清＃31の最適希釈でありますtibody、より大きいまたはより小さい希釈が最適であってもよいです。
   4. 適切な免疫グロブリン結合ビーズの50μlを添加（例えば、以前にTNTEで平衡化し、1再懸濁させたGタンパク質セファロース、：TNTEで元の体積の5）と4℃で試験管ロッカー上で撹拌しながら50分間インキュベートしますC.
   5. 20秒間11,000×gで微量遠心によってビーズを回復。
   6. 適切な放射性ゴミ容器に上清を捨てます。
   7. 20秒間11,000×gで毎回ボルテックスし、微量遠心することにより、（ 表1を参照）IP洗浄緩衝液1mlでIP-ビーズを3回洗浄します。
   8. IP洗浄緩衝液250μlの中に再懸濁したIP-ビーズ。
   9. （10 mg / mlとでDMSOに溶解したDSS、​​）ジスクシンイミジルスベレートの1.5μlを添加します。ちょうどこの段階でその使用前にDSS溶液を調製します。
   10. 攪拌しながら4℃で15分間インキュベートします。
   11. 架橋反応をクエンチするために、500μlのOを加えます十分トリス-Cl pH7.4の在庫を補充したF IP洗浄緩衝液は、25mMのトリス-Clに到達します。トリス中の遊離アミノ基が未反応のDSSをキャプチャします。
   12. 20秒IP-ビーズを収集し、上清を廃棄するための11,0​​00×gで遠心分離します。
   13. 再懸濁IP-ビーズLaemmliバッファーを減らす30μlのインチ
   14. 沸騰サンプル94℃で5分間。
   15. 必要に応じて、製造業者のプロトコルを使用して、ガンマカウンターでサンプルを分析します。
2. 試料分析
   1. 変性SDS-PAGEの対象サンプル。受容体の質量のための適切な割合でポリアクリルアミドを使用し、標準的な手順の下でゲルを実行します。
   2. 固定液中でゲルを浸し、室温で30分間（ 表1参照）。
   3. 15分間蒸留水でゲルを洗浄してください。
   4. 以前に水和ろ紙にゲルを置き、サランラップフィルムでカバーしています。
   5. 1時間80℃で乾燥ゲル。
   6. 白ホスホイメージャSCREにゲルを公開RT O / Nでアン。
   7. 製造業者のプロトコルを使用して、ホスホイメージャを用いて露光画面をスキャンします。

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結果

図1は AFLIPで得られた代表的な結果を示しています。 ¹²⁵ I-リガンドから来レーン1の信号は、共有ゼブラフィッシュβグリカンコアタンパク質（BGコア、150 kDaのマーカー以下）またはグリコサミノグリカンのアタッチメント（GAG、スミアによってそのプロテオグリカンの形に加工されたBGコアのいずれかにリンクされています）170キロダルトンから?...

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ディスカッション

目的のタンパク質に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロットの使用は、胚発生時にその発現^7を研究するため^の貴重なツールです。しかし、高度にグリコシル化されたタンパク質のイムノブロットは、その非効率的な転送およびニトロセルロースまたはPVDF膜^8,9に弱い結合に非常に成功していません。

プロテオグリカンは理由負に帯電してい...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix