Affinitatsmarkierung Nachweis endogener Receptors von Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Zusammenfassung

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-β receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate ¹²⁵I-TGF-β2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

Einleitung

Specific detection of proteins expressed during embryonic development is required to validate expression profiles obtained by measuring their cognate mRNAs with RT-PCR or in situ hybridization (ISH). This is commonly achieved by a western blot of embryo extracts followed by detection with specific antibodies. However, this approach is hard to apply to proteins that are in very low abundance, or that have properties that hamper their quantitative transfer during their blotting. Betaglycan, also known as the type III transforming growth factor β (TGF-β) receptor (TGFBR3), is an example of these difficulties. TGFBR3 is a part time membrane proteoglycan that binds TGF-β through its core protein¹, with notably higher affinity for the isoform TGF-β2, a property that distinguishes it from any other TGF-β binding protein². TGFBR3 in the zebrafish is expressed from 8 hpf on, reaching a maximum by 72 hpf, as detected by RT-PCR of its mRNA³.

However, despite the availability of a very specific antibody³, every attempt to detect its translated product by western blot proved unsuccessful. Reckoning that TGFBR3's proteoglycan nature, as well as putative low abundance may be accountable for this failure, a detection method, AFLIP, which takes advantage of TGFBR3 high affinity for TGF-β2 was devised. In this method a protein extract from pooled embryos is allowed to specifically bind ¹²⁵I-labeled TGF-β2 and the receptor-ligand complexes are purified by immunoprecipitation and cross-linked before separation by SDS-PAGE. The migration patterns observed by autoradiography of the gels revealed the presence and nature of the labeled receptor species. This approach combines the ligand specificity of affinity labeling with immunoprecipitation by specific antibodies, increasing detection range, avoiding the inefficient transfer blotting of TGFBR3. Due to its inherent properties, the AFLIP assay is not a quantitative assay but can be used to confidently gauge relative experimental differences in the analyzed receptor.

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Protokoll

Alle Versuche an Tieren durchgeführt wurden vom Ausschuss für Laboratory Animal Care und Verwenden der Autonomen Nationalen Universität von Mexiko (UNAM) genehmigt, unter dem CICUAL-Protokollnummer: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México").

1. Herstellung von Embryo Protein Extract

1. Sammeln Sie 100 bis 200 Embryonen für jede Bedingung zu vergleichen (morphants vs. Wildtyp) in der gewünschten Stufe, zum Beispiel 72 Stunden nach der Befruchtung (HPF).
2. Platz Embryonen in Petrischalen mit Fischwasser (siehe Tabelle 1) und manuell dechorionate Embryonen mit feinen bestückte Zange. Während dieses Schritts zu vermeiden (oder einer anderen Protease gesamten Protokoll) unter Verwendung von Pronase, da es die gezielte Rezeptor verdauen kann.
3. Ort Embryonen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und wasche Embryonen twEis mit 1x Phosphatpufferlösung (PBS) (siehe Tabelle 1).
4. In 500 ul deyolk Puffer (siehe Tabelle 1).
5. Lassen Sie die meisten Eigelb durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten (ca. 30 - 40-mal) die Embryonen in der Lösung. Für 72 HPF und 48 HPF Embryonen verwenden, blaue und gelbe Pipettenspitzen sind. Gelb Spitzen müssen leicht geschnitten werden kann, Zerstörung von Embryonen zu vermeiden. Die erfolgreiche Dotter Freisetzung kann durch die Beobachtung Embryonen unter dem Mikroskop geprüft werden.
6. Sammeln Embryonen durch Zentrifugation bei 600 xg für 15 sec.
7. Überstand verwerfen sorgfältig durch eine Pipette.
8. Wash Embryonen zweimal mit 500 & mgr; l Waschpuffer (siehe Tabelle 1) durch bei niedrigster Geschwindigkeit sanft verwirbelt.
9. Sammeln Embryonen durch Zentrifugation bei 600 xg für 15 sec.
10. Ab hier geht das Verfahren bei 4 ° C.
11. Überstand verwerfen sorgfältig durch eine Pipette.
12. Resuspendieren Embryonen in 350 & mgr; l Lysepuffer (siehe Tabelle 1) und homogenisieren einen Plastik zerstoßen.
13. Inkubieren lysiert Embryonen 30 min unter Rühren auf einem Reagenzglas rocker bei 4 ° C.
14. Zentrifuge lysiert Embryonen bei 11.000 xg für 15 min, um unlösliche Rückstände zu entfernen.
15. Transfer geklärte Überstand einer Pipette in ein frisches Röhrchen verwenden.
16. Bestimmung der Gesamtprotein durch Bradford-Test ⁴ oder ein anderes geeignetes Verfahren. Wenn Bradford - Test verwendet wird, führen Sie die Kalibrierungskurve in Gegenwart von äquivalenten Konzentrationen der Waschmittel präsentiert im Lysepuffer, da sie eine Unterschätzung des Proteins Standard - ⁴ führen.

2. Nachweis von endogenen Rezeptor Protein

1. Affinitätsmarkierung und Immunpräzipitation (alle diese Schritte wurden bei 4 ^° C)
   1. Platzieren 400-500 ug Gesamt - Embryo - Protein in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und mit Wasser auf 1 & mgr; g / & mgr; l mit Puffer 1 (siehe Tabelle 1).
      Hinweis: Um 500 ug Gesamt-Embryo-Protein zu erhalten, etwa 100 bis 200 Embryonen müssen zunächst verarbeitet werden. 72 HPF Embryonen routinemäßig ergeben ~ 5 ug Gesamt-Embryo-Protein, das für Betaglycan Nachweis ausreichend ist.
   2. Hinzufügen genügend Volumen an markiertem TGF-β2 Lager um eine Endkonzentration von 150 pM zu erreichen und inkubiere unter Schütteln auf einem Reagenzglas Wippe 2 h bei 4 ° C. TGF-β2 müssen gekennzeichnet werden , bevor AFLIP gestartet wird, mit ¹²⁵ I nach dem Verfahren Chloramin T , wie durch Cheifetz et al. ^5.
      ACHTUNG: Verwenden Sie Abschirmung Exposition zu minimieren , während ¹²⁵ Umgang mit der Bezeichnung I - Liganden.
   3. Hinzufügen genügend Volumen an unverdünntem Antikörper gegen den Rezeptor von Interesse, um eine 1 zu erreichen: 100 Verdünnung und weiter Inkubation für weitere 2 h bei 4 ° C (Inkubation kann O / N sein). Dies ist die optimale Verdünnung des Antiserums # 31, die in dieser Studie verwendet und anderswo ³ beschrieben, jedoch in Abhängigkeit von der Qualität der eintibody, eine größere oder kleinere Verdünnung kann die optimal sein.
   4. Zugabe von 50 & mgr; l geeignete Immunglobulin-Bindungsperlen (zB G-Protein-Sepharose, die zuvor in TNTE äquilibriert wurde und resuspendiert 1: 5 des ursprünglichen Volumens in TNTE) und Inkubation für 50 min unter Rühren auf einem Reagenzglas rocker bei 4 ° C.
   5. Gewinnen Sie die Perlen durch Mikrozentrifugieren bei 11.000 × g für 20 Sekunden.
   6. Überstand verwerfen in einem geeigneten radioaktiven Abfallbehälter.
   7. Waschen Sie die IP-Perlen dreimal mit 1 ml IP - Waschpuffer (siehe Tabelle 1) durch Vortexen und Mikrozentrifugation bei 11.000 xg für 20 sec jedes Mal.
   8. Resuspendieren IP-Perlen in 250 ul IP Waschpuffer.
   9. Fügen 1,5 ul Disuccinimidylsuberat (DSS, gelöst in DMSO bei 10 mg / ml). Bereiten Sie die DSS-Lösung kurz vor der Verwendung in diesem Schritt.
   10. Inkubieren für 15 min bei 4 ° C unter Rühren.
   11. Um die Vernetzungsreaktion zu löschen, 500 & mgr; l of IP Waschpuffer, ergänzt mit genügend Tris-Cl pH 7,4 Lager 25 mM Tris-Cl zu erreichen. Die freien Aminogruppen in Tris erfassen nicht umgesetzten DSS.
   12. Zentrifuge bei 11.000 g für 20 sec IP-Perlen zu sammeln und Überstand verwerfen.
   13. Resuspendieren IP-Perlen in 30 ul Puffer Laemmli reduzieren.
   14. Boil Proben 5 min bei 94 ° C.
   15. Optional analysieren Proben in einem Gamma-Zähler des Protokolls Hersteller.
2. Probenanalyse
   1. Gegenstand Proben einer SDS-PAGE denaturieren. Verwenden Sie Polyacrylamid auf der entsprechenden Prozentsatz für die Masse des Rezeptors und führen Gel unter Standardverfahren.
   2. Tauchen Gel in Fixierlösung (siehe Tabelle 1) für 30 min bei RT.
   3. Waschen Sie Gel mit destilliertem Wasser 15 min.
   4. Setzen Sie Gel in vorher hydratisiert Filterpapier und Deckel mit Saran Wrap Folie.
   5. Trockenen Gels bei 80 ° C für 1 Stunde.
   6. Expose Gel auf einem weißen Phosporimager screen bei RT O / N.
   7. Scan ausgesetzt Bildschirm mit einem Phosporimager mit Protokoll des Herstellers.

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Ergebnisse

Figur 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis mit AFLIP erhalten. Die Signale in Spur 1 kommen aus dem ¹²⁵ I-Ligand kovalent an entweder der Zebrabärbling Betaglycan Core - Protein (BG Kern unterhalb der 150 kDa - Marker) verknüpft oder dem BG Kern, der zu seiner Proteoglykan Form verarbeitet wurde , durch Anbringung von Glykosaminoglykanen (GAG, Abstrich im Bereich von 170 kDa an die Spitze des Gels). Dieses Muster der Migration, ein scharfer Core - Protein p...

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Diskussion

Die Verwendung von Western - Blots mit einem spezifischen Antikörper gegen ein Protein von Interesse ist ein wertvolles Instrument zum Ausdruck ⁷ während der Embryonalentwicklung zu studieren. Jedoch Immunoblotting hoch glycosylierten Proteinen war nicht sehr erfolgreich gewesen aufgrund ihrer ineffizienten Übertragung und eine schwache Bindung an Nitrocellulose oder PVDF Membranen ^8,9.

Proteoglykane sind ein gutes Beispiel für dieses Manko, die aufgrund ihrer koval...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix