Detección de afinidad etiquetado Endógeno receptores de embriones de pez cebra

Resumen

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Resumen

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-β receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate ¹²⁵I-TGF-β2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

Introducción

Specific detection of proteins expressed during embryonic development is required to validate expression profiles obtained by measuring their cognate mRNAs with RT-PCR or in situ hybridization (ISH). This is commonly achieved by a western blot of embryo extracts followed by detection with specific antibodies. However, this approach is hard to apply to proteins that are in very low abundance, or that have properties that hamper their quantitative transfer during their blotting. Betaglycan, also known as the type III transforming growth factor β (TGF-β) receptor (TGFBR3), is an example of these difficulties. TGFBR3 is a part time membrane proteoglycan that binds TGF-β through its core protein¹, with notably higher affinity for the isoform TGF-β2, a property that distinguishes it from any other TGF-β binding protein². TGFBR3 in the zebrafish is expressed from 8 hpf on, reaching a maximum by 72 hpf, as detected by RT-PCR of its mRNA³.

However, despite the availability of a very specific antibody³, every attempt to detect its translated product by western blot proved unsuccessful. Reckoning that TGFBR3's proteoglycan nature, as well as putative low abundance may be accountable for this failure, a detection method, AFLIP, which takes advantage of TGFBR3 high affinity for TGF-β2 was devised. In this method a protein extract from pooled embryos is allowed to specifically bind ¹²⁵I-labeled TGF-β2 and the receptor-ligand complexes are purified by immunoprecipitation and cross-linked before separation by SDS-PAGE. The migration patterns observed by autoradiography of the gels revealed the presence and nature of the labeled receptor species. This approach combines the ligand specificity of affinity labeling with immunoprecipitation by specific antibodies, increasing detection range, avoiding the inefficient transfer blotting of TGFBR3. Due to its inherent properties, the AFLIP assay is not a quantitative assay but can be used to confidently gauge relative experimental differences in the analyzed receptor.

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Protocolo

Todos los experimentos llevados a cabo en animales fueron aprobados por el Comité para el Laboratorio de Cuidado y Uso de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) Animal, bajo el número CICUAL-Protocolo: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México").

1. Preparación de extracto de proteína de embriones

1. Recoger 100 - 200 embriones para cada condición de comparar (morphants vs tipo salvaje) en la etapa deseada, por ejemplo, 72 h después de la fecundación (HPF).
2. Coloque los embriones en placas de Petri que contienen los peces de agua (ver Tabla 1) y dechorionate manualmente embriones utilizando unas pinzas de punta fina. Evitar el uso de pronasa durante este paso (o cualquier otra proteasa durante todo el protocolo), ya que puede digerir el receptor diana.
3. Coloque los embriones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se lavan los embriones twhielo con solución tampón de fosfato 1x (PBS) (véase la Tabla 1).
4. Añadir 500 l de tampón deyolk (ver Tabla 1).
5. Liberar la mayor parte de la yema pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo (aproximadamente 30 - 40 veces) los embriones en la solución. Para el 72 y 48 HPF embriones HPF utilizar azul y amarillo, puntas de pipeta, respectivamente. puntas amarillas puede ser necesario cortar un poco para evitar la destrucción de embriones. La liberación de yema de éxito se puede verificar mediante la observación de los embriones bajo el microscopio.
6. Recoger los embriones por centrifugación a 600 xg durante 15 seg.
7. Desechar el sobrenadante con cuidado utilizando una pipeta.
8. Lavado de embriones dos veces con 500 l de tampón de lavado (ver Tabla 1) por agitación suave a la velocidad más baja.
9. Recoger los embriones por centrifugación a 600 xg durante 15 seg.
10. A partir de aquí, continuar con el procedimiento a 4 ° C.
11. Desechar el sobrenadante con cuidado utilizando una pipeta.
12. embriones resuspender en 350 l de tampón de lisis (véase la Tabla 1) y homogeneizar usando una mano de mortero de plástico.
13. Incubar los embriones lisadas 30 min con agitación en un agitador tubo de ensayo a 4 ° C.
14. Centrifugar lisaron embriones a 11.000 xg durante 15 min con el fin de eliminar los residuos insolubles.
15. Transferencia aclaró sobrenadante usando una pipeta a un tubo nuevo.
16. Determinación de proteínas totales mediante el ensayo de proteínas de Bradford ^4, u otro procedimiento adecuado. Si se utiliza el ensayo de Bradford, lleve a cabo la curva de calibración en presencia de concentraciones equivalentes de los detergentes presentes en el tampón de lisis, ya que provocan una subestimación de la proteína estándar ^4.

2. Detección de proteína endógena Receptor

1. Etiquetado de afinidad e inmunoprecipitación (todos estos pasos a 4 ^° C)
   1. Coloque 400-500 g de proteína total de embriones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y diluir a 1 g / l con tampón 1 (ver Tabla 1).
      Nota: Con el fin de obtener 500 g de proteína total del embrión, a unos 100 - 200 embriones deben ser procesados ​​inicialmente. 72 HPF embriones producen rutinariamente ~ 5 g de proteína embrión total, que es suficiente para la detección betaglicano.
   2. Añadir suficiente volumen de TGF-β2 etiqueta de valores para alcanzar una concentración final de 150 pM y se incuba con agitación en un tubo de ensayo basculante 2 horas a 4 ° C. TGF-β2 debe ser etiquetado antes de iniciar AFLIP, con ¹²⁵ I por el método de la cloramina T como se describe por Cheifetz et al. ^5.
      PRECAUCIÓN: El uso de blindaje para minimizar la exposición durante la manipulación marcado ^{con 125I} ligando.
   3. Añadir suficiente volumen de anticuerpo sin diluir contra el receptor de interés con el fin de llegar a una dilución de 1: 100 y continuar la incubación durante otras 2 horas a 4 ° C (incubación puede ser O / N). Esta es la dilución óptima de antisuero # 31, que se utiliza en este estudio y descrito en otra parte ^3, pero dependiendo de la calidad de la unatibody, una dilución mayor o menor puede ser la óptima.
   4. Añadir 50 l de perlas de unión a inmunoglobulina adecuado (por ejemplo, la proteína G-Sepharose, que se equilibró previamente en RTFP y se resuspendió 1: 5 de su volumen original en RTFP) e incubar durante 50 min con agitación en un agitador tubo de ensayo a 4 ° DO.
   5. Recuperar las cuentas por microcentrifugación a 11.000 xg durante 20 seg.
   6. Desechar el sobrenadante en un recipiente de basura radiactiva adecuada.
   7. Se lavan las IP-cuentas tres veces con 1 ml de tampón de lavado IP (ver Tabla 1), por agitación e microcentrifugación a 11.000 xg durante 20 segundos cada vez.
   8. Resuspender IP-perlas en 250 l de tampón de lavado IP.
   9. Añadir 1,5 l de suberato de disuccinimidilo (DSS, se disolvió en DMSO a 10 mg / ml). Preparar la solución de DSS justo antes de su uso en esta etapa.
   10. Incubar durante 15 min a 4 ° C con agitación.
   11. Con el fin de detener la reacción de reticulación, añadir 500 l Otampón de lavado f IP, suplementado con suficiente Tris-Cl pH 7,4 de stock para llegar a 25 mM Tris-Cl. Los grupos amino libres en Tris capturan DSS no reaccionado.
   12. Se centrifuga a 11.000 xg durante 20 segundos para recoger IP-cuentas y desechar el sobrenadante.
   13. Resuspender IP-perlas en 30 l de tampón reductor Laemmli.
   14. Hervir las muestras de 5 min a 94 ° C.
   15. Opcionalmente, el análisis de muestras en un contador gamma utilizando el protocolo del fabricante.
2. Análisis de las muestras
   1. Las muestras sometidas a desnaturalización SDS-PAGE. Utilice poliacrilamida en el porcentaje adecuado para la masa del receptor y ejecutar gel bajo procedimiento estándar.
   2. Sumergir gel en solución de fijación (véase la Tabla 1) durante 30 min a TA.
   3. Lavar gel con agua destilada durante 15 min.
   4. Coloque gel en papel de filtro previamente hidratado y cubrir con papel film película.
   5. gel seco a 80 ° C durante 1 hr.
   6. Exponer en gel en una scre PhosphorImager blancoa temperatura ambiente en O / N.
   7. Analiza pantalla expuesta mediante un PhosphorImager usando el protocolo del fabricante.

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Resultados

La Figura 1 muestra un resultado representativo obtenido con AFLIP. Las señales en el carril 1 provienen de la I-ligando ¹²⁵ covalentemente ya sea a la proteína de pez cebra betaglicano núcleo (BG núcleo, por debajo del marcador de 150 kDa) o el núcleo de BG que ha sido procesada a su forma de proteoglicanos mediante la unión de los glicosaminoglicanos (GAG, frotis que van desde 170 kDa a la parte superior del gel). Este patrón de migración, una prote?...

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Discusión

El uso de transferencias de Western con un anticuerpo específico contra una proteína de interés es una herramienta valiosa para estudiar su expresión durante la embriogénesis ^7. Sin embargo, la inmunotransferencia de proteínas altamente glicosiladas no ha sido muy exitoso debido a su transferencia ineficiente y débil unión a nitrocelulosa o PVDF membranas ^8,9.

Los proteoglicanos son un buen ejemplo de este inconveniente, debido a sus cadenas de glicosaminoglican...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix