איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

Summary

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Abstract

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-β receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate ¹²⁵I-TGF-β2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

Introduction

Specific detection of proteins expressed during embryonic development is required to validate expression profiles obtained by measuring their cognate mRNAs with RT-PCR or in situ hybridization (ISH). This is commonly achieved by a western blot of embryo extracts followed by detection with specific antibodies. However, this approach is hard to apply to proteins that are in very low abundance, or that have properties that hamper their quantitative transfer during their blotting. Betaglycan, also known as the type III transforming growth factor β (TGF-β) receptor (TGFBR3), is an example of these difficulties. TGFBR3 is a part time membrane proteoglycan that binds TGF-β through its core protein¹, with notably higher affinity for the isoform TGF-β2, a property that distinguishes it from any other TGF-β binding protein². TGFBR3 in the zebrafish is expressed from 8 hpf on, reaching a maximum by 72 hpf, as detected by RT-PCR of its mRNA³.

However, despite the availability of a very specific antibody³, every attempt to detect its translated product by western blot proved unsuccessful. Reckoning that TGFBR3's proteoglycan nature, as well as putative low abundance may be accountable for this failure, a detection method, AFLIP, which takes advantage of TGFBR3 high affinity for TGF-β2 was devised. In this method a protein extract from pooled embryos is allowed to specifically bind ¹²⁵I-labeled TGF-β2 and the receptor-ligand complexes are purified by immunoprecipitation and cross-linked before separation by SDS-PAGE. The migration patterns observed by autoradiography of the gels revealed the presence and nature of the labeled receptor species. This approach combines the ligand specificity of affinity labeling with immunoprecipitation by specific antibodies, increasing detection range, avoiding the inefficient transfer blotting of TGFBR3. Due to its inherent properties, the AFLIP assay is not a quantitative assay but can be used to confidently gauge relative experimental differences in the analyzed receptor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים שבוצעו בחיות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים במעבדה ושימוש של האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו (UNAM), תחת מספר CICUAL-Protocol: FLC40-14. (CICUAL: "פסקה Comité Institucional אל Cuidado y שימוש עכשווי de los Animales דה Laboratorio del Instituto de Celular Fisiologìa, México Universidad de הלאומית האוטונומית").

1. הכנת תמצית חלבון העובר

1. אסוף 100 - 200 עובריים עבור כל תנאים להשוות (morphants לעומת סוג בר) בשלב רצוי עבור שלאחר הפריה למשל 72 שעות (hpf).
2. עוברת מקום צלחות פטרי המכילות מי דגים (ראה טבלה 1) באופן ידני dechorionate עובר באמצעות קנס שקצו מלקחיים. הימנע משימוש pronase במהלך שלב זה (או כל פרוטאז אחר ברחבי לפרוטוקול) כפי שהוא עשוי לעכל את הקולטן הממוקד.
3. עוברים מקום בתוך שפופרת 1.5 מ"ל microfuge ולשטוף עוברים twקרח עם פתרון חיץ פוספט 1x (PBS) (ראו טבלה 1).
4. הוסף 500 μl של חיץ deyolk (ראה טבלה 1).
5. שחרר ביותר של חלמון ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה (כ -30 - 40 פעמים) את העוברים בתמיסה. במשך 72 hpf ו -48 עובר hpf להשתמש טיפי פיפטה כחולים וצהובים, בהתאמה. טיפים צהובים ייתכן שיהיו צורך לחתוך מעט כדי למנוע השמדה עוברת. מהדורת החלמון המוצלחת יכולה להיבדק על ידי התבוננות עוברים תחת מיקרוסקופ.
6. איסוף עוברים על ידי צנטריפוגה ב 600 XG במשך 15 שניות.
7. בטל supernatant בזהירות באמצעות pipet.
8. לשטוף עוברים פעמיים עם 500 חיץ כביסה μl (ראה טבלה 1) על ידי vortexing בעדינות במהירות הנמוכה ביותר.
9. איסוף עוברים על ידי צנטריפוגה ב 600 XG במשך 15 שניות.
10. החל מכאן, להמשיך את ההליך ב 4 ° C..
11. בטל supernatant בזהירות באמצעות pipet.
12. עוברים Resuspend ב 350 μl של חיץ תמוגה (ראה טבלה 1) ו homogenize באמצעות עלי פלסטיק.
13. דגירה עוברים lysed 30 דקות עם תסיסה על כיסא נדנדה מבחנה ב 4 מעלות צלזיוס.
14. צנטריפוגה lysed העוברת על 11,000 XG במשך 15 דקות על מנת להסיר שאריות מסיסות.
15. העברת פינת supernatant באמצעות pipet לצינור טרי.
16. לקבוע חלבון הכולל ידי השיטה ברדפורד ^4, או הליך מתאים אחר. אם assay ברדפורד משמש, לבצע את עקומת הכיול בנוכחות ריכוזים המקבילים של המתנות דטרגנטים במאגר תמוגה, כפי שהן גורמות הערכה נמוכה מדי של החלבון ⁴ הסטנדרטי.

2. איתור של חלבון קולטן אנדוגני

1. זיקה סימון Immunoprecipitation (כל השלבים הבאים ב 4 ^מעלות צלסיוס)
   1. מניחים 400 - 500 מיקרוגרם של חלבון העובר סך צינור 1.5 מ"ל microfuge לדלל עד 1 מיקרוגרם / μl עם חיץ 1 (ראה טבלה 1).
      הערה: על מנת לקבל 500 מיקרוגרם של חלבון העובר בסך הכל, כ 100 - 200 עוברים חייבים להיות מעובד בתחילה. 72 hpf עוברים באופן שגרתי להניב ~ 5 מיקרוגרם של חלבון העובר הכולל, וזה מספיק לגילוי betaglycan.
   2. הוספת נפח מספיק של מניות TGF-β2 שכותרתו להגיע לריכוז סופי של 150 בערב, דגירה עם תסיסה על hr נדנדה 2 מבחנה ב 4 מעלות צלזיוס. חייב להיות מתויג TGF-β2 לפני AFLIP הוא התחיל, עם ¹²⁵ ואני בשיטת T chloramine כפי שתואר על ידי Cheifetz et al. ^5.
      זהירות: השתמש מגן כדי לצמצם את החשיפה תוך טיפול ¹²⁵ ואני שכותרתו ליגנד.
   3. הוספת נפח מספיק של נוגדן חי נגד הקולטן של עניין על מנת להגיע דילול 1: 100 ולהמשיך דגירה של עוד 2 שעות ב 4 ° C (דגירה יכולה להיות O / N). זהו דילול אופטימלי של antiserum # 31, ששימשו במחקר זה מתואר במקומות אחרים ^3, אבל תלוי באיכות שלtibody, דילול גדול יותר או קטן יותר עשוי להיות אופטימלי.
   4. הוסף 50 μl של חרוזים מחייבים אימונוגלובולינים מתאימים (למשל, G- חלבון-Sepharose, אשר היה equilibrated בעבר TNTE ו resuspended 1: 5 של נפח המקורי TNTE) דגירה במשך 50 דקות עם תסיסה על כיסא נדנדת מבחנה ב 4 ° ג
   5. לשחזר את החרוזים על ידי microcentrifugation ב 11,000 XG במשך 20 שניות.
   6. בטל supernatant במיכל אשפה רדיואקטיבית המתאימה.
   7. לשטוף שלוש פעמים-חרוזים IP עם 1 מ"ל של חיץ לשטוף IP (ראו טבלה 1), על ידי vortexing ו microcentrifugation ב 11,000 XG במשך 20 שניות בכל פעם.
   8. Resuspend IP-החרוזים 250 μl של חיץ לשטוף IP.
   9. הוסף 1.5 μl של disuccinimidyl suberate (DSS, מומס DMSO ב 10 מ"ג / מ"ל). הכן את פתרון DSS רק לפני השימוש בו בשלב זה.
   10. דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C עם תסיסה.
   11. כדי להרוות את התגובה crosslinking, להוסיף 500 μl of IP לשטוף חיץ, השלימו עם מספיק טריס-Cl-pH 7.4 המניה להגיע 25 מ"מ טריס-Cl. הקבוצות אמינו חופשיות ב טריס ללכוד DSS unreacted.
   12. צנטריפוגה ב 11,000 XG במשך 20 שניות כדי לאסוף IP-חרוזים להשליך supernatant.
   13. Resuspend IP-החרוזים 30 μl של צמצום מאגר Laemmli.
   14. מרתיח דגימות 5 דקות ב 94 מעלות צלזיוס.
   15. לחלופין, לנתח דגימות דלפק גמא באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
2. ניתוח מדגם
   1. דגימות בכפוף denaturing SDS-PAGE. השתמש polyacrylamide על האחוז המתאים המסה של הקולט ולהפעיל ג'ל תחת הליך רגיל.
   2. לטבול ג'ל בתמיסה מקבעת (ראה טבלה 1) במשך 30 דקות ב RT.
   3. לשטוף ג'ל עם מים distillated במשך 15 דקות.
   4. מניחים ג'ל בנייר מסנן hydrated בעבר ומכסים בניילון נצמד הסרט.
   5. ג'ל ניקוי על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
   6. לחשוף ג'ל על scre phosphorimager לבןen ב RT O / N.
   7. סרוק מסך חשוף באמצעות phosphorimager באמצעות הפרוטוקול של היצרן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 1 מציג תוצאה נציג שהושג עם AFLIP. אותות ליין 1 באים ¹²⁵ ליגנד קשרו קוולנטית או חלבון ליבת betaglycan דג הזברה (ליבת BG, מתחת 150 בסמן KDA) או בליבתו BG כי תעובד לצורת proteoglycan שלה על ידי התקשרות של glycosaminoglycans (GAG, למרוח החל 170 kDa לחלק העליון של הג'ל). דפ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השימוש כתם המערבי עם נוגדן ספציפי נגד חלבון של עניין הוא כלי רב ערך כדי ללמוד את ביטוייה ⁷ במהלך embryogenesis. עם זאת, immunoblotting של חלבונים הפערים glycosylated לא היה מוצלח מאוד בשל העברתם יעיל מחייב חלש ממברנות nitrocellulose או PVDF ^8,9.

Proteogl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix