Аффинное мечение Обнаружение эндогенного Рецепторы из эмбрионов данио рерио

Резюме

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Аннотация

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-β receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate ¹²⁵I-TGF-β2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

Введение

Specific detection of proteins expressed during embryonic development is required to validate expression profiles obtained by measuring their cognate mRNAs with RT-PCR or in situ hybridization (ISH). This is commonly achieved by a western blot of embryo extracts followed by detection with specific antibodies. However, this approach is hard to apply to proteins that are in very low abundance, or that have properties that hamper their quantitative transfer during their blotting. Betaglycan, also known as the type III transforming growth factor β (TGF-β) receptor (TGFBR3), is an example of these difficulties. TGFBR3 is a part time membrane proteoglycan that binds TGF-β through its core protein¹, with notably higher affinity for the isoform TGF-β2, a property that distinguishes it from any other TGF-β binding protein². TGFBR3 in the zebrafish is expressed from 8 hpf on, reaching a maximum by 72 hpf, as detected by RT-PCR of its mRNA³.

However, despite the availability of a very specific antibody³, every attempt to detect its translated product by western blot proved unsuccessful. Reckoning that TGFBR3's proteoglycan nature, as well as putative low abundance may be accountable for this failure, a detection method, AFLIP, which takes advantage of TGFBR3 high affinity for TGF-β2 was devised. In this method a protein extract from pooled embryos is allowed to specifically bind ¹²⁵I-labeled TGF-β2 and the receptor-ligand complexes are purified by immunoprecipitation and cross-linked before separation by SDS-PAGE. The migration patterns observed by autoradiography of the gels revealed the presence and nature of the labeled receptor species. This approach combines the ligand specificity of affinity labeling with immunoprecipitation by specific antibodies, increasing detection range, avoiding the inefficient transfer blotting of TGFBR3. Due to its inherent properties, the AFLIP assay is not a quantitative assay but can be used to confidently gauge relative experimental differences in the analyzed receptor.

протокол

Все эксперименты, проведенные на животных были одобрены Комитетом по лабораторному уходу и использованию автономного национального университета Мексики (УНАМ) животного происхождения, под номером CICUAL-протокола: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional пункт эль Cuidado у Uso-де-лос-Animales де Laboratorio дель Instituto де Fisiologìa Celular, Национальный автономный университет Мехико").

1. Получение экстракта Эмбрион белка

1. Собирают 100 - 200 эмбрионов для каждого условия для сравнения (морфанты против дикого типа) на желаемой стадии, например, 72 часов после оплодотворения (HPF).
2. Место эмбрионов в чашки Петри , содержащие воду рыбы (см таблицу 1) и вручную dechorionate эмбрионов с помощью остроконечного пинцета. Не следует использовать проназу во время этого шага (или любой другой протеазы по всему протоколу), поскольку она может переваривать целевой рецептор.
3. Место эмбрионов в 1,5 мл пробирке с и мыть эмбрионов Twлед с раствором 1x фосфатного буфера (PBS) (таблица 1).
4. Добавьте 500 мкл буфера deyolk (таблица 1).
5. Выпуск большинство желтка, осторожно пипеткой вверх и вниз (около 30 - 40 раз) эмбрионов в растворе. Для 72 и 48 часов после оплодотворения эмбрионов HPF используют синие и желтые наконечники пипеток, соответственно. Желтые советы, возможно, должны быть немного сократить, чтобы избежать уничтожения эмбрионов. Успешный выпуск желток может быть проверена путем наблюдения эмбрионов под микроскопом.
6. Сбор эмбрионов путем центрифугирования при 600 мкг в течение 15 сек.
7. Удалите супернатант осторожно с помощью пипетки.
8. Вымойте эмбрионов в два раза с 500 мкл буфера для промывки (таблица 1), осторожно встряхивая на самой низкой скорости.
9. Сбор эмбрионов путем центрифугирования при 600 мкг в течение 15 сек.
10. Начиная отсюда, продолжить процедуру при температуре 4 ° С.
11. Удалите супернатант осторожно с помощью пипетки.
12. Ресуспендируют эмбрионов в 350 мкл буфера для лизиса (Таблица 1) и гомогенизируют с помощью пластикового пестика.
13. Выдержите лизируют эмбрионов через 30 мин при перемешивании на качалке пробирке при 4 ° С.
14. Центрифуга лизируют эмбрионов при 11000 х г в течение 15 мин, чтобы удалить нерастворимые твердые частицы.
15. Передача очищается супернатанта с помощью пипетки в свежую пробирку.
16. Определить общий белок по Бредфорда белка ^4, или другой подходящей процедурой. Если Бредфорда используется, выполняют калибровочную кривую в присутствии эквивалентных концентраций детергентов подарков в буфере для лизиса, так как они вызывают недооценку белка стандартного ^4.

2. Обнаружение эндогенного белка рецептора

1. Аффинное мечение и иммунопреципитация (все эти шаги при 4 ^° С)
   1. Поместите 400 - 500 мкг общего белка эмбрионов в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и разбавляют до 1 мкг / мкл буфера 1 (таблица 1).
      Примечание: Для того чтобы получить 500 мкг общего белка эмбрионов, около 100 - 200 эмбрионов должны быть первоначально обработаны. 72 HPF эмбрионов обычно дают ~ 5 мкг общего белка эмбриона, который является достаточным для обнаружения betaglycan.
   2. Добавьте достаточный объем меченого TGF-бета 2 запаса для достижения конечной концентрации 150 мкМ и инкубировать при перемешивании на пробирке качающегося 2 ч при 4 ° С. TGF-β2 должны быть помечены перед запуском AFLIP, с ¹²⁵ I с помощью метода хлорамина Т , как описано Cheifetz и др. ^5.
      ВНИМАНИЕ: Используйте экранирование для минимизации воздействия при обращении с ¹²⁵ I меченый лиганд.
   3. Добавьте достаточно объема неразбавленного антител против рецептора интереса для того, чтобы достичь разведение 1: 100 и продолжают инкубацию еще в течение 2 ч при 4 ° С (инкубационный может быть O / N). Это оптимальное разведение антисыворотки # 31, используемый в данном исследовании , и описано в другом месте ^3, но в зависимости от качества апtibody, большее или меньшее разбавления может быть оптимальным.
   4. Добавляют 50 мкл подходящей иммуноглобулина связывания гранул (например, G-белок-сефарозой, которая была предварительно уравновешенную в TNTE и ресуспендировали 1: 5 своего первоначального объема в TNTE) и инкубировать в течение 50 мин при перемешивании на качалке пробирке при 4 ° C.
   5. Восстановить бусы микроцентрифугированием при 11000 мкг в течение 20 сек.
   6. Удалите супернатант в соответствующем контейнере радиоактивного хлама.
   7. Вымойте IP - бусинок три раза с 1 мл промывочного буфера IP (см таблицу 1), путем встряхивания и микроцентрифугированием при 11000 мкг в течение 20 секунд каждый раз.
   8. Ресуспендируют IP-бусины в 250 мкл буфера IP промывной.
   9. Добавить 1,5 мкл дисукцинимидилсуберат (DSS, растворенного в ДМСО с концентрацией 10 мг / мл). Приготовьте раствор DSS как раз перед его использованием в этом шаге.
   10. Инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С при перемешивании.
   11. Для того, чтобы погасить реакцию сшивания, добавляют 500 мкл Oе IP промывочный буфер, с добавлением достаточно Трис-Cl рН 7,4 запаса достигнет 25 мМ Трис-Cl. Свободные аминогруппы в Трис захвата непрореагировавший DSS.
   12. Центрифуга при 11000 мкг в течение 20 секунд, чтобы собрать IP-шарики и отбросить супернатант.
   13. Ресуспендируют IP-бусины в 30 мкл буфера снижения Laemmli.
   14. Варить образцы 5 мин при 94 ° С.
   15. Необязательно проводить анализ проб в гамма-счетчике с использованием протокола производителя.
2. Анализ проб
   1. Предметные образцы денатурирующих SDS-PAGE. Использование полиакриламида на соответствующий процент по массе рецептора и гель-под стандартной процедурой.
   2. Погружают гель в Фиксирующий раствор (таблица 1) в течение 30 мин при комнатной температуре.
   3. Вымойте гель с дистиллированной водой в течение 15 мин.
   4. Поместите гель в предварительно гидратированных фильтровальную бумагу и накрыть Саран оберточной пленкой.
   5. Сухой гель при 80 ° С в течение 1 часа.
   6. Expose гель на белом Phosphorimager Screан при RT O / N.
   7. Сканирование подвергается экран с помощью Phosphorimager с использованием протокола производителя.

Результаты

На рисунке 1 показана репрезентативная результат , полученный с AFLIP. Сигналы в Дорожка 1 поступают из ¹²⁵ I-лиганд , ковалентно связанный либо с данио betaglycan корового белка (сердечник BG, ниже 150 кДа маркер) или ядро BG, которое было обработано в его протеогликан?...

Обсуждение

Использование Вестерн - блоттинга со специфическим антителом против представляющего интерес белка является ценным инструментом для изучения его экспрессии ⁷ во время эмбриогенеза. Тем не менее, иммуно высоко гликозилированных белков не был очень успешным из - за их неэффективно...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix