Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

Özet

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Özet

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-β receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate ¹²⁵I-TGF-β2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

Giriş

Specific detection of proteins expressed during embryonic development is required to validate expression profiles obtained by measuring their cognate mRNAs with RT-PCR or in situ hybridization (ISH). This is commonly achieved by a western blot of embryo extracts followed by detection with specific antibodies. However, this approach is hard to apply to proteins that are in very low abundance, or that have properties that hamper their quantitative transfer during their blotting. Betaglycan, also known as the type III transforming growth factor β (TGF-β) receptor (TGFBR3), is an example of these difficulties. TGFBR3 is a part time membrane proteoglycan that binds TGF-β through its core protein¹, with notably higher affinity for the isoform TGF-β2, a property that distinguishes it from any other TGF-β binding protein². TGFBR3 in the zebrafish is expressed from 8 hpf on, reaching a maximum by 72 hpf, as detected by RT-PCR of its mRNA³.

However, despite the availability of a very specific antibody³, every attempt to detect its translated product by western blot proved unsuccessful. Reckoning that TGFBR3's proteoglycan nature, as well as putative low abundance may be accountable for this failure, a detection method, AFLIP, which takes advantage of TGFBR3 high affinity for TGF-β2 was devised. In this method a protein extract from pooled embryos is allowed to specifically bind ¹²⁵I-labeled TGF-β2 and the receptor-ligand complexes are purified by immunoprecipitation and cross-linked before separation by SDS-PAGE. The migration patterns observed by autoradiography of the gels revealed the presence and nature of the labeled receptor species. This approach combines the ligand specificity of affinity labeling with immunoprecipitation by specific antibodies, increasing detection range, avoiding the inefficient transfer blotting of TGFBR3. Due to its inherent properties, the AFLIP assay is not a quantitative assay but can be used to confidently gauge relative experimental differences in the analyzed receptor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvanlarda yürütülen tüm deneyler CICUAL-Protokol numarası altında, Laboratuar Hayvanları Bakım ve México Özerk Ulusal Üniversitesi (UNAM) Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fizyoloji Celular, Universidad Nacional Autonoma de México").

Embriyo Protein Özü 1. Hazırlık

1. Her koşul örneği 72 saat sonra döllenme (hpf) için, istenilen aşamada (morphants vs yabani tip) karşılaştırmak için 200 embriyolar - 100 toplayın.
2. Balık su içeren Petri yerleştirin embriyolar (Tablo 1) ve elle ince uçlu forseps kullanarak embriyolar dechorionate. hedeflenen reseptör sindirmek olabilir bu aşamada (ya da protokol boyunca başka herhangi bir proteaz) sırasında pronase kullanmaktan kaçının.
3. 1.5 ml mikrofuge'de tüp yerleştirin embriyolar ve embriyo tw yıkama1x Fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile buz (Tablo 1 e bakınız).
4. Deyolk tampon 500 ul ekle (Tablo 1 e bakınız).
5. (- 40 kez yaklaşık 30) çözelti içinde embriyolar yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme sarısı en bırakın. 72 hpf ve 48 hpf embriyolar için sırasıyla mavi ve sarı pipet uçları kullanın. Sarı ipuçları biraz embriyoların yok önlemek için kesmek gerekebilir. Başarılı sarısı bırakma mikroskop altında embriyoların gözlemleyerek kontrol edilebilir.
6. 15 saniye boyunca 600 x g'de santrifüj ile embriyolar toplayın.
7. Bir pipet kullanarak dikkatlice süpernatant atın.
8. Yıkama embriyolar iki kez 500 ul yıkama tamponu ile hafifçe düşük hızda karıştırın (Tablo 1 e bakınız).
9. 15 saniye boyunca 600 x g'de santrifüj ile embriyolar toplayın.
10. Buradan itibaren, 4 ° C'de prosedürü devam etmektedir.
11. Bir pipet kullanarak dikkatlice süpernatant atın.
12. lizis tamponu 350 ul süspanse embriyolar (Tablo 1 'e bakınız) ve plastik bir havan tokmağı kullanılarak homojen hale getirilir.
13. 4 ° C de bir test tüpü rocker lize embriyolar çalkalama ile 30 dakika kuluçkalayın.
14. Santrifüj çözünmeyen artık çıkarmak için 15 dakika 11,000 x g'de embriyolar parçalanmıştır.
15. Transferi yeni bir tüp bir pipet kullanarak süpernatant temizledi.
16. Bradford protein deneyi ⁴ veya başka bir uygun yöntem vasıtasıyla, toplam protein belirler. Bradford tahlili kullanıldığında, bunlar ⁴ Standart proteinin tahmin edilmesine neden olarak, liziz tamponunda deterjanlar sunar eşdeğer konsantrasyonlarının varlığında kalibrasyon eğrisi gerçekleştirin.

2. Tespit Endojen Reseptör Protein

1. Affinity Etiketleme ve Immunoprecipitation (bütün bu adımlar 4 ^o C'de)
   1. 1.5 ml mikrofuge'de tüp içinde toplam embriyo protein, 500 mg ve tamponu 1 (bakınız Tablo 1) ile 1 mcg / ul sulandırmak - 400 yerleştirin.
      Not: yaklaşık 100 toplam embriyo proteinin 500 ug elde etmek için - 200 embriyo ilk işlenmelidir. 72 HPF embriyolar rutin Betaglikan tarama için yeterli olana toplam embriyo proteininin ~ 5 ug verim.
   2. 150 pM'lik bir nihai konsantrasyon elde edildi ve 4 ° C 'de, bir test tüpü külbütör 2 saat ajitasyonla inkübasyona etiketli TGF-β2 stokunun yeterli hacim. AFLIP başlatılmadan önce Cheifetz ve ark., ⁵ ile tarif edildiği gibi, TGF-β2 kloramin T yöntemiyle ^125I ile etiketlenmesi gerekir.
      DİKKAT: Ben ligand etiketli ¹²⁵ taşıma sırasında maruziyeti en aza indirmek için koruyucu.
   3. 100 seyreltme ve (kuluçka O / N olabilir), 4 ° C'de başka bir 2 saat daha inkübasyona devam: 1 ulaşmak için ilgi alıcısına karşı seyreltilmemiş antikorun yeterli hacim. Bu, bu çalışmada kullanılan ve başka bir yerde tarif edilen ^3, ama kalitesine bağlı olarak, antiserum # 31 optimal dilüsyonudurtibody daha büyük veya daha küçük bir seyreltme uygun olabilir.
   4. Uygun bir immünoglobulin bağlama, boncuk tanelerin 50 ul ekle (örneğin, daha önce TNTE içinde dengelenmiş 1 yeniden süspanse edildi, G-proteini-Sefaroz: TNTE orjinal hacminin 5) ve 4 ° bir test tüpü rocker çalkalama ile 50 dakika boyunca inkübe C.
   5. 20 saniye boyunca 11.000 xg mikrosantrifüj boncuk kurtarın.
   6. Uygun bir radyoaktif çöp konteyner içinde süpernatant atın.
   7. 20 saniye, her seferinde 11,000 xg, vorteks ve mikro santrifüjleme IP yıkama tamponu (bakınız Tablo 1) 1 ml IP boncuk üç kez yıkayın.
   8. Süspanse IP-boncuk, IP yıkama tamponu 250 ul.
   9. (10 mg / ml DMSO içinde çözülmüş DSS) disüksinimidil suberat 1.5 ul ekle. Sadece bu aşamada kullanılmadan önce DSS çözeltisi hazırlayın.
   10. çalkalama ile 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
   11. Çapraz bağlama reaksiyonu söndürmek için 500 ul o eklemeYeterince Tris-Cl, pH 7.4 stok ile desteklenmiş F IP yıkama tamponu, 25 mM Tris-Cl ulaşmak için. Tris serbest amino grupları reaksiyona girmemiş DSS yakalamak.
   12. 20 saniye boyunca 11.000 xg'de Santrifüj IP boncuk toplamak ve süpernatant atmak için.
   13. Süspanse IP boncuk Laemmli tamponu indirgeme 30 ul.
   14. Kaynama örnekleri 94 ° C 'de 5 dak.
   15. İsteğe bağlı olarak, imalatçının protokolü kullanılarak bir gamma sayacında örnekleri analiz eder.
2. numune Analizi
   1. SDS-PAGE denatüre Konu örnekler. reseptör kütlesi için uygun oranda poliakrilamid kullanın ve standart prosedür altında jel çalıştırın.
   2. Sabitleştirici çözeltide jel daldırın oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (bakınız Tablo 1).
   3. 15 dakika boyunca damıtılmış su ile jel yıkayın.
   4. Daha önce sulu filtre kağıdına jel yerleştirin ve Saran wrap film ile kaplayın.
   5. 1 saat boyunca 80 ° C'de kuru jeli.
   6. Beyaz Fosfor bağırıyorum üzerinde jel AçığaRT O / N en-.
   7. Üreticinin protokolü kullanılarak bir fosforimager kullanılarak maruz ekranı tarayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1, AFLIP ile elde edilen temsili bir sonuç göstermektedir. ¹²⁵ I-ligand gelen Lane 1 Sinyaller kovalent (150 kDa işaretleyici altında BG çekirdek) zebrabalıkları Betaglikan çekirdek protein veya glikozaminoglikan eki (GAG, smear tarafından proteoglikan forma işlendikten BG çekirdek ya bağlı ), 170 kDa, jelin en arasında değişmektedir. Göç Bu model, keskin çekirdek proteini ek olarak (nedeniyle GAG zincirlerinin uzunluğu heterojenliğ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Ilgi konusu bir proteinine karşı spesifik bir antikor ile Western lekeleri kullanımı embriyojenez sırasında ifadesini ⁷ incelemek için değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yüksek-glikosile proteinlerin immünoblot yetersizlikler nedeniyle transfer ve nitroselüloz ya da PVDF zarlarına ^8,9 zayıf bağlanma için çok başarılı olmamıştır.

Proteoglikanlar çünkü negatif yüklü ve polistiren yüzeyler veya hidrofobik lekeleme membranların ya iyi bağ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix