Affinity Étiquetage Détection de Endogène Receptors de Zebrafish Embryons

Résumé

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Résumé

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-β receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate ¹²⁵I-TGF-β2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

Introduction

Specific detection of proteins expressed during embryonic development is required to validate expression profiles obtained by measuring their cognate mRNAs with RT-PCR or in situ hybridization (ISH). This is commonly achieved by a western blot of embryo extracts followed by detection with specific antibodies. However, this approach is hard to apply to proteins that are in very low abundance, or that have properties that hamper their quantitative transfer during their blotting. Betaglycan, also known as the type III transforming growth factor β (TGF-β) receptor (TGFBR3), is an example of these difficulties. TGFBR3 is a part time membrane proteoglycan that binds TGF-β through its core protein¹, with notably higher affinity for the isoform TGF-β2, a property that distinguishes it from any other TGF-β binding protein². TGFBR3 in the zebrafish is expressed from 8 hpf on, reaching a maximum by 72 hpf, as detected by RT-PCR of its mRNA³.

However, despite the availability of a very specific antibody³, every attempt to detect its translated product by western blot proved unsuccessful. Reckoning that TGFBR3's proteoglycan nature, as well as putative low abundance may be accountable for this failure, a detection method, AFLIP, which takes advantage of TGFBR3 high affinity for TGF-β2 was devised. In this method a protein extract from pooled embryos is allowed to specifically bind ¹²⁵I-labeled TGF-β2 and the receptor-ligand complexes are purified by immunoprecipitation and cross-linked before separation by SDS-PAGE. The migration patterns observed by autoradiography of the gels revealed the presence and nature of the labeled receptor species. This approach combines the ligand specificity of affinity labeling with immunoprecipitation by specific antibodies, increasing detection range, avoiding the inefficient transfer blotting of TGFBR3. Due to its inherent properties, the AFLIP assay is not a quantitative assay but can be used to confidently gauge relative experimental differences in the analyzed receptor.

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Protocole

Toutes les expériences réalisées chez l'animal ont été approuvés par le Comité de laboratoire soin et l'utilisation de l'Université nationale autonome du Mexique (UNAM) des animaux, sous le numéro CICUAL-Protocole: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México").

1. Préparation de l'extrait Embryo Protein

1. Recueillir 100 - 200 embryons pour chaque condition de comparer (morphants vs type sauvage) au stade désiré, par exemple 72 heures après la fécondation (HPF).
2. La place des embryons dans des boîtes de Pétri contenant de l' eau de poissons (voir tableau 1) et dechorionate manuellement des embryons en utilisant une pince à pointe fine. Éviter d'utiliser pronase pendant cette étape (ou toute autre protéase tout au long du protocole), tel qu'il peut digérer le récepteur ciblé.
3. La place des embryons dans un tube de 1,5 ml et laver les embryons twla glace avec une solution tampon de phosphate de 1x (PBS) (voir tableau 1).
4. Ajouter 500 pi de tampon de deyolk (voir le tableau 1).
5. Relâchez la plupart de jaune par pipetage de haut en bas (environ 30 - 40 fois) les embryons dans la solution. Pour 72 HPF et 48 embryons HPF utiliser des embouts de pipette bleu et jaune, respectivement. peuvent devoir être légèrement coupé pour éviter la destruction d'embryons pointes jaunes. La libération de jaune réussie peut être vérifiée par l'observation des embryons au microscope.
6. Recueillir des embryons par centrifugation à 600 xg pendant 15 sec.
7. Rejeter le surnageant avec précaution à l'aide d'une pipette.
8. Embryons laver deux fois avec 500 pi de tampon de lavage (voir le tableau 1) faisant tourbillonner doucement à la vitesse la plus basse.
9. Recueillir des embryons par centrifugation à 600 xg pendant 15 sec.
10. A partir de là, poursuivre la procédure à 4 ° C.
11. Rejeter le surnageant avec précaution à l'aide d'une pipette.
12. Resuspendre les embryons dans 350 pi de tampon de lyse (voir le tableau 1) et homogénéiser à l' aide d' un pilon en plastique.
13. Incuber embryons lysées 30 min avec agitation sur une bascule de tube à essai à 4 ° C.
14. Centrifugeuse lysée embryons à 11.000 xg pendant 15 min pour éliminer les débris insolubles.
15. Transfert autorisé surnageant à l'aide d'une pipette dans un tube frais.
16. Déterminer la protéine totale par Bradford protéine test ^4, ou toute autre procédure appropriée. Si dosage de Bradford est utilisé, effectuer la courbe d'étalonnage en présence de concentrations équivalentes des détergents présents dans le tampon de lyse, car ils provoquent une sous - estimation de la protéine standard ^4.

2. Détection de Endogène Receptor Protein

1. Affinity Étiquetage et Immunoprécipitation (toutes ces étapes à 4 ^o C)
   1. Placez 400 - 500 ug de protéine embryonnaire totale dans un tube de 1,5 ml et diluer à 1 ug / ul avec un tampon 1 (voir le tableau 1).
      Remarque: Pour obtenir 500 ug de protéine d'embryon total, environ 100 - 200 embryons doivent être d'abord traitées. 72 HPF embryons produisent couramment ~ 5 pg de protéine totale d'embryons, ce qui est suffisant pour la détection bêtaglycan.
   2. Ajouter un volume suffisant de marqué TGF-β2 stocks pour atteindre une concentration finale de 150 pM et incuber avec agitation sur un tube à essai culbuteur 2 h à 4 ° C. Le TGF-β2 doit être marqué avant aflip est démarré, avec ^125I par la méthode à la chloramine T comme décrit par Cheifetz et al. , ^5.
      ATTENTION: L' utilisation de blindage pour minimiser l' exposition lors de la manipulation ¹²⁵ I ligand marqué.
   3. Ajouter un volume suffisant d'anticorps non dilué contre le récepteur d'intérêt afin de parvenir à une dilution de 1: 100 et continuer l'incubation pendant 2 heures à 4 ° C (incubation peut être O / N). Ceci est la dilution optimale de l' antisérum # 31, utilisé dans cette étude et décrit par ailleurs ^3, mais en fonction de la qualité de l'tibody, une dilution plus ou moins grande peut être optimal.
   4. Ajouter 50 ul de billes de liaison d'immunoglobuline appropriée (par exemple, la protéine G-Sepharose, qui a été préalablement équilibrée en TNTE et remis en suspension 1: 5 de son volume initial en TNTE) et incuber pendant 50 min avec agitation sur une bascule de tube à essai à 4 ° C.
   5. Récupérer les billes par microcentrifugation à 11.000 xg pendant 20 sec.
   6. Rejeter le surnageant dans une poubelle radioactive appropriée.
   7. Laver les IP-billes trois fois avec 1 ml de tampon de lavage IP (voir le tableau 1), par tourbillonnement et microcentrifugation à 11.000 xg pendant 20 secondes à chaque fois.
   8. Resuspendre IP-billes dans 250 pi de tampon de lavage IP.
   9. Ajouter 1,5 ul de subérate de disuccinimidyle (DSS, dissous dans du DMSO à 10 mg / ml). Préparer la solution DSS juste avant son utilisation dans cette étape.
   10. Incuber pendant 15 min à 4 ° C sous agitation.
   11. Pour arrêter la réaction de réticulation, ajouter 500 pi otampon de lavage f IP, complété avec suffisamment de Tris-Cl pH 7,4 actions pour atteindre 25 mM Tris-Cl. Les groupes amino libres dans Tris capturer DSS n'a pas réagi.
   12. Centrifugeuse à 11.000 xg pendant 20 secondes pour recueillir IP perles et éliminer le surnageant.
   13. Resuspendre IP billes dans 30 pl de tampon réducteur de Laemmli.
   14. échantillons Faire bouillir 5 min à 94 ° C.
   15. Le cas échéant, analyser les échantillons dans un compteur gamma en utilisant le protocole du fabricant.
2. Analyse des échantillons
   1. échantillons soumis à une dénaturation SDS-PAGE. Utilisez polyacrylamide le pourcentage correspondant à la masse du récepteur et exécuter un gel selon la procédure standard.
   2. Immergez gel dans la solution de fixation (voir le tableau 1) pendant 30 min à température ambiante.
   3. Laver le gel avec de l'eau distillée pendant 15 min.
   4. Placer le gel dans du papier filtre préalablement hydratée et couvrir avec un film de saran wrap.
   5. gel sec à 80 ° C pendant 1 heure.
   6. Exposer gel sur une phosphorimager scre blancfr à TA O / N.
   7. Numérisation écran exposé en utilisant un phosphorimager en utilisant le protocole du fabricant.

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Résultats

La figure 1 montre un résultat représentatif obtenu avec aflip. Les signaux dans la piste 1 proviennent de la I-ligand ¹²⁵ lié de manière covalente soit à la protéine de poisson zèbre bêtaglycan noyau (core BG, au- dessous du marqueur 150 kDa) ou le noyau BG qui a été traité à sa forme de protéoglycanes par l' attachement des glycosaminoglycanes (GAG, frottis allant de 170 kDa à la partie supérieure du gel). Ce modèle de la migration, une p...

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Discussion

L'utilisation de Western blots avec un anticorps spécifique contre une protéine d'intérêt est un outil précieux pour étudier son expression ⁷ au cours de l' embryogenèse. Cependant, immunotransfert de protéines hautement glycosylées n'a pas eu beaucoup de succès en raison de leur transfert inefficace et faible liaison à nitrocellulose ou PVDF membranes ^8,9.

Les protéoglycanes sont un bon exemple de cette lacune, en raison de leurs chaînes de...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix