العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

Summary

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Abstract

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen^1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses³. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting⁴ and the investigation of proliferative abilities by ³H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling^5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Introduction

Mature lymphocytes generally exist in the resting state if there is no pre-existing infection or inflammation in the individual. Therefore, it is important to retain the naïve status of lymphocytes during the isolation process before performing in vitro or in vivo functional assays. The key to ensuring consistent and reproducible results is to limit any unnecessary manipulation of the cells.

Magnetic cell sorting utilizes antibodies and microbeads to label cells so as to enrich the cell population of interest. With this approach, there are two purification strategies: positive enrichment and negative depletion. Positive enrichment enriches the cell population of interest using an antibody that binds to the target cells. Negative depletion, on the other hand, depletes non-target cells, leaving the cell population of interest. In our lab, we prefer negative depletion to positive enrichment because the binding of antibodies to the target cells could potentially alter cell features and behavior. In fact, many established cell surface markers suitable for the isolation of a particular cell population are also functional receptors.

Magnetic cell sorting not only yields highly pure populations of viable target cells, it is also less time-consuming and avoids the cellular stress induced by high-pressure flow used in fluorescence-activated cell sorting (FACS). By labeling the unwanted cell populations and depleting them using a magnetic separation column, we are able to perform rapid cell isolation without compromising the viability of the target cell population. In this protocol, we demonstrate the use of negative depletion strategies to purify naïve B cells or T cells.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

هي ولدت كل الفئران والمحافظة في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض وتجرى جميع البروتوكولات الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.

1. إعداد المخازن والكواشف

1. إعداد المعهد التذكاري الكامل روزويل بارك (RPMI) متوسطة (10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، البنسلين (100 وحدة دولية / مل) / الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، 55 ميكرومتر 2-المركابتويثانول ).
2. إعداد 20x والمتوازن محلول الملح (BSS) سهم 1 و 2 سهم، وبشكل منفصل.
   1. إعداد 20x والأسهم BSS 1 (111 ملي سكر العنب، 8.8 ملي فوسفات البوتاسيوم، 26.7 ملي فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة في 1 لتر ماء معقم) وإضافة 40 مل 0.5٪ الفينول الأحمر إلى 20x والأسهم BSS 1 قبل تعديل الحجم النهائي. تصفية العقيمة باستخدام 0.2 ميكرون التصفية قبل تخزينها في 4 درجات مئوية.
   2. إعداد 20x وBSS الأوراق المالية 2 (25.8 ملم ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم، و 107 ملي كلوريد البوتاسيوم، الفصل 2.73 M الصوديومloride، 19.6 ملي هيدرات كلوريد المغنيسيوم، 16.6 ملي كبريتات المغنيسيوم في 1 لتر ماء معقم). تصفية العقيمة باستخدام 0.2 ميكرون التصفية قبل تخزينها في 4 درجات مئوية.
   3. لإعداد 1X BSS للاستخدام التجريبي، وتمييع 50 مل الأسهم BSS 1 و 50 مل الأسهم BSS 2، بشكل منفصل، في 400 مل من الماء المعقم لكل منهما. الجمع بين الحلول المخففة، والتكيف مع درجة الحموضة 7، وإضافة 20 مل FBS (2٪). أعلى ما يصل إلى 1 لتر باستخدام الماء المعقم وتصفية العقيمة باستخدام 0.2 ميكرون فلتر.
      ملاحظة: يجب أن تكون على استعداد الحلول الأسهم BSS بشكل منفصل بسبب اختلاط الأسهم BSS المركزة مباشرة يمكن أن يؤدي إلى هطول الأمطار.
3. خلايا الدم الحمراء (RBC) الاحتياطي تحلل
   1. لإعداد العازلة تحلل كريات الدم الحمراء، مزيج 9 أجزاء كلوريد الأمونيوم الأوراق المالية (155 كلوريد الأمونيوم مم في الماء المعقم) إلى 1 الأسهم جزء تريس قاعدة (130 ملي تريس (hydroxymethyl) aminomethane في الماء المعقم، ودرجة الحموضة 7.65) قبل الاستخدام.
      ملاحظة: مخزن الحلول الأسهم معقمة من كلوريد الأمونيوم وتريس قاعدة في 4 درجات مئوية. إعداد تحلل بuffer جديدة لضمان تحلل كفاءة من كرات الدم الحمراء.

2. جيل من الخلايا الليمفاوية تعليق من الطحال أو الغدد الليمفاوية

ملاحظة: من المهم إعداد جميع الكواشف والمعدات المطلوبة للتجربة قبل القتل الرحيم الماوس وتوليد تعليق خلية واحدة من الخلايا الليمفاوية في أقرب وقت ممكن للحفاظ على viabilities خلية عالية.

1. الموت ببطء الماوس التجريبية خلع عنق الرحم أو CO ₂ الخنق.
   ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية جو معقم و مطهر.
2. تراجع الماوس بأكمله إلى 70٪ من الإيثانول قبل اتخاذ أي شقوق. إزالة الطحال والغدد الليمفاوية جو معقم و مطهر ^8، ووضعها في منفصلة 15 مل أنابيب تحتوي على 5 مل الجليد الباردة RPMI / FBS (RPMI مع FBS 2٪) أو BSS / FBS (من الخطوة 1.2.3).
   ملاحظة: منذ BSS يمنع كفاءة تحلل كريات الدم الحمراء، واستخدام RPMI لإعداد تعليق خلية الطحال والتحول إلى BSS بعد عملية الشراءص RBC تحلل.
3. لتوليد تعليق خلية واحدة من الطحال أو الغدد الليمفاوية، ضع الجهاز (ق) في بين قطعتين من معقمة 100 ميكرون خلية شبكة مصفاة في طبق بتري تحتوي على 2 مل الجليد الباردة RPMI / FBS أو BSS / FBS. باستخدام المكبس من حقنة 1 مل، الهريس الجهاز (ق) حتى تمزقت إلى أجزاء دقيقة جدا.
4. نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل وغسل مصفاة الخلية شبكة مع الثلج الباردة RPMI / FBS أو BSS / FBS. جمع تعليق خلية المتبقية، إضافة إلى نفس أنبوب 15 مل، وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف.
   ملاحظة: إعادة تعليق الخلايا مكعبات عبها الأنبوب مع الأصابع قبل أن يضيف RBC العازلة تحلل أو المتوسطة في الخطوات اللاحقة.
5. إعداد درجة حرارة الغرفة العازلة تحلل (RT) RBC أثناء الطرد المركزي لتعليق الخلية (راجع الخطوة 1.3). بعد التكوير الخلايا وإزالة طاف، وإعادة تعليق-الخلايا مع 1 مل RBC تحلل العازلة لكل 10 ⁸ خلايا. Incuباتي رد فعل تحلل في RT لمدة 3-4 دقيقة.
6. وقف RBC تحلل مع 14 مل من الجليد الباردة BSS / FBS وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.

3. تنقية B وخلايا T

1. تنقية خلايا B
   1. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. اعادة تعليق ما يصل إلى 10 ⁸ خلايا الطحال في 300 ميكرولتر BSS / FBS وإضافة 50 ميكرولتر مكافحة CD43 ميكروبيدات المغناطيسية ^9،10. لإزالة الخلايا الميتة، إضافة 30 ميكرولتر Annexin V حبات مغناطيسية. احتضان تعليق الخلية في 4 درجة مئوية الثلاجة لمدة 30 دقيقة.
2. تنقية خلايا T
   1. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. اعادة تعليق ما يصل إلى 10 ⁸ خلايا في غير-T نضوب خلايا الجسم المضاد كوكتيل (الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز ضد CD19، B220، GR-1، TCR-γδ، CD49b، CD11c و، CD11b، Ter119 وCD4 أو CD8 تبعا لعدد السكان الخلية المستهدفة ل يمكن تنقيته)، المخفف 1: 200 في 200 BSS ميكرولتر / FBS ^4،5. احتضان تعليق خلية في4 ° C الثلاجة لمدة 15 دقيقة.
   2. بعد الحضانة، إضافة 10 مل BSS / FBS لغسل الخلايا وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في 165 ميكرولتر BSS / FBS مع 30 ميكروبيدات streptavidin ميكرولتر و 15 ميكرولتر Annexin V حبات مغناطيسية. احتضان تعليق الخلية في 4 درجة مئوية الثلاجة لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: لضمان حتى وصفها مع ميكروبيدات المغناطيسية، واحتضان الخلايا مع ميكروبيدات لمدة 15 دقيقة، ثم خلط تعليق خلية بلطف من خلال الاستفادة من أنبوب 15 مل واحتضان لمدة 15 دقيقة أخرى خلال خطوة 3.1.1. أو 3.2.2.
3. إعداد العمود فصل لتنقية خلية
   1. إعداد عمود الفصل غير المستخدمة خلال وضع العلامات ميكروبيدات من الخلايا (الخطوة 3.1.1. أو 3.2.2.). قبل الدافئة BSS (بدون FBS) إلى RT واستخدام 2 مل لغسل وتتوازن العمود جو معقم و مطهر. بعد موازنة مع BSS، لا ينبغي أن يسمح للعمود غسلها لتجف.
      ملاحظة: نحن نستخدم LS جolumn بدلا من العمود LD الموصى بها نظرا لإعادة الاستخدام (انظر الخطوة 3.4).
   2. بعد وضع العلامات مع حبات مغناطيسية، إضافة 14 مل BSS / FBS لغسل الخلايا وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في 1-3 مل RT BSS.
   3. إرفاق العقيمة 21 G الإبرة إلى غيض من عمود للحد من معدل تدفق أثناء عملية التنقية. تحميل تعليق الخلية على العمود معايرتها وجمع التدفق من خلال تحتوي على الخلايا المستهدفة النقاء.
      ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات في العمود أثناء التحميل.
   4. غسل العمود مرة واحدة مع 1 مل BSS / FBS وجمع التدفق من خلال تحتوي على الخلايا المستهدفة النقاء. تحديث العمود مع تدفق من خلال مرة أخرى. جمع التدفق من خلال بعد التحميل الثاني في نفس أنبوب 15 مل.
   5. غسل العمود 3 مرات مع 1 مل BSS / FBS وجمع التدفق من خلال تحتوي على الخلايا المستهدفة النقاء. بعد ذلك، إضافة 5 مل BSS / FBS إلى thالعمود الإلكترونية، ومع الغطاس، بمسح الخلايا المسمى مغناطيسيا للخروج من عمود في أنبوب 15 مل الجديد.
   6. تحقق نقاء من الخلايا التي تم جمعها عن طريق التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة التي تربط على سطح المستضدات من تنقية باء أو خلايا تي ^4،5.
4. إعادة استخدام عمود الفصل
   ملاحظة: يمكن إعادة استخدامها العمود LS تصل إلى 4 مرات دون أن يؤثر كفاءة تنقية.
   1. غسل العمود 3 مرات مع 5 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) و 3 مرات مع 5 مل من الماء المقطر من أعلى باستخدام المكبس.
   2. غسل العمود مع 5 مل 70٪ من الإيثانول وتجفيف عمود على نطاق واسع باستخدام صنبور الهواء لمنع تراكم الصدأ في العمود.
   3. لإعداد عمود LS المستخدمة لإجراء تجربة تنقية منفصلة، ​​وغسل عمود من أسفل إلى أعلى مع 5 مل 70٪ من الإيثانول باستخدام محول حقنة. التالي، وغسل عمود من الأسفل إلى الأعلى مرتين مع 5 مل العقيمة برنامج تلفزيوني، تليها 5 مل PBS مرة واحدة من أعلى العمود. إضافة 2مل RT BSS للتوازن العمود ومن ثم المضي قدما لتحميل العمود مع الخلايا المسمى.

4. CFSE وصفها وتحفيز

ملاحظة: تنقية الخلايا يمكن أن تخضع لمجموعة متنوعة من في المختبر والمقايسات الفنية الجسم الحي. هنا، ونحن نستخدم خلايا T النقاء لتحديد T القدرة على تحفيز الخلايا من ناقلات الجنود المدرعة ^5.

1. حل قبل الدافئ وضع العلامات (0.1٪ FBS في برنامج تلفزيوني) إلى 37 درجة مئوية قبل CFSE التحميل.
   ملاحظة: استخدام نسبة منخفضة من FBS في برنامج تلفزيوني يقلل موت الخلايا خلال CFSE التحميل ويقلل من فقدان الخلايا خلال الطرد المركزي. ومع ذلك، يمكن FBS الكثير تتداخل مع CFSE التحميل.
2. غسل الخلايا تنقيته مرتين مع وضع العلامات الحل، ثم إعادة علقت في 2 × 10 ⁷ خلية / مل في حل وضع العلامات قبل تحسنت في أنبوب 15 مل.
3. إعداد 10 ميكرومتر حل CFSE (1: 500 التخفيف من 5 ملي CFSE حل الأوراق المالية) في قبل تحسنت حل وضع العلامات. ينبغي CFSE الحلأن طازجة في كل مرة لتحقيق وضع العلامات الأمثل.
4. لتحميل الخلايا مع CFSE، إضافة تعليق خلية جزء 1 إلى 1 جزء 10 حل ميكرومتر CFSE في أنبوب 15 مل واحتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ويستخدم تركيز النهائي من 5 ميكرومتر CFSE لتسمية 1 × 10 ⁷ خلية / مل.
5. عكس الأنبوب كل دقيقة 2 لضمان خليط متجانس من الخلايا خلال CFSE التحميل.
6. لوقف رد الفعل، إضافة عدة مجلدات من اكتمال المتوسطة RPMI الجليد الباردة وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. على النجاح CFSE تحميل، ستظهر بيليه خلية مصفر.
7. غسل CFSE تحميل خلية واحدة لمزيد من الوقت مع كامل المتوسطة RPMI الجليد الباردة وتدور باستمرار في 453 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية قبل استخدام لفي المختبر زراعة أو في تنشيط الجسم الحي.

5. في المختبر تحفيز

1. يعد حل 2X الأسهم من المحفزات (2X المحفزات حل الأسهم) مباشرة قبل الاستعمال بحيث 100 ميكرولتر من 2X حل الأسهم المحفزات يمكن أن تضاف إلى 100 ميكرولتر من الخلايا إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر لكل بئر في لوحة 96-جيدا.
2. إذا كنت بحاجة لوحة المغلفة مع المثيرات (الغلوبولين المناعي أو CD40 للخلايا B أو CD3 وCD28 للخلايا T)، يخفف من المحفزات في برنامج تلفزيوني وقبل معطف لوحة الثقافة في 4 درجات مئوية خلال الليل. بدلا من ذلك، لوحة الثقافة يمكن أن تطلى عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في اليوم من هذه التجربة. غسل لوحة المغلفة مرتين مع برنامج تلفزيوني (لا تسمح لوحة لتجف في أي وقت).

لخلايا B
المحفزات	التركيز النهائي
F (أ ب ') 2 الماعز المضادة للماوس الغلوبولين المناعي	0،6-2،4 ميكروغرام / مل
مكافحة فأر CD40 ماب	0.5-2 ميكروغرام / مل
المؤتلفالماوس IL-4	25 U / مل
lipopolysaccharide في	،1-10 ميكروغرام / مل
(LPS) من E. القولونية المصلي 055: B5
للخلايا T
المحفزات	التركيز النهائي
مكافحة CD3 (المغلفة لوحة)	2-10 ميكروغرام / مل
(50 ميكرولتر / جيد لطلاء)
مكافحة CD28 (المغلفة لوحة)	2 ميكروغرام / مل
المؤتلف IL-2	40 U / مل
PDBu (Phorbol استر)	5-50 نانوغرام / مل
A23187 (الكالسيوم حامل الأيون)	250 نانوغرام / مل

الجدول 1: التركيزات من المحفزات المستخدمة لتحفيز الخلايا الليمفاوية في ثقافة في المختبر.

3. لخلايا B وصفت CFSE، إعادة تعليق ل3 × 10 ⁶ خلية / مل في كامل المتوسطة والثقافة RPMI في ثلاث نسخ مع 3 × 10 ⁵ خلايا جيدا / في 96-جيدا لوحات مسطحة القاع لمدة 72 ساعة.
4. للخلايا T المسمى CFSE، إعادة تعليق ل0.5-3 × 10 ⁶ خلية / مل في كامل المتوسطة RPMI والثقافة في ثلاث نسخ مع 0.5-3 × 10 ⁵ خلايا جيدا / في 96-جيدا لوحات أسفل الجولة لمدة 48 أو 72 ساعة .

6. في فيفو تحفيز

1. في الجسم الحي التحفيز، نقل adoptively 4 × 10 ⁶ المسمى CFSE خلايا T في الماوس (عن طريق الوريد (IV) في 200 ميكرولتر PBS) إلى كل فأر متلق MHC المطابقة.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، وخلايا T وصفت CFSE ويمكن نقل adoptively باستخدام الوريد الذيل أو حقن الرجعية المداري حيث أن هذه الخلايا سوف تضم اللمفاوية أجهزة مثل الطحال والغدد الليمفاوية.
2. تحدي الفئران المتلقي في وقت لاحق يوم واحد مع المستضد.
   ملاحظة:في هذا المثال، ونحن نستخدم ألبومين البيض (البروتين OVA، 50 ميكروغرام / الماوس) كما مستضد لOVA محددة، تم نقل الخلايا التائية مستقبلات (TCR) خلايا T -transgenic adoptively في الفئران المتلقي. إعداد البروتين OVA في برنامج تلفزيوني العقيمة وحقن 100 ميكرولتر من OVA بروتين / برنامج تلفزيوني أو السيطرة برنامج تلفزيوني، عن طريق الحقن تحت الجلد (سي)، إلى كل فأر متلق ^5.
3. الحصاد وتوليد تعليق خلية واحدة من الأجهزة اللمفاوية (الغدد الليمفاوية والطحال) من الفئران المتلقي بعد 3 أيام التحصين مع البروتين OVA أو برنامج تلفزيوني. الغدد الليمفاوية منفصلة إلى الغدد الليمفاوية القريبة (PLN)، والذي يتضمن إبطي، العضدية والغدد الليمفاوية العنقية سطحية) والعقد الليمفاوية البعيدة (DLN)، التي تضم المساريقي، مأبضي، الاربية، وأسفل الظهر، والغدد الليمفاوية الذيلية. خلايا وصمة عار باستخدام الأجسام المضادة نظام مراقبة الأصول الميدانية المناسبة للتحقق من انتشار الخلايا التائية.
   ملاحظة: في هذا CFSE خلية تجربة تتبع، CFSE المسمى خلايا T من السيطرة على الفئران المحقونة برنامج تلفزيوني تأسيس مضان الأساس لعدم دىviding الخلايا. انقسامات الخلية من المتكاثرة، وتصور، الخلايا المسمى CFSE-حفز مستضد عن طريق قياس قمم مضان ^12،13. مع تحكم في برنامج تلفزيوني، وعدد من انقسامات الخلية من المتكاثرة، وخلايا T وصفت CFSE-يمكن تحديد ^12،13.
4. تحليل البيانات تكاثر الخلايا المسمى CFSE بمقارنة عدد من انقسامات الخلية أو قمم بين العينات (الشكلان 1 و 2).
   ملاحظة: على سبيل المثال، CFSE المسمى، وخلايا T-OVA محددة نقل adoptively في الفئران المتلقي تلقي مستضد OVA سيخضع انتشار نشاطا مقارنة مع السيطرة على الفئران المحقونة برنامج تلفزيوني ^5،12. وعلاوة على ذلك، من الجدير بالذكر أن نشير إلى أن هناك العديد من الطرق لتحليل البيانات تكاثر الخلايا CFSE، كما يتبين من هوكينز وزملاؤه ^14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تنقية الخلايا المغناطيسية من الخلايا الليمفاوية يسمح للمستخدمين لتنقية السكان الخلية المستهدفة في فترة قصيرة نسبيا من الزمن. باستخدام بروتوكول استنزاف لدينا، كنا قادرين على زيادة النسبة المئوية للخلايا التائية CD8 (OT-I في وتفعيل إعادة التركيب الجي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود إجراءات لتنقية الخلايا الليمفاوية من الأجهزة اللمفاوية. تنقية الخلايا باستخدام الفرز حبة المغناطيسي هي طريقة سريعة وبسيطة يمكن أن ينتج قابلة للحياة، الخلايا المستهدفة عالي النقاء.

خطوات حا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
RPMI 1640 (without L-Glutamine)	Gibco	31870025
Fetal Bovine Serum			Heat inactivated
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140114
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-CD43 magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-801	Mix well prior use
Streptavidin microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101	Mix well prior use
Anti-Annexin V magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-090-201	Mix well prior use
MACS LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
96-well U-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	650180
96-well F-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	655180
100 μm cell strainer mesh			To sterilize using UV radiation prior use
0.2 μm  sterile disposable filter units	Nalgene	567-0020	Can be substituted with any sterile filter device
CellTrace Violet	Invitrogen	C34557	CTV for short; alternative to CFSE
CellTrace Yellow	Invitrogen	C34567	CTY for short; alternative to CFSE
CellTrace Far Red	Invitrogen	C34564	CTFR for short; alternative to CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor 670	eBioscience	65-0840	CPD670 for short; alternative to CFSE
PKH26	Sigma Aldrich	PKH26GL	PKH26, alternative to CFSE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Dextrose	Sigma Aldrich	G7021
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5655
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S5136
Phenol Red	Sigma Aldrich	P0290
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Sodium chloride	Merck Millipore	S7653	Can use from other sources
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Tris-base
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Molecular Probes	C-1157	Reconstitute in DMSO
Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)	Sigma Aldrich	P1269
A23187 (Calcium ionophore)	Sigma Aldrich	C7522
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and recombinant protein
CD11b biotin (clone m1/70)	Biolegend	101204	T cell depletion cocktail
CD11c biotin (clone N418)	Biolegend	117304	T cell depletion cocktail
Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)	Biolegend	108404	T cell depletion cocktail
Ter119 biotin (clone Ter119)	Biolegend	116204	T cell depletion cocktail
TCR-γδ biotin (clone GL-3)	Biolegend	118103	T cell depletion cocktail
CD19 biotin (clone 6D5)	Biolegend	115504	T cell depletion cocktail
B220 biotin (clone RA3-6B2)	Biolegend	103204	T cell depletion cocktail
CD49b biotin (clone DX5)	Biolegend	108904	T cell depletion cocktail
CD4 biotin (clone GK1.5)	Biolegend	100404	T cell depletion cocktail
CD8 biotin (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	T cell depletion cocktail
F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated)	Jackson ImmunoResearch	115-006-075	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-mouse CD40 mAb (plate coated)	Pharmingen	553722	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-4	ProSpec	Cyt-282
LPS from E. coli Serotype 055:B5	Sigma Aldrich	L-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated)	eBioscience	16-0037-85	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)	eBioscience	16-0281-85	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-2	ProSpec	Cyt-370
Albumin from chicken egg white, Ovalbumin	Sigma Aldrich	A7641