분리 및 쥐 림프구의 활성화

요약

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

초록

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen^1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses³. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting⁴ and the investigation of proliferative abilities by ³H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling^5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

서문

Mature lymphocytes generally exist in the resting state if there is no pre-existing infection or inflammation in the individual. Therefore, it is important to retain the naïve status of lymphocytes during the isolation process before performing in vitro or in vivo functional assays. The key to ensuring consistent and reproducible results is to limit any unnecessary manipulation of the cells.

Magnetic cell sorting utilizes antibodies and microbeads to label cells so as to enrich the cell population of interest. With this approach, there are two purification strategies: positive enrichment and negative depletion. Positive enrichment enriches the cell population of interest using an antibody that binds to the target cells. Negative depletion, on the other hand, depletes non-target cells, leaving the cell population of interest. In our lab, we prefer negative depletion to positive enrichment because the binding of antibodies to the target cells could potentially alter cell features and behavior. In fact, many established cell surface markers suitable for the isolation of a particular cell population are also functional receptors.

Magnetic cell sorting not only yields highly pure populations of viable target cells, it is also less time-consuming and avoids the cellular stress induced by high-pressure flow used in fluorescence-activated cell sorting (FACS). By labeling the unwanted cell populations and depleting them using a magnetic separation column, we are able to perform rapid cell isolation without compromising the viability of the target cell population. In this protocol, we demonstrate the use of negative depletion strategies to purify naïve B cells or T cells.

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프로토콜

모든 마우스는 사육 및 특정 병원균이없는 조건에서 유지되고 모든 마우스 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 실시하고있다.

버퍼 및 시약 1. 준비

1. 55 μM 2- 머 캅토 에탄올을 완료 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 배지 (10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM L- 글루타민, 페니실린 (100 IU / ㎖) / 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖)을 제조 ).
2. 별도로, 20 배 균형 소금 용액 (BSS) 주식 1 재고 2를 준비합니다.
   1. 20 배 BSS의 1 개 (1 L 멸균 111 mM의 포도당, 8.8 MM의 인산 칼륨, 26.7 mM의 인산 나트륨)를 준비하고 최종 볼륨 조정하기 전에 20 배 BSS의 1 개에 40 ㎖의 0.5 % 페놀 레드를 추가합니다. 4 ℃에서 저장하기 전에 0.2 μm의 필터를 사용하여 살균 필터.
   2. 20 배 스톡 BSS 2 (25.8 mM의 염화 칼슘 이수화 물, 107 mM의 염화칼륨, 2.73 M 나트륨 CH 준비loride 19.6 mM의 염화 마그네슘 육수화물, 1- L 멸균 16.6 mM의 마그네슘 설페이트). 4 ℃에서 저장하기 전에 0.2 μm의 필터를 사용하여 살균 필터.
   3. 400 ml의 멸균 각각 별도로, 50 ㎖ BSS의 1 개 및 50 ml의 BSS 주식이 희석, 실험적인 사용을 위해 1X BSS를 준비합니다. 모두 희석 솔루션을 결합하여 pH 7로 조정하고, 20 ㎖의 FBS (2 %)를 추가합니다. 0.2 μm의 필터를 사용하여 멸균 및 살균 필터를 사용하여 1 L까지 최고.
      참고 : 농축 BSS 주식 혼합 직접 침전이 발생할 수 있기 때문에 BSS의 재고 솔루션은 별도로 준비해야한다.
3. 적혈구 (RBC) 용해 버퍼
   1. , RBC 용해 버퍼를 준비 사용하기 전에 1 부품 재고 트리스베이스 (멸균 130 mM 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄, 산도 7.65) 9 부에게 재고 암모늄 클로라이드 (멸균 155 MM의 염화 암모늄)를 혼합합니다.
      참고 : 4 ° C에서 염화 암모늄 및 트리스베이스의 저장 멸균 재고 솔루션을 제공합니다. 용해 B를 제조적혈구의 효율적인 용해를 보장하기 위해 신선한 uffer.

비장 또는 림프절에서 림프구 서스펜션의 2 세대

주 : 마우스를 안락사 이전 실험에 필요한 모든 시약 및 장치를 제조 및 높은 세포 생존율을 유지하기 위해 가능한 한 빨리 림프구의 단일 세포 현탁액을 생성하는 것이 중요하다.

1. 자궁 경부 전위 또는 CO ₂ 질식에 의해 실험 마우스를 안락사.
   참고 : 이후이 단계에서 모든 실험 절차는 무균 적으로 수행해야합니다.
2. 어떤 절개를하기 전에 70 % 에탄올로 전체 마우스를 찍어. 비장과 림프절 무균 ^8을 제거하고 또는 (단계 1.2.3에서) BSS / FBS (2 % FBS와 RPMI) 5 ml의 얼음처럼 차가운 RPMI / FBS를 포함하는 별도의 15 ml의 튜브에 배치합니다.
   주 : BSS 효율적 RBC 용해를 방지하기 때문에, 비장 세포 현탁액의 제조 RPMI를 사용 afte BSS로 전환R RBC 용해.
3. 2 ml의 얼음처럼 차가운 RPMI / FBS 또는 BSS / FBS를 포함하는 페트리 접시에 멸균 100 μm의 셀 스트레이너 메쉬의 두 조각 사이에있는 기관 (들)을 배치, 비장이나 림프 노드에서 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 그것은 매우 미세한 부분으로 찢어 때까지 1 ml의 주사기의 플런저를 사용하여, 기관 (들) 매쉬.
4. 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송하고, 셀 스트레이너 얼음처럼 차가운 RPMI / FBS 또는 BSS / FBS 메쉬 씻는다. 나머지 세포 현탁액을 수집 같은 15 ML 튜브에 추가하고, 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운. 뜨는을 제거합니다.
   주 : 다음 단계에서 RBC 용해 버퍼 또는 매체를 추가하기 전에 손가락으로 튜브를 flicking하여 펠렛 세포를 일시 중지 다시.
5. 세포 현탁액을 원심 분리 동안 실온 (RT) RBC 용해 버퍼를 준비한다 (단계 1.3 참조.). 상층 액을 세포를 펠렛 및 제거한 후, 매 10 ⁸ 세포를 1 ml의 RBC 용해 버퍼와 세포를 다시 일시 중지합니다. 인큐BATE 3-4 분 동안 RT에서 분해 반응.
6. 14 ml의 얼음처럼 차가운 BSS / FBS와 RBC 용해를 중지하고 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운.

B 및 T 세포의 정제 3.

1. B 세포의 정제
   1. 혈구 세포를 사용하여 계산. 300 ㎕의 BSS / FBS 최대 10 ⁸ 비장 세포를 다시 일시 중지하고 50 μl의 항 CD43에게 자기 마이크로 비드 ^{9,10를 추가합니다.} 죽은 세포를 제거 30 μl를 넥신 V 자석 구슬을 추가합니다. 30 분 동안 4 ℃로 냉장고에 세포 현탁액을 부화.
2. T 세포의 정제
   1. 혈구 세포를 사용하여 계산. 비 T 세포 고갈 항체 칵테일 10 ⁸ 세포 (CD19, B220, GR-1에 대한 비오틴 항체까지 다시 일시 중지, TCR-γδ, CD49b, 중 CD11c, CD11b를, Ter119 및 CD4 또는 CD8은에 표적 세포 인구에 따라 / FBS ^-4,5- 200 μL의 BSS 200 :) 정제 1 희석. A의 세포 현탁액을 부화15 분 동안 4 ° C 냉장고.
   2. 배양 후, 세포를 세척하고 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운 10 ml의 BSS / FBS를 추가합니다. 상층 액을 제거하고 30 μL의 스트렙 타비 딘 마이크로 비드 15 ㎕를 넥신 V 자기 구슬 165 μL의 BSS / FBS에서 세포를 다시 일시 중지합니다. 30 분 동안 4 ℃로 냉장고에 세포 현탁액을 부화.
      주 : 심지어 자기 마이크로 비드와 라벨을 보장 15 분 동안 마이크로 비드와 세포를 배양 한 후 15 ML 튜브를 눌러 부드럽게 세포 현탁액을 혼합 단계 3.1.1 중에 다른 15 분을 품어. 또는 3.2.2.
3. 셀 정화를위한 분리 컬럼의 제조
   1. 세포의 마이크로 비드 라벨 동안 사용되지 않은 분리 컬럼을 준비한다 (단계 3.1.1. 또는 3.2.2.). RT에 (FBS)없이 사전 따뜻한 BSS 및 세척 및 무균 열 평형을 2 ml를 사용합니다. BSS와 평형 후, 세척 된 열은 건조하도록 허용해서는 안된다.
      참고 : 우리는 LS의 C를 사용하여olumn 대신 권장 LD 열 인해 재사용 성을 (단계 3.4를 참조하십시오.).
   2. 자기 구슬 표시 한 후, 세포를 세척하고 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운 14 ml의 BSS / FBS를 추가합니다. 상층 액을 제거하고 1-3 ml의 RT BSS에서 세포를 다시 일시 중지합니다.
   3. 정제 과정에서 유속을 감소시키기 위해 열 선단에 멸균 21 G 바늘을 부착. 평형화 컬럼에 세포 현탁액을 넣고 정제 된 표적 세포를 함유 통해 흐름을 수집한다.
      주 : 열로드하는 동안에 거품을 도입하지 마십시오.
   4. 1 ml의 BSS / FBS 한 번 컬럼을 세척하고 정제 된 표적 세포를 포함 통해 흐름을 수집합니다. 다시 한번를 통해 흐름에 열을 다시로드합니다. 동일한 15ml를 튜브에 제 2 로딩 돌파 흐름을 수집한다.
   5. 1 ml의 BSS / FBS와 열을 3 회 세척하고 정제 된 표적 세포를 포함 통해 흐름을 수집합니다. 그 후, 토륨 5 ml의 BSS / FBS를 추가플런저와 전자 칼럼은, 새로운 15 ML 튜브에 열을 밖으로 자기 표지 된 세포를 세척합니다.
   6. 정제 B 또는 T 세포의 항원 ^4,5- 표면에 결합하는 항체를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 수집 된 세포의 순도를 확인한다.
4. 다시 사용하여 분리 컬럼을
   주 : LS 열이 정화 효율에 영향을주지 않고 4 회 이상 재사용 할 수있다.
   1. 5 ml의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)와, 플런저를 사용하여 상부로부터 증류수 5 mL로 3 회 컬럼을 3 회 세척 하였다.
   2. 5 ml의 70 % 에탄올로 컬럼을 세척하고 광범위 열에 녹의 축적을 방지하기 위해 공기 탭을 사용하여 열을 건조.
   3. 별도의 정화 실험을 위해 사용 된 LS 열을 준비하려면, 주사기 어댑터를 사용하여 5 ml의 70 % 에탄올로 아래에서 위로 열을 씻는다. 다음으로, 컬럼의 상단에서 한 번에 5 ml의 PBS 다음에 5 ml의 멸균 PBS로 두 번 아래에서 위로 열을 씻는다. 2 추가ml의 RT BSS는 열 평형을 다음 라벨 세포와 열을로드로 진행합니다.

4. CFSE 라벨 및 자극

주 : 정제 된 세포는 시험 관내의 다양한 생체 기능 분석에서 실시 될 수있다. 여기서는 장갑차 ^(5)의 T 세포 자극 기능을 결정하기 위해 정제 된 T 세포를 사용한다.

1. 37 ° C 이전 CFSE에 로딩 사전 따뜻한 라벨 솔루션 (PBS에서 0.1 % FBS).
   참고 : PBS에서 FBS의 낮은 비율을 사용하여이 CFSE 로딩 중 세포 사멸을 감소시키고 원심 분리하는 동안 세포 손실을 최소화 할 수 있습니다. 그러나, 너무 많은 FBS는 CFSE 로딩을 방해 할 수 있습니다.
2. 라벨 용액으로 두 번 정제하여 세포를 세척 한 다음 15 ㎖의 튜브 예열 라벨링 용액에 2 × ¹⁰⁷ 세포 / ㎖로 재현 탁.
3. 10 μM CFSE의 용액을 제조 하였다 (1 : 500 희석 5mM의 CFSE 원액) 예열 라벨 솔루션이다. CFSE 솔루션해야갓 최적 라벨링을 달성하기마다 준비.
4. CFSE로 세포를 로딩하기 위해, 37 ° C에서 10 분 동안 어두운 데에서 15 ㎖의 튜브에 1 부분 10 μM CFSE의 용액에 한 부분에 세포 현탁액을 추가 배양한다. 5 μM CFSE의 최종 농도는 1 × 10 ⁷ 세포 / mL의 라벨을 사용한다.
5. CFSE 로딩 동안 세포 균질 한 혼합을 보장하기 위해 관마다 2 분 전환.
6. 반응을 중지 얼음처럼 차가운 완전한 RPMI 매체의 여러 볼륨을 추가, 4 ° C에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운합니다. 성공적인 CFSE 로딩되면, 세포 펠렛은 황색 표시됩니다.
7. 워시 CFSE는 얼음처럼 차가운 완전한 RPMI 배지로 세포를 한 번 더로드 및 체외 배양 또는 생체 자극에 사용하기 전에 4 ° C에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운.

5. 체외 자극

1. 바로 사용하기 전에 자극의 2 배 원액 (2 배 자극 원액)를 준비 (10) 그래서배 자극 원액 0 μL를 96 웰 플레이트에 웰 당 200 ㎕의 최종 부피로 세포 100 μl를 첨가 할 수있다.
2. (B 세포 또는 T 세포 CD3 및 CD28 또는 CD40에 대한 IgM의) 자극 코팅 플레이트가 필요할 경우, 밤새 4 ℃에서 PBS에 자극 및 프리 코트 배양 접시를 희석. 대안으로, 배양 용기는 실험 하루에 1 시간 동안 37 ℃에서 코팅 할 수있다. PBS (접시 언제든지 건조하는 것을 허용하지 않는다)로 두 번 코팅 된 판을 씻으십시오.

B 세포
자극	최종 농도
F (AB ') 2 염소 항 - 마우스 IgM의	0.6-2.4 μg의 / ㎖
반대로 마우스 CD40 단클론 항체	0.5 μg의 / ㎖
재조합마우스 IL-4	25 U / ㎖
리포 폴리 사카 라이드	0.1 μg의 / ㎖
E.에서 (LPS) 대장균 혈청 형 055 : B5
T 세포
자극	최종 농도
항 CD3 (플레이트 코팅)	2-10 μg의 / ㎖
(50 μL / 웰 코팅)
안티 CD28 (플레이트 코팅)	2 μg의 / ㎖
재조합 IL-2	40 U / ㎖
PDBu (포르 볼 에스테르)	5-50 ng를 / ㎖
A23187 (칼슘 이온 운반체)	ng를 250 / ㎖

표 1 : 체외 배양에서 림프구를 자극하는 데 사용되는 자극의 농도.

3. CFSE 표지 된 B 세포의 경우, 3 × ¹⁰⁵ 세포 중으로의 완전한 RPMI 배지 및 배양 ⁶ × 10 3 세포 / ml을 다시 중지 / 웰로 72 시간 동안 96- 웰 편평 바닥 플레이트.
4. CFSE 표지 된 T 세포, 0.5~3 × ¹⁰⁵ 세포 중으로의 완전한 RPMI 배지 및 배양에 0.5~3 × ¹⁰⁶ 세포 / ㎖로 재 - 정지 / 웰에서 48 또는 72 시간 동안 96 웰 둥근 바닥 플레이트 .

6. 생체 자극

1. 생체 자극, 적응 적 전송을위한 마우스 당 4 × 10 ⁶ CFSE 표지 T 세포 (정맥 주사 (IV) 200 ㎕의 PBS에) 각 MHC-일치받는 사람 마우스로.
   참고 :이 프로토콜에서, CFSE 표지 T 세포가 적응 적 집 같은 비장과 림프절 등 장기 림프하는 것입니다 이러한 세포로 꼬리 정맥 또는 역 궤도 주사를 이용하여 전송할 수 있습니다.
2. 일일 나중에 항원받는 사람 마우스에 도전.
   노트:OVA 특이 적, T 세포 수용체 (TCR) -transgenic T 세포가 적응 적받는 마우스에 옮겼다 때문에이 예에서는 항원으로서 난 알부민 (OVA 단백질를 50㎍ / 마우스)를 사용한다. 각받는 사람 마우스 ^(5)로, 피하 주사 (SI)를 통해 멸균 PBS에서 OVA 단백질을 준비하고 OVA 단백질 / PBS 또는 PBS 제어의 100 μl를 주입.
3. 수확 3 일 OVA 단백질 또는 PBS와 예방 접종 후받는 사람 마우스의 단일 림프 기관에서 세포 현탁액 (림프절과 비장)을 생성합니다. 근위 림프절 장간막, 오금, 사타구니, 허리와 꼬리 림프절을 포함 겨드랑이, 상완 및 표면 경부 림프절) 및 말초 림프절 (DLN)를 포함한다 (PLN),에 별도의 림프절. FACS 적절한 항체를 사용하여 염색 된 세포는 T 세포의 증식을 확인한다.
   주 :이 CFSE 셀 추적 실험에서 비 디위한 기준선 형광을 설정 PBS가 주입 된 대조군 마우스로부터 T 세포를 CFSE 표지세포를 이용하므로. 증식 세포 분열은 항원 자극, CFSE 표지 된 세포는 형광 피크 ^{(12, 13)을} 측정함으로써 가시화된다. PBS를 제어으로 증식 세포 분열의 수, CFSE 표지 된 T 세포 ^12,13 결정될 수있다.
4. 샘플 사이의 세포 분열이나 피크의 수를 비교하여 CFSE 표지 된 세포 증식 데이터를 분석 (도 1 및도 2).
   참고 : 예를 들어, CFSE 표지 된, 적응 적 난자 항원을 수신받는 마우스에 전달 OVA 특이 적 T 세포는 PBS가 주입 된 대조군 마우스에 비해 ^5,12- 활성 증식을 받게 될 것이다. 또한, 호킨스 동료 ^(14)에 의해 입증 된 바와 같이 CFSE 세포 증식 데이터를 분석하는 다양한 방법이 있다는 것을 지적 주목할 만하다.

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결과

림프구 세포 자기 정화 사용자가 상대적으로 짧은 시간 동안 표적 세포 집단을 정제 할 수있다. 우리 공핍 프로토콜을 사용하여, 정제 후 94.2 % (에 72.8 % (전 정제) 행 (재결합 활성화 유전자 1 (RAG-1) 결핍 생쥐 OT-I) CD8 T 세포의 비율을 증가 할 수 있었다; 도 1a) ^4,5. 이러한 정제 림프구는 림프구 증식 및 신호 전달 ^4,5-을 결정하는 다운 스트림 기능...

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토론

이 프로토콜에서는, 우리는 림프 기관에서 림프구를 정제하는 과정을 보여줍니다. 자기 비드 정렬을 사용하여 셀 정화가 가능한 고도로 정제 된 표적 세포를 산출 빠르고 간단한 방법이다.

프로토콜 내에서 중요한 단계

세포 생존 및 세포 수율

체외에서 조혈 계통 세포의 생존을 유지하는 것은 성공적인 및 재현 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
RPMI 1640 (without L-Glutamine)	Gibco	31870025
Fetal Bovine Serum			Heat inactivated
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140114
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-CD43 magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-801	Mix well prior use
Streptavidin microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101	Mix well prior use
Anti-Annexin V magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-090-201	Mix well prior use
MACS LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
96-well U-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	650180
96-well F-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	655180
100 μm cell strainer mesh			To sterilize using UV radiation prior use
0.2 μm  sterile disposable filter units	Nalgene	567-0020	Can be substituted with any sterile filter device
CellTrace Violet	Invitrogen	C34557	CTV for short; alternative to CFSE
CellTrace Yellow	Invitrogen	C34567	CTY for short; alternative to CFSE
CellTrace Far Red	Invitrogen	C34564	CTFR for short; alternative to CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor 670	eBioscience	65-0840	CPD670 for short; alternative to CFSE
PKH26	Sigma Aldrich	PKH26GL	PKH26, alternative to CFSE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Dextrose	Sigma Aldrich	G7021
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5655
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S5136
Phenol Red	Sigma Aldrich	P0290
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Sodium chloride	Merck Millipore	S7653	Can use from other sources
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Tris-base
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Molecular Probes	C-1157	Reconstitute in DMSO
Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)	Sigma Aldrich	P1269
A23187 (Calcium ionophore)	Sigma Aldrich	C7522
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and recombinant protein
CD11b biotin (clone m1/70)	Biolegend	101204	T cell depletion cocktail
CD11c biotin (clone N418)	Biolegend	117304	T cell depletion cocktail
Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)	Biolegend	108404	T cell depletion cocktail
Ter119 biotin (clone Ter119)	Biolegend	116204	T cell depletion cocktail
TCR-γδ biotin (clone GL-3)	Biolegend	118103	T cell depletion cocktail
CD19 biotin (clone 6D5)	Biolegend	115504	T cell depletion cocktail
B220 biotin (clone RA3-6B2)	Biolegend	103204	T cell depletion cocktail
CD49b biotin (clone DX5)	Biolegend	108904	T cell depletion cocktail
CD4 biotin (clone GK1.5)	Biolegend	100404	T cell depletion cocktail
CD8 biotin (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	T cell depletion cocktail
F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated)	Jackson ImmunoResearch	115-006-075	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-mouse CD40 mAb (plate coated)	Pharmingen	553722	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-4	ProSpec	Cyt-282
LPS from E. coli Serotype 055:B5	Sigma Aldrich	L-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated)	eBioscience	16-0037-85	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)	eBioscience	16-0281-85	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-2	ProSpec	Cyt-370
Albumin from chicken egg white, Ovalbumin	Sigma Aldrich	A7641