Выделение и активация мышиных лимфоцитах

Резюме

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Аннотация

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen^1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses³. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting⁴ and the investigation of proliferative abilities by ³H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling^5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Введение

Mature lymphocytes generally exist in the resting state if there is no pre-existing infection or inflammation in the individual. Therefore, it is important to retain the naïve status of lymphocytes during the isolation process before performing in vitro or in vivo functional assays. The key to ensuring consistent and reproducible results is to limit any unnecessary manipulation of the cells.

Magnetic cell sorting utilizes antibodies and microbeads to label cells so as to enrich the cell population of interest. With this approach, there are two purification strategies: positive enrichment and negative depletion. Positive enrichment enriches the cell population of interest using an antibody that binds to the target cells. Negative depletion, on the other hand, depletes non-target cells, leaving the cell population of interest. In our lab, we prefer negative depletion to positive enrichment because the binding of antibodies to the target cells could potentially alter cell features and behavior. In fact, many established cell surface markers suitable for the isolation of a particular cell population are also functional receptors.

Magnetic cell sorting not only yields highly pure populations of viable target cells, it is also less time-consuming and avoids the cellular stress induced by high-pressure flow used in fluorescence-activated cell sorting (FACS). By labeling the unwanted cell populations and depleting them using a magnetic separation column, we are able to perform rapid cell isolation without compromising the viability of the target cell population. In this protocol, we demonstrate the use of negative depletion strategies to purify naïve B cells or T cells.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

У всех мышей разводят и поддерживается при определенных патогена условиях и все протоколы мыши проводятся в соответствии с руководящими указаниями по уходу и использованию комитета Institutional животных.

1. Приготовление буферами и реагентов

1. Готовят институт Мемориальный полный Roswell Park (RPMI) среды (10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, пенициллина (100 МЕ / мл) / стрептомицин (100 мкг / мл), 55 мкМ 2-меркаптоэтанола ).
2. Подготовить 20x сбалансированный солевой раствор (BSS) Фото 1 и 2 Наличие на складе, отдельно.
   1. Подготовка 20x ПБС запас 1 (111 мМ декстроза, 8,8 мМ фосфата калия, 26,7 мМ двухосновного фосфата натрия в 1 л стерильной воды) и добавляют 40 мл 0,5% фенолового красного до 20x ПБС складе 1 до окончательной регулировки громкости. Стерильный фильтр с использованием фильтра 0,2 мкм перед хранением при 4 ° С.
   2. Подготовка 20x ПБС запас 2 (25,8 мМ дигидрат хлорида кальция, 107 мМ хлорид калия, ч 2,73 М натрияloride, 19,6 мМ хлорид магния гексагидрат, 16,6 мМ сульфата магния в 1 л стерильной воды). Стерильный фильтр с использованием фильтра 0,2 мкм перед хранением при 4 ° С.
   3. Для подготовки 1x BSS для экспериментального использования, развести 50 мл ПБС запас 1 и 50 мл ПБС запас 2, отдельно, в 400 мл стерильной воды каждый. Объединить оба разбавленные растворы, доведения рН до 7, и добавляют 20 мл FBS (2%). Долить до 1 л, используя стерильную воду и стерильный фильтр с использованием фильтра 0,2 мкм.
      Примечание: BSS исходные растворы должны быть приготовлены отдельно, поскольку смешивание концентрированных запасов РвСС непосредственно может привести к осаждению.
3. ЭРИТРОЦИТОВ (РБК) лизирующего буфера
   1. Для подготовки RBC буфер для лизиса, смешайте 9 частей хлорида аммония (сток 155 мм хлорида аммония в стерильной воде) на 1 часть акций Трис-основание (130 мМ трис (гидроксиметил) в стерильной воде, рН 7,65) перед использованием.
      Примечание: Храните стерильные исходные растворы хлорида аммония и Трис-основания при 4 ° С. Подготовить лизис бuffer свежей для обеспечения эффективного лизис эритроцитах.

2. Формирование суспензии лимфоцитов из селезенки или лимфатических узлов

Примечание: Важно, чтобы подготовить все реагенты и оборудование, необходимые для проведения эксперимента до эвтаназии мыши и генерировать одиночные клеточные суспензии лимфоцитов как можно скорее для поддержания высоких viabilities клеток.

1. Эвтаназии экспериментальная мышь путем смещения шейных позвонков или CO ₂ удушья.
   Примечание: Начиная с этого этапа и далее, все экспериментальные процедуры должны выполняться в асептических.
2. Dip всю мышь в 70% этанола, прежде чем принимать какие-либо надрезы. Удалите селезенки и лимфатических узлов асептических ^8, и поместить их в отдельные 15 мл пробирки , содержащие 5 мл ледяной RPMI / FBS (RPMI с 2% FBS) или BSS / FBS (со стадии 1.2.3).
   Примечание: Так как ПБС не позволяет создать эффективную RBC лизис, используют RPMI для приготовления селезеночной клеточной суспензии и переключения на ПБС Afteг РБК лизиса.
3. Для создания суспензии отдельных клеток из селезенки или лимфатических узлов, поместите орган (ы) между двумя кусками стерильной фильтрующей сетки 100 мкм клеток в чашке Петри, содержащую 2 мл ледяной RPMI / FBS или BSS / FBS. Используя поршень шприца емкостью 1 мл, разомните орган (ы), пока она не была разорвана на очень мелкие части.
4. Передачи клеточной суспензии в 15 мл пробирку и промыть сетчатый фильтр сетка ячейка с охлажденным льдом RPMI / FBS или ПБС / FBS. Собрать оставшуюся клеточную суспензию, добавить его в том же 15-мл пробирку, и спином вниз на 453 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант.
   Примечание: Повторное приостановить осажденные клетки слегка ударяя по пробирке с пальцами перед добавлением буфера для лизиса эритроцитов или среду на последующих стадиях.
5. Готовят при комнатной температуре (RT) RBC буфер для лизиса во время центрифугирования суспензии клеток (этап 1.3.). После того, как гранулирование клетки и удаления надосадочной жидкости, повторно приостанавливать клетки с 1 мл буфера для лизиса эритроцитов за каждые 10 ⁸ клеток. INCUBATE реакция лизиса при комнатной температуре в течение 3-4 мин.
6. Прекратить RBC лизис с 14 мл охлажденного льдом BSS / FBS и спином вниз на 453 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.

3. Очистка В- и Т-клеток

1. Очистка В-клеток
   1. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Повторное приостановить до 10 ⁸ клеток селезенки в 300 мкл BSS / FBS и добавить 50 мкл анти-CD43 магнитные микрогранулы ^9,10. Для того, чтобы удалить мертвые клетки, добавьте 30 мкл аннексина V магнитных шариков. Инкубируйте клеточной суспензии в холодильнике C 4 ° С в течение 30 мин.
2. После очистки Т-клеток
   1. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Повторное приостановить до 10 ⁸ клеток в не-T коктейль истощение клеток антител (биотинилированных антител против CD19, B220, Gr-1, ТКС-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 и CD4 или CD8 в зависимости от популяции клеток - мишеней к очищаться), разведенной 1: 200 в 200 мкл ПБС / FBS ^4,5. Выдержите суспензии клеток у4 ° С холодильником в течение 15 мин.
   2. После инкубации добавляют 10 мл раствора ПБС / FBS, чтобы промыть клетки и спином вниз на 453 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант и вновь приостановить клетки в 165 мкл ПБС / FBS с 30 мкл стрептавидин микрошариков и 15 мкл аннексина V магнитных шариков. Инкубируйте клеточной суспензии в холодильнике C 4 ° С в течение 30 мин.
      Примечание: Для того, чтобы обеспечить даже маркировка с магнитными микрогранул, инкубировать клетки с микрогранул в течение 15 мин, затем смешать клеточную суспензию осторожно коснувшись 15 мл трубки и инкубировать еще 15 минут в течение стадии 3.1.1. или 3.2.2.
3. Получение разделения колонок для очистки клеток
   1. Подготовьте неиспользуемый разделительную колонну во время микрогранулами мечения клеток (шаг 3.1.1. Или 3.2.2.). Предварительно теплая ПБС (без FBS) до комнатной температуры и используют 2 мл, чтобы вымыть и уравновешивают колонку асептически. После уравновешивания с ПБС, промытый столбец не следует допускать, чтобы высохнуть.
      Примечание: Мы используем LS Column вместо рекомендованного столбца LD из-за его повторного использования (см шаг 3.4.).
   2. После того, как маркировка с использованием магнитных шариков, добавьте 14 мл ПБС / FBS, чтобы промыть клетки и спином вниз на 453 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант и повторно приостанавливать клетки в 1-3 мл RT ПБС.
   3. Приложить стерильный 21 G иглу на кончик колонны, чтобы уменьшить скорость потока в процессе очистки. Нагрузка клеточной суспензии на уравновешенную колонку и собирают поток через содержащие очищенные клетки-мишени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте введения пузырьков в колонке во время загрузки.
   4. Промывают колонку один раз с 1 мл ПБС / FBS и собрать поток через содержащие очищенные клетки-мишени. Обновить колонку с потоком через еще раз. Собирают поток через после второй загрузки в той же 15 мл трубки.
   5. Промыть колонку 3 раза с 1 мл BSS / FBS и собрать поток через содержащий очищенные клетки-мишени. Затем добавляют 5 мл BSS / FBS к йе столбец и, с помощью ударника, промойте магнитно меченых клеток из колонны в новый 15 мл пробирку.
   6. Проверьте чистоту клеток , собранных с помощью проточной цитометрии с использованием антител , которые связываются с поверхностным антигенам очищенного В или Т - клеток ^4,5.
4. Повторное использование разделения колонок
   Примечание: В столбце LS могут быть повторно использованы до 4-х раз, не затрагивая эффективность очистки.
   1. Промывают колонку 3 раза с 5 мл фосфатно-буферным раствором (PBS) и 3 раза с 5 мл дистиллированной воды с вершины, используя поршень.
   2. Промывают колонку 5 мл 70% -ного этанола и высушивают колонку интенсивно используя воздушный кран, чтобы предотвратить накопление ржавчины в колонне.
   3. Для того, чтобы подготовить используемый столбец LS для отдельного эксперимента очистки, промывки колонки снизу вверх с 5 мл 70% этанола с помощью адаптера шприца. Затем промойте колонку снизу вверх дважды 5 мл стерильной PBS, а затем 5 мл PBS, как только из верхней части колонны. Добавить 2мл RT ПБС для уравновешивания колонки, а затем перейти к загрузке колонки меченых клеток.

4. CFSE Этикетировочное и стимулирование

Примечание: Очищенная клетки могут быть подвергнуты различным в пробирке и в естественных функциональных анализов. Здесь мы используем очищенные Т - клетки для определения Т клеточной стимуляции способности АРС ^5.

1. Предварительно теплый раствор мечение (0,1% FBS в PBS) до 37 ° С перед CFSE нагрузки.
   Примечание: Используя низкий процент FBS в PBS снижает гибель клеток во время CFSE нагрузки и сводит к минимуму потерю клеток во время центрифугирования. Тем не менее, слишком много ФБС может помешать CFSE нагрузки.
2. Вымойте очищенные клетки дважды раствором маркировки, а затем ресуспендировали в 2 х 10 ⁷ клеток / мл в подогретого раствора маркировки в 15 мл трубки.
3. Приготовьте 10 мкМ раствор CFSE (1: 500 разбавление 5 мМ CFSE исходного раствора) в подогретого раствора маркировки. Решение CFSE должнобыть свежеприготовленной каждый раз, когда для достижения оптимальной маркировки.
4. Для загрузки клеток с CFSE, добавить приостановку 1 часть клеток к 1 части 10 мкМ раствора CFSE в 15-мл пробирку и инкубировать в темноте в течение 10 мин при 37 ° С. В конечной концентрации 5 мкМ CFSE используется для обозначения 1 х 10 ⁷ клеток / мл.
5. Переверните пробирку каждые 2 мин, чтобы обеспечить однородную смесь клеток во время CFSE нагрузки.
6. Для того, чтобы остановить реакцию, добавить несколько томов ледяной полной среде RPMI и спином вниз на 453 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. При успешной загрузке CFSE, клеточный осадок появляется желтоватый.
7. Мытье CFSE загружены ячеек еще один раз с ледяной полной среде RPMI и спином вниз на 453 мкг в течение 5 мин при 4 ° С перед использованием для культивирования в пробирке или в естественных условиях стимуляции.

5. In Vitro Стимуляция

1. Подготовить 2х маточный раствор стимулов (2x раздражители основной раствор) непосредственно перед употреблением, так что 100 мкл 2х раздражители маточного раствора может быть добавлено к 100 мкл клеток до конечного объема 200 мкл на лунку в 96-луночный планшет.
2. Если пластина покрыта раздражители (IgM или CD40 для В-клеток или CD3 и CD28 для Т-клеток) требуется, разбавить стимулы в PBS и предварительно пальто культуры пластины при 4 ° С в течение ночи. В качестве альтернативы, культура пластины может быть нанесено покрытие при температуре 37 ° С в течение 1 часа в день эксперимента. Промыть пластины с нанесенным покрытием дважды PBS (Не допускайте пластины высохнуть в любое время).

Для В - клеток
Стимулы	Конечная концентрация
F (аb ') 2 козьего анти-мышиных IgM	0.6-2.4 мкг / мл
Анти-CD40 мыши мАт	0.5-2 мкг / мл
рекомбинантмыши IL-4	25 ед / мл
липополисахарид	0,1-10 мкг / мл
(LPS) из E. палочки серотипа 055: B5
Для Т - клеток
Стимулы	Конечная концентрация
Анти-CD3 (пластина с покрытием)	2-10 мкг / мл
(50 мкл / лунку для покрытия)
Анти-CD28 (пластина с покрытием)	2 мкг / мл
Рекомбинантный IL-2	40 ед / мл
PDBu (форболовыми эфир)	5-50 нг / мл
А23187 (Ионофор кальция)	250 нг / мл

Таблица 1: Концентрации раздражителей , используемых для стимуляции лимфоцитов в культуре в пробирке.

3. Для CFSE-меченых В - клеток, вновь приостановить до 3 х 10 ⁶ клеток / мл в полной среде RPMI , и культуры в трех экземплярах с 3 х 10 ⁵ клеток / лунку в 96-луночных плоскодонных пластины в течение 72 ч.
4. Для CFSE-меченных Т - клеток, повторно приостанавливать до 0,5-3 × 10 ⁶ клеток / мл в полной среде RPMI , и культуры в трех экземплярах с 0,5-3 × 10 ⁵ клеток / лунку в 96-луночные планшеты круглые нижние 48 или 72 ч ,

6. В Vivo Стимуляция

1. Для стимуляции в естественных условиях, адаптивно передачи 4 × 10 ⁶ CFSE меченных Т - клеток на мышь (внутривенно (IV) в 200 мкл PBS) в каждую MHC подобранная мыши - реципиента.
   Примечание: В этом протоколе CFSE-меченных Т-клетки могут быть перенесены с помощью адаптивно хвостовую вену или ретро-орбитальной инъекции, так как эти клетки будут домой лимфоидных органов, таких как селезенка и лимфатические узлы.
2. Призовите мышей-реципиентов один день позже с антигеном.
   ЗАМЕТКА:В этом примере мы используем овальбумина (OVA белок, 50 мкг / мышь) в качестве антигена, так как OVA-специфический, Т-клеточного рецептора (TCR) -transgenic Т-клетки адаптивно переносили в организм мышей-реципиентов. Подготовьте OVA белок в стерильной PBS и вводят 100 мкл OVA белка / PBS или PBS контроля, с помощью подкожной инъекции (SI), в каждой мыши - реципиента ^5.
3. Урожай и генерировать одиночные клеточные суспензии из лимфоидных органов (лимфатических узлов и селезенки) мышей-реципиентов через 3 дня после иммунизации белком OVA или PBS. Отдельные лимфатические узлы в проксимальных лимфатические узлы (злотый), которая включает в себя подмышечные, плечевой и поверхностные шейные лимфатические узлы) и дистальные лимфатические узлы (дина), которая включает в себя брыжеечных, подколенные, паховые, поясничного отдела позвоночника, и хвостовые лимфатических узлов. Пятно клетки с использованием соответствующих антител FACS для проверки пролиферации Т-клеток.
   Примечание: В этом CFSE клеток эксперимента слежения, CFSE-меченных Т-клетки из PBS-инъекции у контрольных мышей установить базовые флуоресценции для не-диviding клетки. Деление клеток пролиферирующих, стимулированных антигеном, CFSE-меченые клетки визуализируют путем измерения флуоресценции пиков ^12,13. С помощью контрольной среде ФБР, количество клеточных делений пролиферирующих, CFSE меченных Т - клетки могут быть определены ^12,13.
4. Анализировать данные пролиферации клеток с CFSE меченных путем сравнения количества клеточных делений или пиков между образцами (рисунки 1 и 2).
   Примечание: Например, CFSE-меченого, OVA-специфические Т - клетки , перенесенные в организм адоптивно мышей - реципиентов , получавших антиген OVA претерпит активной пролиферации по сравнению с PBS , вводили мышам ^5,12 управления. Кроме того, следует отметить , указать на то , что существует множество способов анализа данных клеточной пролиферации CFSE, как показали Хокинс и его коллегами ^14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Очистка магнитной ячейки лимфоцитов позволяет очистить популяцию клеток-мишеней в относительно короткий промежуток времени. Используя наш протокол истощения, мы смогли увеличить процент CD8 Т-клеток (OT-I в рекомбинацией активации гена-1 (КГР-1) дефицитных мышей) от 72,8% (д...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе, мы демонстрируем процедуру очистки лимфоцитов из лимфоидных органов. очистка клеток с помощью магнитной сортировки шарик представляет собой быстрый и простой метод, который дает жизнеспособные, высоко очищенные клетки-мишени.

Критические шаги в рамка?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
RPMI 1640 (without L-Glutamine)	Gibco	31870025
Fetal Bovine Serum			Heat inactivated
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140114
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-CD43 magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-801	Mix well prior use
Streptavidin microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101	Mix well prior use
Anti-Annexin V magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-090-201	Mix well prior use
MACS LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
96-well U-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	650180
96-well F-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	655180
100 μm cell strainer mesh			To sterilize using UV radiation prior use
0.2 μm  sterile disposable filter units	Nalgene	567-0020	Can be substituted with any sterile filter device
CellTrace Violet	Invitrogen	C34557	CTV for short; alternative to CFSE
CellTrace Yellow	Invitrogen	C34567	CTY for short; alternative to CFSE
CellTrace Far Red	Invitrogen	C34564	CTFR for short; alternative to CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor 670	eBioscience	65-0840	CPD670 for short; alternative to CFSE
PKH26	Sigma Aldrich	PKH26GL	PKH26, alternative to CFSE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Dextrose	Sigma Aldrich	G7021
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5655
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S5136
Phenol Red	Sigma Aldrich	P0290
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Sodium chloride	Merck Millipore	S7653	Can use from other sources
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Tris-base
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Molecular Probes	C-1157	Reconstitute in DMSO
Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)	Sigma Aldrich	P1269
A23187 (Calcium ionophore)	Sigma Aldrich	C7522
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and recombinant protein
CD11b biotin (clone m1/70)	Biolegend	101204	T cell depletion cocktail
CD11c biotin (clone N418)	Biolegend	117304	T cell depletion cocktail
Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)	Biolegend	108404	T cell depletion cocktail
Ter119 biotin (clone Ter119)	Biolegend	116204	T cell depletion cocktail
TCR-γδ biotin (clone GL-3)	Biolegend	118103	T cell depletion cocktail
CD19 biotin (clone 6D5)	Biolegend	115504	T cell depletion cocktail
B220 biotin (clone RA3-6B2)	Biolegend	103204	T cell depletion cocktail
CD49b biotin (clone DX5)	Biolegend	108904	T cell depletion cocktail
CD4 biotin (clone GK1.5)	Biolegend	100404	T cell depletion cocktail
CD8 biotin (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	T cell depletion cocktail
F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated)	Jackson ImmunoResearch	115-006-075	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-mouse CD40 mAb (plate coated)	Pharmingen	553722	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-4	ProSpec	Cyt-282
LPS from E. coli Serotype 055:B5	Sigma Aldrich	L-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated)	eBioscience	16-0037-85	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)	eBioscience	16-0281-85	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-2	ProSpec	Cyt-370
Albumin from chicken egg white, Ovalbumin	Sigma Aldrich	A7641