単離とマウスリンパ球の活性化

要約

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

要約

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen^1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses³. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting⁴ and the investigation of proliferative abilities by ³H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling^5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

概要

Mature lymphocytes generally exist in the resting state if there is no pre-existing infection or inflammation in the individual. Therefore, it is important to retain the naïve status of lymphocytes during the isolation process before performing in vitro or in vivo functional assays. The key to ensuring consistent and reproducible results is to limit any unnecessary manipulation of the cells.

Magnetic cell sorting utilizes antibodies and microbeads to label cells so as to enrich the cell population of interest. With this approach, there are two purification strategies: positive enrichment and negative depletion. Positive enrichment enriches the cell population of interest using an antibody that binds to the target cells. Negative depletion, on the other hand, depletes non-target cells, leaving the cell population of interest. In our lab, we prefer negative depletion to positive enrichment because the binding of antibodies to the target cells could potentially alter cell features and behavior. In fact, many established cell surface markers suitable for the isolation of a particular cell population are also functional receptors.

Magnetic cell sorting not only yields highly pure populations of viable target cells, it is also less time-consuming and avoids the cellular stress induced by high-pressure flow used in fluorescence-activated cell sorting (FACS). By labeling the unwanted cell populations and depleting them using a magnetic separation column, we are able to perform rapid cell isolation without compromising the viability of the target cell population. In this protocol, we demonstrate the use of negative depletion strategies to purify naïve B cells or T cells.

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プロトコル

全てのマウスを交配させ、特定の病原体を含まない条件下で維持し、すべてのマウスプロトコルは、施設内動物管理使用委員会のガイドラインに従って行われています。

緩衝液および試薬の調製

1. 、55μM2-メルカプトエタノールを完全ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地（10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）、2mM L-グルタミン、ペニシリン（100 IU / ml）を/ストレプトマイシン（100μg/ ml）を準備します）。
2. これとは別に、20倍の平衡塩類溶液（BSS）ストック1およびストック2を準備します。
   1. 20倍BSSストック1（1 Lの滅菌水で111 mMのブドウ糖、8.8 mMリン酸カリウム、26.7 mMのリン酸ナトリウム二塩基性）を準備し、最終容量調整前の20倍BSSストック1に40ミリリットルの0.5％フェノールレッドを追加します。 4℃で保存する前に、0.2μmのフィルターを用いて滅菌濾過します。
   2. 20X BSSストック2（25.8 mMの塩化カルシウム二水和物、107 mMの塩化カリウム、2.73 MナトリウムCHを準備loride、19.6 mMの塩化マグネシウム六水和物、1 Lの滅菌水で16.6 mMの硫酸マグネシウム）。 4℃で保存する前に、0.2μmのフィルターを用いて滅菌濾過します。
   3. 400ミリリットル滅菌水それぞれに、別々に、50ミリリットルBSSストック1と50ミリリットルBSSストック2を希釈し、実験的な使用のために1X BSSを準備します。 、両方の希釈液を組み合わせてpHを7に調整し、20ミリリットルのFBS（2％）を追加します。 0.2μmのフィルターを用いて滅菌水と滅菌フィルターを使用して1 Lまでトップ。
      注：濃厚BSSストックの混合が直接析出につながる可能性があるため、BSSストック溶液を別途準備する必要があります。
3. 赤血球（RBC）溶解バッファー
   1. RBC溶解緩衝液を調製するために、使用前に1部株式トリス塩基（滅菌水中の130mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、pHは7.65）に9部ストック塩化アンモニウム（滅菌水中の155 mMの塩化アンモニウム）を混合します。
      注：4℃で塩化アンモニウムおよびトリスベースのストア滅菌ストック溶液。溶解bを準備しますRBCの効率的な溶解を確実にするために、新鮮なuffer。

脾臓またはリンパ節からリンパ球懸濁液の2世代

注：マウスの安楽死の前に、実験に必要な全ての試薬および装置を準備して、高い細胞生存率を維持するために、できるだけ早くリンパ球の単一細胞懸濁液を生成することが重要です。

1. 頸椎脱臼またはCO ₂窒息により実験マウスを安楽死させます。
   注：これ以降のステップで、すべての実験手順は、無菌的に行うべきです。
2. 任意の切開を行う前に、70％エタノールにマウス全体を浸し。無菌的に⁸脾臓およびリンパ節を削除し、（ステップ1.2.3から）5ミリリットルの氷冷RPMI / FBS（2％FBSを含むRPMI）やBSS / FBSを含む別の15ミリリットルチューブに配置します。
   注：BSSは、効率的なRBC溶解を防止するため、脾細胞懸濁液を調製するためのRPMIを使用しAFTE BSSに切り替えますRBC溶解をrは。
3. 2ミリリットルの氷冷RPMI / FBSまたはBSS / FBSを含むペトリ皿に無菌100μmのセルストレーナーメッシュの2枚の間に臓器（複数可）を置き、脾臓またはリンパ節からの単一細胞懸濁液を生成するには。それは非常に細かい部分に引き裂かれるまで1mlシリンジのプランジャーを用いて、器官（複数可）をマッシュ。
4. 15ミリリットルチューブに細胞懸濁液を移し、セルストレーナーを氷冷RPMI / FBSまたはBSS / FBSでメッシュ洗います。 、残りの細胞懸濁液を収集し、同じ15 mlチューブに追加し、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。上清を取り除きます。
   注：後続のステップでRBC溶解緩衝液または培地を添加する前に、指でチューブをフリックすることによりペレット化した細胞を再懸濁します。
5. 細胞懸濁液の遠心分離中に室温（RT）RBC溶解バッファーを準備し（ステップ1.3を参照してください。）。細胞をペレット化し、上清を除去した後、すべての10 ⁸個^の細胞1mlのRBC溶解緩衝液を用いて細胞を再懸濁します。 IncuBATE 3-4分間室温で溶解反応。
6. 14ミリリットルの氷冷BSS / FBSを停止RBC溶解し、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。

B及びT細胞の3精製

1. B細胞の精製
   1. 血球計数器を用いて細胞を数えます。 300μlのBSS / FBSで最大10 ⁸脾臓細胞を再懸濁し、50μlの抗CD43に磁性マイクロビーズ^9,10を追加^します。 、死んだ細胞を除去30μlのアネキシンV磁気ビーズを追加します。 30分間、4℃の冷蔵庫中の細胞懸濁液をインキュベートします。
2. T細胞の精製
   1. 血球計数器を用いて細胞を数えます。再懸濁し、標的細胞集団に応じて非T細胞枯渇抗体カクテルで10 ⁸細胞CD19、B220、GR-1、TCR-γδ、CD49b、CD11cの、のCD11b、TER119およびCD4またはCD8に対する（ビオチン化抗体まで/ FBS ^4,5200μlのBSSに200：）精製され、1に希釈しました。中の細胞懸濁液をインキュベート15分間、4℃の冷蔵庫。
   2. インキュベーション後、細胞を洗浄し、4℃で5分間、453×gでスピンダウンする10ミリリットルBSS / FBSを追加します。上清を除去し、30μlのストレプトアビジンマイクロビーズおよび15μlのアネキシンV磁気ビーズを165μlのBSS / FBS中で細胞を再懸濁します。 30分間、4℃の冷蔵庫中の細胞懸濁液をインキュベートします。
      注：、あっても磁性マイクロビーズで標識することを確認し、15分間マイクロビーズを用いて細胞をインキュベートし、その後、15ミリリットルチューブをタッピングにより穏やかに細胞懸濁液を混合し、ステップ3.1.1の間に、別の15分間インキュベートします。または3.2.2。
3. 細胞精製のための分離カラムの調製
   1. 細胞のマイクロビーズ標識の中に未使用の分離カラムを準備する（ステップ3.1.1。または3.2.2。）。 RTへ（FBSなし）プリ暖かいBSSと無菌的にカラムを洗浄し、平衡化するために2ミリリットルを使用しています。 BSSで平衡化した後、洗浄し、カラムを乾燥させてはなりません。
      注：私たちはLS cを使用しますolumn代わりに推奨されるLDの列の、その再利用性に（ステップ3.4を参照してください。）。
   2. 磁気ビーズで標識した後、細胞を洗浄し、4℃で5分間、453×gでスピンダウンする14ミリリットルBSS / FBSを追加します。上清を除去し、1-3で細胞ミリリットルRT BSSを再サスペンド。
   3. 精製のプロセスの間に流量を減らすために、カラムの先端に滅菌21 Gの針を取り付けます。平衡化したカラムに細胞懸濁液をロードし、精製された標的細胞を含有するフロースルーを集めます。
      注：ロード中にカラムに気泡を導入することは避けてください。
   4. 1ミリリットルBSS / FBSで一回カラムを洗浄し、精製された標的細胞を含有するフロースルーを集めます。再び通る流れでカラムをリロードします。同じ15ミリリットルチューブ内の第二の負荷後のフロースルーを収集します。
   5. 1ミリリットルBSS / FBSでカラムを3回洗浄し、精製された標的細胞を含有するフロースルーを集めます。その後、目に5ミリリットルBSS / FBSを追加電子カラムと、プランジャーと、新しい15ミリリットルチューブにカラムから磁気標識された細胞を洗い流します。
   6. 精製されたBまたはT細胞^4,5の表面抗原に結合する抗体を用いたフローサイトメトリーによって収集された細胞の純度を確認してください。
4. 分離カラムを使用して再
   注：LSカラムは、浄化効率に影響を与えることなく、4回まで再利用することができます。
   1. プランジャーを使用して上から水を5mlの蒸留で5 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回カラムを3回洗浄します。
   2. 5ミリリットル70％エタノールでカラムを洗浄し、カラムに錆の蓄積を防ぐために空気タップを使用して広範囲にカラムを乾燥。
   3. 個別の精製実験のために使用されるLSカラムを準備するには、シリンジアダプタを使用して、5ミリリットル、70％エタノールで下から上カラムを洗浄。次に、5ミリリットル一度列の先頭からPBSに続いて5ミリリットル滅菌PBSで2回ボトムアップからカラムを洗浄。 2を追加します。ミリリットルRT BSSは、カラムを平衡化した後、標識された細胞でカラムをロードするに進みます。

4. CFSE標識および刺激

注：精製細胞は、in vitroでの様々なおよびインビボ機能アッセイにかけることができます。ここでは、APCは⁵のT細胞刺激能を決定するために、精製されたT細胞を使用します。

1. 37°Cの前CFSEをロードする前暖かい標識溶液（PBS中0.1％FBS）。
   注：PBS中のFBSの低い割合を使用すると、CFSEのロード中に細胞死を減少させ、遠心分離中の細胞損失を最小限に抑えることができます。しかし、あまりにも多くのFBSはCFSEのロードを妨げる可能性があります。
2. 標識溶液で2回精製した細胞を洗浄し、15mlチューブ中の予め温めた標識溶液中で2×10 ⁷細胞/ mlで再懸濁しました。
3. 予め温めておいた標識溶液中で：（5 mMのCFSEストック溶液の500倍希釈）10μMのCFSE溶液を調製します。 CFSEソリューションべきたて最適なラベリングを達成するたびに調製すること。
4. CFSEで細胞をロードするには、15 mlチューブで1部10μMのCFSE溶液に1部の細胞懸濁液を追加し、37℃で10分間、暗所でインキュベートします。 5μMのCFSEの最終濃度は、1×10 ⁷細胞/ mlを標識するために使用されます。
5. CFSEのロード中に細胞の均質な混合物を確実にするためにチューブを2分ごとに反転します。
6. 反応を停止するには、氷のように冷たい完全RPMI培地の複数のボリュームを追加し、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。成功したCFSEのロード時に、細胞ペレットを、黄色がかった表示されます。
7. ウォッシュCFSEは氷のように冷たい完全RPMI培地で細胞を1より多くの時間をロードされ、in vitroでの培養のためにまたはインビボ刺激に使用する前に、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。

5. in vitro刺激

1. 使用直前に2倍の刺激のストック溶液（2×刺激原液）を調製10となるよう2X刺激原液0μlを96ウェルプレート中のウェルあたり200μlの最終容積に細胞100μlを添加することができます。
2. （B細胞またはT細胞のためのCD3およびCD28のためにIgMまたはCD40）の刺激でコーティングされたプレートが必要な場合は、4℃で一晩PBSで刺激し、プレコート培養プレートを希釈します。代替的に、培養プレートは、実験の当日に1時間37℃でコーティングすることができます。 （プレートは任意の時点で乾燥させないでください）PBSで2回コーティングしたプレートを洗浄します。

B細胞について
刺激	最終濃度
F（ab '）2ヤギ抗マウスIgM	0.6から2.4 / mlの
抗マウスCD40モノクローナル抗体	0.5 / mlの
組み換え体マウスIL-4	25 U / mlの
リポ多糖類	0.1 / mlの
E.から（LPS） 大腸菌血清型055：B5
T細胞のための
刺激	最終濃度
抗CD3（プレートコーティングされました）	2-10 / mlの
（50μL/ウェルコーティング用）
抗CD28（プレートコーティングされました）	2 / mlの
組換えIL-2	40 U / mlの
PDBu（ホルボールエステル）	5-50 ng / mlで
A23187（カルシウムイオノフォア）	250 ng / mlで

表1： インビトロ培養中のリンパ球を刺激するために使用される刺激の濃度。

3. CFSE標識B細胞の場合は、3×10 ⁵細胞/ウェルで96ウェルの72時間平底プレート三連で完全RPMI培地と培養3×10 ⁶細胞/ mlに再懸濁します。
4. CFSE標識T細胞を、0.5~3×10 ⁵細胞で三重で完全RPMI培地及び培養中の0.5-3×10 ⁶細胞/ mlに再懸濁/ウェルで48または72時間、96ウェル丸底プレート。

6. インビボ刺激

1. in vivoでの刺激、各MHC適合レシピエントマウスに養子移入（200μlのPBS中の静脈内（IV））マウスあたり4×10 ⁶ CFSE標識T細胞について。
   注：このプロトコルでは、CFSE標識T細胞は、養子意志家など脾臓およびリンパ節などのリンパ器官へのこれらの細胞のように尾静脈または眼窩後注射を使用して転送することができます。
2. 1日後に抗原とレシピエントマウスに挑戦。
   注意：OVA特異的T細胞受容体（TCR） - トランスジェニックT細胞を養子レシピエントマウスに移したため、この例では、我々は、抗原としてオボアルブミン（OVAタンパク質を50μg/マウス）を使用します。滅菌PBSでOVAタンパク質を準備し、各レシピエントマウス⁵に、皮下注射（SI）を経由して、OVAタンパク質/ PBSまたはPBS対照の100μLを注入します。
3. 収穫し、3日間OVAタンパク質またはPBSで免疫した後、レシピエントマウスのリンパ器官（リンパ節および脾臓）からの単一細胞懸濁液を生成します。腸間膜、膝窩、鼠径部、腰部、および尾部リンパ節を含んで腋窩、上腕および表在性頸部リンパ節を含んで近位リンパ節（PLN）、）および遠位リンパ節（DLN）への個別のリンパ節、。 T細胞の増殖を確認するために、適切なFACS抗体を用いて染色細胞。
   注：このCFSE細胞追跡実験において、PBSを注射した対照マウスからのCFSE標識T細胞は非 - ジのベースライン蛍光を確立します細胞をviding。増殖の細胞分裂は、抗原刺激、CFSE標識細胞は、蛍光ピーク^12,13を測定^することによって可視化されます。 PBSコントロールで、増殖の細胞分裂の数は、CFSE標識T細胞は^、12,13を決定することができます。
4. サンプル間の細胞分裂またはピーク数を比較することによって、CFSE標識細胞増殖データを分析した （ 図1及び2）。
   注：例えば、養子OVA抗原を受けたレシピエントマウスに移しCFSE標識、OVA特異的T細胞は、PBS注射コントロールマウス^5,12に比べて活発な増殖を受けます。また、ホーキンスら¹⁴により示されるようにCFSE細胞増殖データを分析するための多くの方法が存在することを指摘することは注目に値します。

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結果

リンパ球の磁性細胞精製は、ユーザが比較的短い時間で、標的細胞集団を精製することができます。我々の枯渇のプロトコルを用いて、精製した後、94.2％（に72.8％（前の精製）から（組換え活性化遺伝子1（RAG-1）欠損マウスにおけるOT-I）CD8 T細胞の割合を増加させることができました。 図^1A）4,5。これらの精製されたリンパ球は、その後、リン?...

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ディスカッション

このプロトコルでは、我々は、リンパ器官からのリンパ球を精製するための手順を示します。磁気ビーズ選別を用いた細胞の精製は、実行可能な、高度に精製された標的細胞をもたらす迅速かつ簡単な方法です。

プロトコル内の重要なステップ

細胞生存率および細胞収量

in vitroで造血系細胞の生存率を維持す?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
RPMI 1640 (without L-Glutamine)	Gibco	31870025
Fetal Bovine Serum			Heat inactivated
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140114
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-CD43 magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-801	Mix well prior use
Streptavidin microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101	Mix well prior use
Anti-Annexin V magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-090-201	Mix well prior use
MACS LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
96-well U-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	650180
96-well F-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	655180
100 μm cell strainer mesh			To sterilize using UV radiation prior use
0.2 μm  sterile disposable filter units	Nalgene	567-0020	Can be substituted with any sterile filter device
CellTrace Violet	Invitrogen	C34557	CTV for short; alternative to CFSE
CellTrace Yellow	Invitrogen	C34567	CTY for short; alternative to CFSE
CellTrace Far Red	Invitrogen	C34564	CTFR for short; alternative to CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor 670	eBioscience	65-0840	CPD670 for short; alternative to CFSE
PKH26	Sigma Aldrich	PKH26GL	PKH26, alternative to CFSE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Dextrose	Sigma Aldrich	G7021
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5655
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S5136
Phenol Red	Sigma Aldrich	P0290
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Sodium chloride	Merck Millipore	S7653	Can use from other sources
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Tris-base
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Molecular Probes	C-1157	Reconstitute in DMSO
Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)	Sigma Aldrich	P1269
A23187 (Calcium ionophore)	Sigma Aldrich	C7522
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and recombinant protein
CD11b biotin (clone m1/70)	Biolegend	101204	T cell depletion cocktail
CD11c biotin (clone N418)	Biolegend	117304	T cell depletion cocktail
Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)	Biolegend	108404	T cell depletion cocktail
Ter119 biotin (clone Ter119)	Biolegend	116204	T cell depletion cocktail
TCR-γδ biotin (clone GL-3)	Biolegend	118103	T cell depletion cocktail
CD19 biotin (clone 6D5)	Biolegend	115504	T cell depletion cocktail
B220 biotin (clone RA3-6B2)	Biolegend	103204	T cell depletion cocktail
CD49b biotin (clone DX5)	Biolegend	108904	T cell depletion cocktail
CD4 biotin (clone GK1.5)	Biolegend	100404	T cell depletion cocktail
CD8 biotin (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	T cell depletion cocktail
F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated)	Jackson ImmunoResearch	115-006-075	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-mouse CD40 mAb (plate coated)	Pharmingen	553722	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-4	ProSpec	Cyt-282
LPS from E. coli Serotype 055:B5	Sigma Aldrich	L-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated)	eBioscience	16-0037-85	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)	eBioscience	16-0281-85	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-2	ProSpec	Cyt-370
Albumin from chicken egg white, Ovalbumin	Sigma Aldrich	A7641