Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

Resumo

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Resumo

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen^1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses³. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting⁴ and the investigation of proliferative abilities by ³H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling^5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Introdução

Mature lymphocytes generally exist in the resting state if there is no pre-existing infection or inflammation in the individual. Therefore, it is important to retain the naïve status of lymphocytes during the isolation process before performing in vitro or in vivo functional assays. The key to ensuring consistent and reproducible results is to limit any unnecessary manipulation of the cells.

Magnetic cell sorting utilizes antibodies and microbeads to label cells so as to enrich the cell population of interest. With this approach, there are two purification strategies: positive enrichment and negative depletion. Positive enrichment enriches the cell population of interest using an antibody that binds to the target cells. Negative depletion, on the other hand, depletes non-target cells, leaving the cell population of interest. In our lab, we prefer negative depletion to positive enrichment because the binding of antibodies to the target cells could potentially alter cell features and behavior. In fact, many established cell surface markers suitable for the isolation of a particular cell population are also functional receptors.

Magnetic cell sorting not only yields highly pure populations of viable target cells, it is also less time-consuming and avoids the cellular stress induced by high-pressure flow used in fluorescence-activated cell sorting (FACS). By labeling the unwanted cell populations and depleting them using a magnetic separation column, we are able to perform rapid cell isolation without compromising the viability of the target cell population. In this protocol, we demonstrate the use of negative depletion strategies to purify naïve B cells or T cells.

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Protocolo

Todos os ratos são criados e mantidos sob condições específicas livres de patógenos e todos os protocolos do mouse são conduzidos de acordo com as diretrizes da Comissão Cuidado e Uso Institucional Animal.

1. Preparação de Tampões e reagentes

1. Prepare completa do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio (10% de soro inactivado por calor de bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, penicilina (100 UI / mL) / estreptomicina (100 ug / ml), 55 uM de 2-mercaptoetanol ).
2. Prepare 20x solução salina equilibrada (BSS) Stock 1 e da 2, separadamente.
   1. Prepare 20x BSS Estoque 1 (111 mM dextrose, fosfato de potássio 8,8 mM, 26,7 mM fosfato de sódio dibásico em 1 L de água esterilizada) e adicionar 40 ml de 0,5% Fenol Vermelho 20x estoque BSS 1 antes do ajuste de volume final. Filtrar em condições estéreis através de filtro de 0,2 um antes de armazenar a 4 ° C.
   2. Prepare 20x BSS stock 2 (25,8 mM de cloreto de cálcio di-hidratado, cloreto de potássio 107 mM, ch de sódio 2,73 Mloride, 19,6 mM de cloreto de magnésio hexa-hidratado, sulfato de magnésio 16,6 mM em 1 L de água estéril). Filtrar em condições estéreis através de filtro de 0,2 um antes de armazenar a 4 ° C.
   3. Para preparar 1x BSS para uso experimental, diluir 50 ml BSS Estoque 1 e 50 ml da BSS 2, separadamente, em 400 ml de água estéril cada. Combinar as duas soluções diluídas, ajustar até pH 7, e adicionar 20 ml de FBS (2%). Topo até 1 L com água estéril e filtro estéril usando 0,2 m de filtro.
      NOTA: soluções de BSS devem ser preparados separadamente, pois a mistura de stocks BSS concentradas diretamente pode resultar em precipitação.
3. Glóbulo Vermelho (RBC) Tampão de Lise
   1. Para preparar tampão de lise dos glóbulos vermelhos, mistura 9 partes de cloreto de estoque de amónio (cloreto de amónio 155 mM em água esterilizada) para uma parte da base Tris (130 mM de Tris (hidroximetil) -aminometano em água estéril, pH 7,65) antes do uso.
      NOTA: Loja soluções de estéreis de cloreto de amônio e Tris-base a 4 ° C. Prepare lise bpode ser prejudicado fresco para assegurar a lise eficiente de hemácias.

2. Geração de Linfócitos suspensão de baço ou gânglios linfáticos

NOTA: É importante para preparar todos os reagentes e equipamentos necessários para a experiência antes da eutanásia do rato e para gerar suspensões de células únicas de linfócitos tão rapidamente quanto possível para manter as viabilidades celulares elevadas.

1. Euthanize rato experimental por deslocamento cervical ou CO ₂ asfixia.
   NOTA: A partir desta etapa em diante, todos os procedimentos experimentais devem ser realizados de forma asséptica.
2. Mergulhe o rato inteiro em 70% de etanol antes de fazer qualquer incisões. Remover os gânglios linfáticos e do baço assepticamente ^8, e colocá-los em separadas tubos de 15 ml contendo 5 ml de gelo-frio RPMI / FBS (meio RPMI com SFB a 2%) ou BSS / FBS (a partir do passo 1.2.3).
   NOTA: Uma vez que BSS impede eficiente lise RBC, use RPMI para a preparação da suspensão de células do baço e mudar para BSS aftelise r RBC.
3. Para gerar uma suspensão de células isoladas a partir do baço ou nodos linfáticos, colocar o órgão (s) entre duas peças de estéril de malha 100 uM coador de células numa placa de Petri contendo 2 ml de gelo-frio RPMI / FBS ou BSS / FBS. Usando o êmbolo de uma seringa de 1 ml, triturar o órgão (s) até que tenha sido rasgada em partes muito finas.
4. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e lava-se o filtro de células de malha com gelada RPMI / FBS ou BSS / FBS. Recolhe-se o restante suspensão de células, adicioná-lo para o mesmo tubo de 15 ml, e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante.
   NOTA: Re-suspender as células peletizadas sacudindo o tubo com os dedos antes de adicionar tampão de lise RBC ou médio nas etapas subsequentes.
5. Preparar tampão de lise temperatura ambiente (RT) RBC durante a centrifugação da suspensão de células (ver passo 1.3.). Após a peletização das células e remoção do sobrenadante, re-suspender as células com 1 ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos para cada 10 ⁸ células. incuBATE a reacção de lise à TA durante 3-4 min.
6. Pare a lise de RBC com 14 ml de gelo-BSS frio / FBS e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C.

3. Purificação de células B e T

1. A purificação de células B
   1. Contar as células usando um hemocitômetro. Re-suspender até 10 ⁸ células esplênicas em 300 ul BSS / FBS e adicionar 50 ul anti-CD43 microesferas magnéticas ^9,10. Para remover as células mortas, adicionar 30 ul anexina V esferas magnéticas. Incubar a suspensão de células num frigorífico a 4 ° C durante 30 min.
2. Purificação de células T
   1. Contar as células usando um hemocitômetro. Re-suspender-se a 10 ⁸ células em não-T cocktail de anticorpos de depleção de células (anticorpos biotinilados contra CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 e CD4 ou CD8, dependendo da população de células alvo para ser purificado), diluído 1: 200 em 200 ul BSS / FBS a ^4,5. Incubar a suspensão de células numa4 ° C frigorífico durante 15 min.
   2. Após incubação, adicionam-se 10 ml de BSS / FBS para lavar as células e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 165 ul de BSS / FBS a 30 com micro-esferas de estreptavidina ul e 15 ul anexina V esferas magnéticas. Incubar a suspensão de células num frigorífico a 4 ° C durante 30 min.
      NOTA: Para assegurar mesmo marcação com as microesferas magnéticas, incubar as células com microesferas durante 15 minutos, em seguida, misturar a suspensão de células suavemente batendo no tubo de 15 ml e incubar mais 15 minutos durante o passo 3.1.1. ou 3.2.2.
3. Preparação da coluna de separação para a purificação celular
   1. Prepara-se uma coluna de separação não utilizada, durante a etiquetagem micropérola das células (passo 3.1.1. Ou 3.2.2.). Pré-aquecido BSS (sem FBS) à temperatura ambiente e utilizar 2 ml de lavar e equilibrar a coluna em condições assépticas. Após o equilíbrio com BSS, a coluna lavada não devem ser deixadas a secar fora.
      NOTA: Nós usamos os LS column em vez da coluna LD recomendada, devido à sua possibilidade de reutilização (ver passo 3.4.).
   2. Após marcação com as esferas magnéticas, adicionar 14 ml de BSS / FBS para lavar as células e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e re-suspender as células em 1-3 ml RT BSS.
   3. Anexar uma agulha estéril 21 L para a ponta da coluna de reduzir a taxa de fluxo durante o processo de purificação. Carregar a suspensão de células na coluna equilibrada e recolher o fluxo através contendo as células alvo purificados.
      Nota: Evite a introdução de bolhas na coluna durante o carregamento.
   4. Lava-se a coluna uma vez com 1 ml de BSS / FBS e recolher o fluxo através contendo as células alvo purificados. Recarregar a coluna com o fluxo através de uma vez. Recolhe-se o fluxo através após a segunda carga no mesmo tubo de 15 ml.
   5. Lavar a coluna 3 vezes com 1 ml de BSS / FBS e recolher o fluxo através contendo as células alvo purificados. Depois disso, adicionar 5 ml de BSS / FBS a the coluna e, com um êmbolo, lave as células magneticamente marcadas para fora da coluna para um novo tubo de 15 ml.
   6. Verifique a pureza das células recolhidas por citometria de fluxo utilizando anticorpos que se ligam a antigénios purificados de células T ^4,5 B ou superfície.
4. Re-usando a coluna de separação
   NOTA: A coluna LS pode ser reutilizado até 4 vezes sem afectar a eficiência da purificação.
   1. Lavar a coluna 3 vezes com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 3 vezes com 5 ml de água destilada a partir do topo usando o êmbolo.
   2. Lavar a coluna com 5 ml de etanol a 70% e seca-se a coluna extensivamente usando uma torneira de ar para evitar a formação de ferrugem na coluna.
   3. Para preparar uma coluna LS usado para uma experiência de purificação separada, lavar a coluna de baixo para cima com 5 ml de etanol a 70% utilizando o adaptador de seringa. Em seguida, lava-se a coluna a partir de baixo para cima duas vezes com 5 ml de PBS estéril, seguido de 5 ml de PBS, uma vez a partir do topo da coluna. Adicionar 2ml RT BSS para equilibrar a coluna e depois prosseguir para carregar a coluna com células marcadas.

4. CFSE Labeling e Estimulação

NOTA: Purificado células podem ser submetidas a uma variedade de ensaios in vitro e em ensaios funcionais in vivo. Aqui, utilizamos células T purificadas para determinar a capacidade de estimulação de célula T de APCs ^5.

1. solução pré-aquecido rotulagem (0,1% de FBS em PBS) a 37 ° C antes do carregamento CFSE.
   NOTA: Usando uma baixa percentagem de FBS em PBS reduz a morte celular durante CFSE carga e minimiza a perda de células durante a centrifugação. No entanto, muito FBS pode interferir com carga CFSE.
2. Lavar as células purificadas duas vezes com solução de rotulagem, em seguida, re-suspensas a 2 x 10 ⁷ células / ml na solução de marcação pré-aquecido em um tubo de 15 ml.
3. Preparar solução de 10 uM CFSE (diluição 1: 500 de CFSE 5 mM de solução de reserva) em solução de etiquetagem pré-aquecido. solução CFSE deveser preparada a cada vez para alcançar rotulagem ideal.
4. Para carregar as células com CFSE, adicionar uma suspensão de células parte para 1 parte de solução de 10 uM CFSE em um tubo de 15 ml e incuba-se no escuro durante 10 min a 37 ° C. Uma concentração final de 5 uM CFSE é utilizado para marcar 1 x 10 ⁷ células / ml.
5. Inverter o tubo a cada dois minutos para assegurar uma mistura homogénea de células durante o carregamento CFSE.
6. Para parar a reacção, adicionar vários volumes de meio RPMI completo gelada e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Após o bem sucedido CFSE carregamento, o sedimento celular aparece amarelado.
7. Lavar as células CFSE carregado mais uma vez com meio RPMI completo gelada e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C antes de utilizar para a cultura in vitro ou in vivo estimulação.

5. estimulação in vitro Em

1. Preparar uma solução 2x estoque de estímulos (2x estímulos solução estoque) imediatamente antes da utilização de modo a que 100 ul de solução de estoque 2x estímulos pode ser adicionada a 100 ul de células até um volume final de 200 ul por poço numa placa de 96 poços.
2. Se é necessária uma placa revestida com estímulos (IgM ou CD40 para células B ou CD3 e CD28 para as células T), dilui-se os estímulos em PBS e pré-revestimento da placa de cultura a 4 ° C durante a noite. Em alternativa, a placa de cultura podem ser revestidos a 37 ° C durante 1 hora no dia da experiência. Lave a placa revestida duas vezes com PBS (Não permita que o prato para secar a qualquer momento).

Para as células B
estímulos	A concentração final
F (ab ') 2 de cabra anti-IgM de ratinho	0,6-2,4 ug / ml
Anti-ratinho CD40 mAb	0,5-2 ug / ml
recombinanterato IL-4	25 U / ml
lipopolissacarídeo	0,1-10 ug / ml
(LPS) de E. coli serotipo 055: B5
Para as células T
estímulos	A concentração final
Anti-CD3 (placa revestida)	2-10 ug / ml
(50 ul / poço para o revestimento)
Anti-CD28 (placa revestida)	2 ug / mL
IL-2 recombinante	40 U / ml
PDBu (éster de forbol)	5-50 ng / ml
A23187 (ionóforo de cálcio)	250 ng / mL

Quadro 1: Concentrações de estímulos utilizados para estimular os linfócitos em cultura in vitro.

3. Para as células B CFSE-rotulados, re-suspender a 3 X 10 ⁶ células / ml em meio RPMI completo e a cultura em triplicado com 3 x 10 ⁵ células / poço em placas de 96 poços de fundo plano, durante 72 h.
4. No caso de células T marcadas com CFSE-, re-suspender a 0,5-3 x 10 ⁶ células / ml em meio RPMI completo e a cultura em triplicado com 0,5-3 x 10 ⁵ células / poço em placas de 96 poços de fundo redondo de 48 ou 72 hr .

6. Promoção Vivo Em

1. Para a estimulação in vivo, transferência adoptiva 4 x 10 ⁶ células T CFSE marcados por ratinho (por via intravenosa (IV) em 200 ul de PBS) em cada rato receptor semelhantes em MHC.
   NOTA: Neste protocolo, as células T CFSE rotulados podem ser adoptively transferidos usando veia da cauda ou injeção retro-orbital como essas células vão para casa para linfóides órgãos como o baço e os linfonodos.
2. Desafiar os ratos receptores um dia mais tarde com o antigénio.
   NOTA:Neste exemplo, usamos a ovalbumina (OVA proteína, 50 ug / ratinho) como antigénio específico porque OVA-, receptor de células T (TCR), as células T foram -transgenic adoptivamente transferidos para ratinhos receptores. Prepare proteína OVA em PBS estéril e injectar 100 ul de proteína OVA / PBS ou PBS de controlo, por meio de injecção subcutânea (Si), em cada rato receptor ^5.
3. Colheita e gerar suspensões individuais de células de órgãos linfóides (nódulos linfáticos e baços de ratinhos receptores) 3 dias após a imunização com a proteína OVA ou PBS. linfonodos separar em nodos linfáticos proximais (PLN), que inclui axilar, braquial e nódulos linfáticos cervical superficial) e nódulos linfáticos distais (DLN), que inclui mesentérica, popliteal, inguinal, lombar, e nódulos linfáticos caudal. células mancha usando os anticorpos FACS apropriados para verificar se há a proliferação de células T.
   NOTA: Nesta célula experimento de rastreamento CFSE, CFSE marcado com células T de ratinhos de controlo injectados com PBS estabelecer uma linha de base para a fluorescência não-dinecer células. Divisões celulares de proliferação, as células, marcadas com CFSE-estimulado com antigénio são visualizados através da medição de fluorescência picos ^12,13. Com o controlo de PBS, o número de divisões celulares de proliferação, as células T CFSE-marcados podem ser determinadas ^12,13.
4. Analisar os dados de proliferação de células marcadas com CFSE, comparando o número de divisões celulares ou picos entre amostras (Figuras 1 e 2).
   NOTA: Por exemplo, CFSE marcado, as células T específicas de OVA adoptivamente transferidos para ratinhos receptores que recebem o antigénio OVA vai sofrer proliferação activa em comparação com os ratinhos de controlo injectados com PBS ^5,12. Além disso, é de salientar salientar que há muitas maneiras para analisar dados de proliferação de células CFSE, como demonstrado por Hawkins e seus colegas ^14.

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Resultados

purificação magnética de células de linfócitos permite que os utilizadores para purificar uma população de células alvo num período relativamente curto de tempo. Utilizando o nosso protocolo de esgotamento, que foram capazes de aumentar a percentagem de células T CD8 (OT-I em recombinação-activação do gene-1 (RAG-1) -deficient ratinhos) a partir de 72,8% (antes da purificação) a 94,2% (após purificação; Figura 1A) ^4,5. Estes linfócitos puri...

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Discussão

Neste protocolo, demonstramos um procedimento para a purificação de linfócitos de órgãos linfóides. purificação celular utilizando esférulas magnéticas triagem é um método rápido e simples que produz células alvo viáveis, altamente purificados.

Passos críticos dentro do Protocolo

A viabilidade celular e rendimento celular

Mantendo a viabilidade das células de linhagem hematopoiéticas in vitro ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
RPMI 1640 (without L-Glutamine)	Gibco	31870025
Fetal Bovine Serum			Heat inactivated
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140114
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-CD43 magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-801	Mix well prior use
Streptavidin microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101	Mix well prior use
Anti-Annexin V magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-090-201	Mix well prior use
MACS LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
96-well U-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	650180
96-well F-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	655180
100 μm cell strainer mesh			To sterilize using UV radiation prior use
0.2 μm  sterile disposable filter units	Nalgene	567-0020	Can be substituted with any sterile filter device
CellTrace Violet	Invitrogen	C34557	CTV for short; alternative to CFSE
CellTrace Yellow	Invitrogen	C34567	CTY for short; alternative to CFSE
CellTrace Far Red	Invitrogen	C34564	CTFR for short; alternative to CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor 670	eBioscience	65-0840	CPD670 for short; alternative to CFSE
PKH26	Sigma Aldrich	PKH26GL	PKH26, alternative to CFSE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Dextrose	Sigma Aldrich	G7021
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5655
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S5136
Phenol Red	Sigma Aldrich	P0290
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Sodium chloride	Merck Millipore	S7653	Can use from other sources
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Tris-base
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Molecular Probes	C-1157	Reconstitute in DMSO
Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)	Sigma Aldrich	P1269
A23187 (Calcium ionophore)	Sigma Aldrich	C7522
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and recombinant protein
CD11b biotin (clone m1/70)	Biolegend	101204	T cell depletion cocktail
CD11c biotin (clone N418)	Biolegend	117304	T cell depletion cocktail
Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)	Biolegend	108404	T cell depletion cocktail
Ter119 biotin (clone Ter119)	Biolegend	116204	T cell depletion cocktail
TCR-γδ biotin (clone GL-3)	Biolegend	118103	T cell depletion cocktail
CD19 biotin (clone 6D5)	Biolegend	115504	T cell depletion cocktail
B220 biotin (clone RA3-6B2)	Biolegend	103204	T cell depletion cocktail
CD49b biotin (clone DX5)	Biolegend	108904	T cell depletion cocktail
CD4 biotin (clone GK1.5)	Biolegend	100404	T cell depletion cocktail
CD8 biotin (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	T cell depletion cocktail
F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated)	Jackson ImmunoResearch	115-006-075	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-mouse CD40 mAb (plate coated)	Pharmingen	553722	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-4	ProSpec	Cyt-282
LPS from E. coli Serotype 055:B5	Sigma Aldrich	L-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated)	eBioscience	16-0037-85	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)	eBioscience	16-0281-85	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-2	ProSpec	Cyt-370
Albumin from chicken egg white, Ovalbumin	Sigma Aldrich	A7641