İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Özet

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Özet

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen^1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses³. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting⁴ and the investigation of proliferative abilities by ³H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling^5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Giriş

Mature lymphocytes generally exist in the resting state if there is no pre-existing infection or inflammation in the individual. Therefore, it is important to retain the naïve status of lymphocytes during the isolation process before performing in vitro or in vivo functional assays. The key to ensuring consistent and reproducible results is to limit any unnecessary manipulation of the cells.

Magnetic cell sorting utilizes antibodies and microbeads to label cells so as to enrich the cell population of interest. With this approach, there are two purification strategies: positive enrichment and negative depletion. Positive enrichment enriches the cell population of interest using an antibody that binds to the target cells. Negative depletion, on the other hand, depletes non-target cells, leaving the cell population of interest. In our lab, we prefer negative depletion to positive enrichment because the binding of antibodies to the target cells could potentially alter cell features and behavior. In fact, many established cell surface markers suitable for the isolation of a particular cell population are also functional receptors.

Magnetic cell sorting not only yields highly pure populations of viable target cells, it is also less time-consuming and avoids the cellular stress induced by high-pressure flow used in fluorescence-activated cell sorting (FACS). By labeling the unwanted cell populations and depleting them using a magnetic separation column, we are able to perform rapid cell isolation without compromising the viability of the target cell population. In this protocol, we demonstrate the use of negative depletion strategies to purify naïve B cells or T cells.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm fareler yetiştirilen ve özel patojen içermeyen koşullar altında korunur ve tüm fare protokolleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi kurallarına uygun olarak yürütülmektedir vardır.

Tamponlar ve Reaktiflerin hazırlanması 1.

1. 55 uM 2-merkaptoetanol tamamlandı Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamında (% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, penisilin (100 lU / ml) / streptomisin (100 ug / ml) hazırlayın ).
2. Ayrı, 20x Dengeli Tuz Çözeltisi (BSS) Stok 1 ve Stok 2 hazırlayın.
   1. 20x BSS stok 1 (1 L steril su içinde 111 mM dekstroz, 8.8 mM potasyum fosfat, 26.7 mM sodyum fosfat dibazik) hazırlanması ve son hacim ayarlamasından önce, 20x BSS stoklar 1-40 ml% 0.5 Fenol Kırmızısı ekleyin. 4 ° C'de depolamadan önce 0.2 mikron filtre kullanılarak steril filtre.
   2. 20x BSS stok 2 (25.8 mM kalsiyum klorür dihidrat, 107 mM potasyum klorür, 2.73 M sodyum ch hazırlayınloride, 19.6 mM magnezyum klorür hekzahidrat, 1 L'lik steril su içinde 16.6 mM magnezyum sülfat). 4 ° C'de depolamadan önce 0.2 mikron filtre kullanılarak steril filtre.
   3. 400 ml steril su her ayrı 50 ml BSS stok 1 ve 50 ml BSS stok 2 sulandırmak, deneysel kullanım için 1x BSS hazırlamak. , Seyreltilmiş çözüm birleştirin pH 7'ye ayarlamak ve 20 ml FBS (% 2) ilave edilir. 0.2 um filtre kullanılarak steril su ve steril filtre kullanılarak 1 L doldurun.
      NOT: Konsantre BSS stoklarının karıştırılması doğrudan yağış neden olabilir çünkü BSS stok çözeltileri ayrı ayrı hazırlanmalıdır.
3. Kırmızı kan hücresi (RBC) Liziz Tamponu
   1. RBC liziz tamponu kullanımdan önce 1 parçası hazır Tris-baz (steril su içinde 130 mM Tris (hidroksimetil) aminometan, pH 7.65) 9 parça hazır amonyum klorür (steril su içinde 155 mM amonyum klorür) karıştırın.
      Not: 4 ° C'de amonyum klorür ve Tris-bazın mağazası steril stok çözeltileri. lizis b hazırlayınRBCs verimli parçalama sağlamak için taze Uffer.

Dalak veya lenf nodu gelen Lenfosit Süspansiyon 2. Nesil

NOT: fare ötanazi önce deney için gerekli tüm reaktifler ve ekipman hazırlamak ve yüksek hücre canlılığı korumak için mümkün olduğunca çabuk lenfositlerin tek hücre süspansiyonları üretmek için önemlidir.

1. Servikal dislokasyon veya CO ₂ boğulma tarafından deneysel fare Euthanize.
   Not: itibaren Bu adımdan tüm deneysel işlemler aseptik olarak yapılmalıdır.
2. Herhangi bir kesiler yapmadan önce% 70 etanol içine tüm fare batırın. Dalak ve lenf düğümleri aseptik ⁸ çıkarın ve ya (aşama 1.2.3 den) BSS / FBS (% 2 FBS ile RPMI) 5 ml buz gibi soğuk RPMI / FBS ihtiva eden ayrı ayrı 15 ml tüpler yerleştirin.
   Not: BSS etkin RBC parçalama engellediğinden, dalak hücre süspansiyonu hazırlamak için RPMI kullanmak afte BSS geçmekr RBC parçalama.
3. 2 ml buz gibi soğuk RPMI / FBS BSS / FBS içeren bir petri steril 100 um hücre filtresi örgü iki adet arasında organ (lar) yer, dalak ve lenf düğümleri, tek bir hücre süspansiyonu üretmek için. Çok ince parçalar halinde yırtılmış kadar 1 ml şırınga pistonu kullanarak, organı (ler) ezin.
4. 15 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın ve hücre süzgecinden buz soğukluğunda olarak RPMI / FBS BSS / FBS ile örgü yıkayın. Kalan hücre süspansiyonu toplayın aynı 15 ml tüp ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 453 xg'de aşağı doğru döndürün. süpernatantı.
   NOT: Sonraki adımda RBC parçalama tamponu veya orta eklemeden önce parmaklarıyla tüp hafifçe vurarak pelet hücreleri askıya Re.
5. Hücre süspansiyonu santrifüje esnasında oda sıcaklığında (RT) RBC liziz tamponu (adım 1.3 bkz.). Süpernatant hücrelerin peletleme ve çıkardıktan sonra, her 10 ⁸ hücreleri için 1 ml RBC parçalama tamponu ile hücrelerin yeniden askıya. incukesmek 3-4 dakika boyunca oda sıcaklığında lizis reaksiyonu.
6. 14 ml buz gibi soğuk BSS / FBS ile RBC lizis durdurun ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 453 xg'de aşağı doğru döndürün.

B ve T hücrelerinin 3. saflaştırılması

1. B hücrelerinin saflaştırılması
   1. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 300 ul BSS / FBS kadar 10 ⁸ dalak hücreleri yeniden askıya ve 50 ul anti-CD43 manyetik mikroboncukları ^9,10 ekleyin. , Ölü hücreleri çıkarmak 30 ul Annexin V manyetik boncuklar ekleyin. 30 dakika boyunca 4 ° C'de buzdolabında hücre süspansiyonu inkübe edin.
2. T hücreleri ile saflaştırılması
   1. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Olmayan T hücre tükenmesi antikor kokteyli 10 ⁸ hücreleri (CD19, B220, Gr-1 karşı biotinlenmiş antikorlar kadar yeniden askıya TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 ve CD4 veya CD8 hedef hücre popülasyonuna bağlı olarak / FBS ^4,5 200 ul BSS 200:) arındırılmalıdır, 1 seyreltilmiş. Bir hücre süspansiyonu inkübe15 dakika boyunca 4 ° C'de bir buzdolabı.
   2. İnkübasyondan sonra, hücreler yıkama ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 453 x g'de döndürülür ve 10 mi BSS / FBS ekleyin. Süpernatantı ve 30 ul streptavidin mikro boncuklar ve 15 ul Annexin V manyetik boncuklar ile 165 ul BSS / FBS hücreleri yeniden askıya. 30 dakika boyunca 4 ° C'de buzdolabında hücre süspansiyonu inkübe edin.
      NOT: bile manyetik mikro-ile etiketleme sağlamak 15 dakika boyunca mikro-hücreleri inkübe sonra 15 ml tüp dokunarak yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın ve adım 3.1.1 sırasında başka bir 15 dakika inkübe etmek. ya da 3.2.2.
3. Hücre Arıtma için Ayırma Sütunu hazırlanması
   1. Hücrelerin microbead etiketleme sırasında kullanılmayan bir ayırma kolonu hazırlayın (adım 3.1.1. ya da 3.2.2.). RT'ye (FBS olmadan) Pre-sıcak BSS ve yıkama ve aseptik sütun dengelenmeye 2 ml kullanın. BSS ile dengelendikten sonra, yıkanmış, kolon kurumasına izin verilmemelidir.
      NOT: LS c kullanınolumn yerine tavsiye edilen LD sütun nedeniyle yeniden kullanılabilirlik (adım 3.4.).
   2. Manyetik boncuklar ile etiketleme işleminden sonra, hücreler yıkama ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 453 x g'de döndürülür ve 14 ml BSS / FBS ekleyin. Süpernatantı ve 1-3 ml RT BSS hücreleri yeniden askıya.
   3. saflaştırma işlemi sırasında akış oranını azaltmak için sütunun ucuna steril 21 G iğne takın. dengelenmiş kolona hücre süspansiyonu yükleyin ve saflaştırılmış hedef hücreleri ihtiva eden akışı toplamak.
      NOT: sütuna yükleme sırasında içine kabarcıkları tanıtan kaçının.
   4. 1 mi BSS / FBS ile bir kez kolon yıkaması ve saflaştırılmış hedef hücreleri ihtiva eden akışı toplamak. bir kez daha içinden akışı ile sütun yeniden yükleyin. Aynı 15 ml tüp ikinci yüklemeden sonra akışı toplayın.
   5. 1 ml BSS / FBS ile sütun 3 kere yıkayın ve saflaştırılmış hedef hücreleri ihtiva eden akışı toplamak. Bundan sonra, th 5 ml BSS / FBS ekleyinBir dalgıç ile e kolon ve yeni bir 15 ml tüp içine sütun dışında manyetik etiketli hücreleri yıkayın.
   6. Saflaştırılmış B veya T hücrelerinin ^4,5 antijenlerini yüzey bağlanan antikorlar kullanılarak akış sitometrisi ile toplanan hücreler saflığını kontrol edin.
4. Yeniden kullanılması ayırma kolonunun
   NOT: LS sütun arıtma verimini etkilemeden 4 kata kadar tekrar edilebilir.
   1. 5 ml fosfat tamponlu tuz (PBS) ve pistonu kullanan üstten damıtılmış su, 5 ml 3 kez sütun 3 kez yıkayın.
   2. 5 ml% 70 etanol ile sütun yıkayın ve yoğun sütunda pas oluşumunu önlemek için bir hava musluğunu kullanarak sütun kurutun.
   3. ayn bir saflaştırma deneyi için el LS kolonu hazırlamak için, şırınga adaptörü kullanarak 5 mi,% 70 etanol ile aşağıdan yukarıya doğru sütun yıkayın. Daha sonra, sütun üst bir kez 5 ml PBS ve ardından, 5 ml steril PBS ile iki kez aşağıdan yukarıya doğru sütun yıkayın. 2 ekleml RT BSS sütun dengelenmesi ve ardından etiketli hücreleri ile kolon yükleme devam etmek.

4. KAKE Etiketleme ve Uyarım

Not: Saflaştırılmış hücreleri, in vitro çeşitli ve in vivo fonksiyonel deneylerde tabi tutulabilmektedir. Burada, APC ^'5 T hücresi uyarılması yeteneğini belirlemek için, saflaştırılmış T hücreleri kullanır.

1. 37 ° C öncesinde CFSE yüklenmesi Pre-sıcak etiketleme çözümü (PBS içinde% 0.1 FBS).
   Not: PBS içinde FBS düşük bir yüzde kullanarak CFSE yükleme esnasında hücre ölümünü azaltır ve santrifüj sırasında hücre kaybını en aza indirir. Ancak, çok fazla FBS KAKE yükleme engelleyebilir.
2. Etiketleme çözeltisi ile iki kez saflaştırıldı hücreler yıkanır, daha sonra 15 ml'lik bir tüp içinde önceden ısıtılmış markalama çözeltisi içinde 2 x 10 ⁷ hücre / ml'de yeniden süspanse edilir.
3. 10 uM KAKE çözeltisi hazırlayın (1: 500 seyreltme 5 mM KAKE stok solüsyon) önceden ısıtılmış etiketleme çözeltisi içinde. KAKE çözümü gerekirtaze optimum etiketleme elde etmek için her zaman hazır olun.
4. CFSE ile hücrelerin yüklemek için, 37 ° C 'de 10 dakika süre ile karanlıkta, 15 ml'lik bir tüp içinde 1 kısım 10 uM CFSE çözeltisine 1 kısım hücre süspansiyonu ekleyin ve inkübe edilir. 5 uM CFSE bir son konsantrasyon elde 1 x 10 ⁷ hücre / ml etiketlemek için kullanılır.
5. CFSE yükleme esnasında hücre, homojen bir karışım sağlamak için tüpü her 2 dakikada ters çevirin.
6. , Reaksiyonu durdurmak buz soğukluğunda tam RPMI ortamında bir çok sayıda ekleme ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 453 x g'de döndürülür ve. Başarılı KAKE yükleme üzerine, hücre pelet sarımsı görünecektir.
7. Yıkama CFSE buz soğukluğundaki tam RPMI ortamı ile hücreler bir kez daha yüklenir ve in vitro kültür için ya da in vivo uyarılması kullanılmadan önce, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 453 x g'de aşağı doğru döndürün.

5. İn vitro uyarma

1. kullanımdan hemen önce uyaranların 2x stok solüsyonu (2x uyaranlara stok çözelti) hazırlayın 10 ve böylece2x uyaranlara stok çözeltisi 0 ul, 96 oyuklu bir plaka içerisinde, oyuk başına 200 ul nihai bir hacme 100 ul hücre ilave edilebilir.
2. (B hücreleri ve T hücreleri için, CD3 ve CD28 için IgM veya CD40) uyaranlara ile kaplanmış bir tabak gerekli ise, bir gece boyunca 4 ° C'de PBS içinde uyaranlara ve ön-kaplama kültürü plakası seyreltin. Seçenek olarak ise, kültür plakası Deney gününde 1 saat boyunca 37 ° C 'de kaplanabilir. PBS (plaka, herhangi bir zamanda kurumasına izin vermeyin) ile iki kez kaplanmış plaka yıkayın.

B hücreleri için
uyaranlar	Nihai konsantrasyon
F (ab ') 2 keçi anti-fare IgM	0,6-2,4 ug / ml
Fare karşıtı CD40 mAb	0.5-2 ug / ml
rekombinantfare IL-4	25 U / ml
lipopolisakkarit	0,1-10 ug / ml
E. (LPS) E. coli serotipi 055: B5
T hücreleri için,
uyaranlar	Nihai konsantrasyon
Anti-CD3 (plaka kaplı)	2-10 ug / ml
(50 ul / oyuk kaplama)
Anti-CD28 (plaka kaplı)	2 ug / ml
Rekombinant IL-2	40 U / ml
PDBu (forbol ester)	5-50 ng / ml
A23187 (Kalsiyum İyonofor)	250 ng / ml

Tablo 1: in vitro kültür içinde lenfositleri uyarmak için kullanılan uyarıcı konsantrasyonu.

3. CFSE, etiketli B hücreleri için, 3 x 10 ⁵ hücre ile üç nüsha tam RPMI ortamı ve kültürde ⁶ ila 10 x 3 hücre / ml yeniden askıya / kuyuda 72 saat için 96-gözlü düz tabanlı plakalar.
4. CFSE-etiketli T hücreleri için, 0.5-3 x 10 ⁵ hücre ile üç nüsha tam RPMI ortamı ve kültür 0,5-3 x 10 ⁶ hücre / ml'de yeniden askıya / kuyuda 48 ya da 72 saat süre ile, 96-gözenekli yuvarlak tabanlı plakalar .

6. in vivo uyarılmasına

1. In vivo uyarılmasına, adoptif transferi için fare başına 4 x 10 ⁶ KAKE etiketli T hücreleri (intravenöz (iv) 200 ul PBS) her MHC-uyumlu alıcı fare içine.
   NOT: Bu protokol, KAKE etiketli T hücreleri adoptively ev gibi dalak ve lenf düğümleri olarak lenfoid organlara olacak bu hücrelerin olarak kuyruk ven ya da retro-orbital enjeksiyonu kullanılarak transfer edilebilir.
2. Bir gün sonra antijen ile alıcı fareler meydan.
   NOT:OVA-spesıfik T hücresi reseptörü (TCR) -transgenic T hücrelerinin adoptif alıcı farelere aktarıldı, bu örnekte, antijen olarak ovalbumin (OVA proteini, 50 ug / fare) kullanın. Her alıcı farenin ⁵ içine, deri altı enjeksiyon (si) üzerinden, steril PBS OVA proteini hazırlayın ve OVA protein / PBS veya PBS kontrol 100 ul enjekte edilir.
3. Hasat ve 3 gün OVA proteini veya PBS ile immünizasyondan sonra alıcı farelerin bir lenfoid organlara hücre süspansiyonları (lenf düğümleri ve dalak) oluşturur. proksimal lenf nodlarının mezenterik, popliteal, inguinal, lomber ve kuyruklu lenf düğümleri içeren aksiller, brakial ve yüzeysel servikal lenf düğümleri) ve distal lenf nodları (DLN) içerir (PLN), içine ayrı lenf nodları. Uygun FACS antikorları kullanarak leke hücreler, T hücre çoğalması kontrol etmek için.
   NOT: Bu KAKE hücre izleme deneyinde olmayan di için bir temel floresan kurmak PBS enjekte edilmiş kontrol farelerinden T hücrelerinin KAKE etiketliHücreleri sa¤layan. Çoğalan hücre bölünmeleri, antijen ile uyarılmış, KAKE etiketli hücreler floresan zirveleri ^12,13 ölçülerek tarafından görüntülenmiştir. PBS kontrolü ile, çoğalan hücre bölünmeleri sayısı KAKE etiketli T hücreleri ^12,13 belirlenebilir.
4. Örnekler arasında, hücre bölümleri veya tepe sayısını karşılaştırarak CFSE etiketli hücre proliferasyon verileri analiz (Şekil 1 ve 2).
   Not: Örneğin, CFSE etiketli, adoptif OVA antijen alıcı alıcı farelere aktarıldı OVA spesifik T hücreleri, PBS enjekte edilmiş kontrol farelerine kıyasla ^5,12 aktif proliferasyonunu uğrayacaktır. Ayrıca, Hawkins ve arkadaşları ¹⁴ tarafından gösterildiği gibi KAKE hücre çoğalma verileri analiz etmenin birçok yolu vardır işaret etmek çekicidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

lenfositlerin manyetik hücre saflaştırma kullanıcılara zaman nispeten kısa bir miktarda bir hedef hücre popülasyonu arındırmak için izin verir. Bizim tükenmesi protokolü kullanarak, arıtıldıktan sonra 94.2% (için 72,8% (önceki arıtma) den (rekombinasyon aktive gen 1 (RAG-1) -açıklı farelerde OT-I) CD8 T hücrelerinin yüzdesini artırmak başardık; Şekil 1A) ^4,5. Bu arıtılmış, lenfositler, daha sonra olan limfosit proliferasyon ve s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, lenfoid organların lenfositlerin saflaştırılması için bir prosedürü göstermektedir. manyetik boncuk sıralama kullanılarak hücre arıtma canlı, yüksek düzeyde saflaştırılmış hedef hücreleri verimleri hızlı ve basit bir yöntemdir.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

Hücre canlılığı, ve hücre verimi

In vitro olarak hematopoietik kökenli hücrelerin canlılığını m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
RPMI 1640 (without L-Glutamine)	Gibco	31870025
Fetal Bovine Serum			Heat inactivated
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140114
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-CD43 magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-801	Mix well prior use
Streptavidin microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101	Mix well prior use
Anti-Annexin V magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-090-201	Mix well prior use
MACS LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
96-well U-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	650180
96-well F-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	655180
100 μm cell strainer mesh			To sterilize using UV radiation prior use
0.2 μm  sterile disposable filter units	Nalgene	567-0020	Can be substituted with any sterile filter device
CellTrace Violet	Invitrogen	C34557	CTV for short; alternative to CFSE
CellTrace Yellow	Invitrogen	C34567	CTY for short; alternative to CFSE
CellTrace Far Red	Invitrogen	C34564	CTFR for short; alternative to CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor 670	eBioscience	65-0840	CPD670 for short; alternative to CFSE
PKH26	Sigma Aldrich	PKH26GL	PKH26, alternative to CFSE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Dextrose	Sigma Aldrich	G7021
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5655
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S5136
Phenol Red	Sigma Aldrich	P0290
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Sodium chloride	Merck Millipore	S7653	Can use from other sources
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Tris-base
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Molecular Probes	C-1157	Reconstitute in DMSO
Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)	Sigma Aldrich	P1269
A23187 (Calcium ionophore)	Sigma Aldrich	C7522
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and recombinant protein
CD11b biotin (clone m1/70)	Biolegend	101204	T cell depletion cocktail
CD11c biotin (clone N418)	Biolegend	117304	T cell depletion cocktail
Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)	Biolegend	108404	T cell depletion cocktail
Ter119 biotin (clone Ter119)	Biolegend	116204	T cell depletion cocktail
TCR-γδ biotin (clone GL-3)	Biolegend	118103	T cell depletion cocktail
CD19 biotin (clone 6D5)	Biolegend	115504	T cell depletion cocktail
B220 biotin (clone RA3-6B2)	Biolegend	103204	T cell depletion cocktail
CD49b biotin (clone DX5)	Biolegend	108904	T cell depletion cocktail
CD4 biotin (clone GK1.5)	Biolegend	100404	T cell depletion cocktail
CD8 biotin (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	T cell depletion cocktail
F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated)	Jackson ImmunoResearch	115-006-075	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-mouse CD40 mAb (plate coated)	Pharmingen	553722	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-4	ProSpec	Cyt-282
LPS from E. coli Serotype 055:B5	Sigma Aldrich	L-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated)	eBioscience	16-0037-85	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)	eBioscience	16-0281-85	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-2	ProSpec	Cyt-370
Albumin from chicken egg white, Ovalbumin	Sigma Aldrich	A7641