בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

Summary

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Abstract

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen^1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses³. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting⁴ and the investigation of proliferative abilities by ³H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling^5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Introduction

Mature lymphocytes generally exist in the resting state if there is no pre-existing infection or inflammation in the individual. Therefore, it is important to retain the naïve status of lymphocytes during the isolation process before performing in vitro or in vivo functional assays. The key to ensuring consistent and reproducible results is to limit any unnecessary manipulation of the cells.

Magnetic cell sorting utilizes antibodies and microbeads to label cells so as to enrich the cell population of interest. With this approach, there are two purification strategies: positive enrichment and negative depletion. Positive enrichment enriches the cell population of interest using an antibody that binds to the target cells. Negative depletion, on the other hand, depletes non-target cells, leaving the cell population of interest. In our lab, we prefer negative depletion to positive enrichment because the binding of antibodies to the target cells could potentially alter cell features and behavior. In fact, many established cell surface markers suitable for the isolation of a particular cell population are also functional receptors.

Magnetic cell sorting not only yields highly pure populations of viable target cells, it is also less time-consuming and avoids the cellular stress induced by high-pressure flow used in fluorescence-activated cell sorting (FACS). By labeling the unwanted cell populations and depleting them using a magnetic separation column, we are able to perform rapid cell isolation without compromising the viability of the target cell population. In this protocol, we demonstrate the use of negative depletion strategies to purify naïve B cells or T cells.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל העכברים הם התרבו ומתוחזק בתנאים הפתוגן ללא ספציפיים וכל פרוטוקולי העכבר מתנהלים בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש.

1. הכנת Buffers ריאגנטים

1. הכן מכון הזיכרון רוזוול פארק שלם (RPMI) בינוני (10% בסרום שור העובר חום מומת (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין, פניצילין (100 IU / ml) / סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol ).
2. כן 20x תמיסת מלח מאוזן (BSS) במלאי 1 ומלאה 2, בנפרד.
   1. כן 20x BSS מניות 1 (111 מ"מ דקסטרוז, פוספט אשלגן 8.8 מ"מ, 26.7 מ"מ dibasic פוספט נתרן 1 מי L סטרילי) ולהוסיף 40 מיליליטר 0.5% פנול אדומים כדי 20x BSS מנייה 1 לפני התאמת נפח סופית. סינון סטרילי באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן לפני אחסון ב 4 ° C..
   2. הכן 20x BSS המניות 2 (מימית סידן כלורי 25.8 מ"מ, 107 מ"מ אשלגן כלורי, 2.73 M נתרן chloride, 19.6 hexahydrate מגנזיום כלוריד מ"מ, מגנזיום סולפט 16.6 מ"מ 1 מים L סטרילי). סינון סטרילי באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן לפני אחסון ב 4 ° C..
   3. כדי להכין 1x BSS לשימוש ניסיוני, לדלל 50 מ"ל BSS מניות 1 ו -50 מ"ל BSS המניות 2, בנפרד, ב 400 מ"ל מים סטריליים כל. שלב שני פתרונות מדולל, להסתגל pH 7, ולהוסיף 20 FBS מ"ל (2%). למעלה עד 1 L באמצעות מים סטריליים סינון סטרילי באמצעות 0.2 מיקרומטר הסינון.
      הערה: פתרונות מניות BSS צריכים להיות מוכנים בנפרד בגלל הערבוב של מניות BSS מרוכזות ישירות עלול לגרום משקעים.
3. תאי דם אדומים (RBC) הצפת תמוגה
   1. כדי להכין חיץ תמוגה RBC, לערבב 9 חלקים כלוריד אמוניום המניות (אמוניום כלוריד 155 מ"מ במים סטריליים) עד 1 חלק המניה טריס-בסיס (130 מ"מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane במים סטריליים, pH 7.65) לפני השימוש.
      הערה: חנות פתרונות מניות סטרילי כלוריד אמוניום טריס-בסיס על 4 מעלות צלזיוס. הכן תמוגה בuffer טרי על מנת להבטיח תמוגה יעיל של RBCs.

הדור 2. של השעיה לימפוציטים מן הטחול או בלוטות לימפה

הערה: חשוב להכין את כל החומרים כימיים והציוד הנדרשים לצורך הניסוי לפני המתת חסד עכבר כדי ליצור השעיות תא בודדות של לימפוציטים בהקדם האפשרי כדי לשמור viabilities תא גבוה.

1. להרדים העכבר ניסיוני על ידי נקע בצוואר הרחם או מחנק ₂ CO.
   הערה: משלב זה ואילך, כל הפרוצדורות צריכות להתבצע בסביבה נקיה מחיידקים.
2. טובל את העכבר כולו לתוך אתנול 70% לפני ביצוע כל חתכים. הסר את בלוטות הטחול והלימפה ⁸ בסביבה נקייה מחיידקים, ומניחים אותם 15 נפרד צינורות מ"ל המכיל 5 מ"ל קר כקרח RPMI / FBS (RPMI עם 2% FBS) או BSS / FBS (משלב 1.2.3).
   הערה: מאז BSS מונע תמוגה RBC יעיל, להשתמש RPMI לעריכת ההשעיה תא הטחול ולעבור BSS after RBC תמוגה.
3. כדי ליצור השעיה תא בודד מן הצמתים הטחול או הלימפה, למקם את איבר (ים) בין שתי חתיכות של רשת מסננת 100 מיקרומטר תא סטרילי בצלחת פטרי המכילה 2 מ"ל קר כקרח RPMI / FBS או BSS / FBS. באמצעות הבוכנה של מזרק 1 מ"ל, ומועכים את איבר (ים) עד שהוא נקרע לחלקים עדינים מאוד.
4. מעבירים את ההשעיה לתא צינור 15 מ"ל ולשטוף את מסננת תא רשת עם קרים כקרח RPMI / FBS או BSS / FBS. אסוף את ההשעיה תא הנותרים, להוסיף אותו צינור 15 מ"ל אותו, ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant.
   הערה: Re- להשעות את התאים pelleted על ידי מצליף את הצינור עם האצבעות לפני הוספת RBC תמוגה חיץ או בינוני בשלבים הבאים.
5. הכן בטמפרטורת החדר (RT) חיץ תמוגה RBC במהלך צנטריפוגה של השעיה התא (ראה שלב 1.3.). לאחר pelleting את התאים הסרת supernatant, מחדש להשעות את התאים עם חיץ תמוגה 1 מ"ל RBC עבור כל 10 ⁸ תאים. Incuבייט התגובה תמוגה ב RT במשך 3-4 דקות.
6. עצור תמוגה RBC עם 14 מ"ל קר כקרח BSS / FBS ומסובב ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..

טיהור 3. B ותאי T

1. טיהור של תאי B
   1. ספירת התאים באמצעות hemocytometer. Re- להשעות עד 10 ⁸ תאים הטחול ב 300 μl BSS / FBS ולהוסיף 50 μl אנטי CD43 microbeads מגנטי ^9,10. כדי להסיר תאים מתים, להוסיף 30 חרוזים מגנטיים μl Annexin V. לדגור על השעיית התא במקרר 4 ° C. למשך 30 דקות.
2. טיהור של תאי T
   1. ספירת התאים באמצעות hemocytometer. Re- להשעות עד 10 ⁸ תאים קוקטייל נוגדנים דלדול התאים הלא-T (נוגדנים biotinylated נגד CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 ו CD4 או CD8 תלוי אוכלוסיית תאים היעד להיטהר), מדולל 1: 200 ב 200 μl BSS / FBS ^4,5. דגירת השעית התא4 ° C במקרר במשך 15 דקות.
   2. לאחר דגירה, להוסיף 10 מ"ל BSS / FBS כדי לשטוף את התאים ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant מחדש להשעות את התאים 165 μl BSS / FBS עם 30 microbeads μl streptavidin ו -15 חרוזים מגנטיים μl Annexin V. לדגור על השעיית התא במקרר 4 ° C. למשך 30 דקות.
      הערה: כדי להבטיח אפילו תיוג עם microbeads מגנטי, דגירה התאים עם microbeads במשך 15 דקות, ואז לערבב את ההשעיה תא בעדינות על ידי הקשה על שפופרת 15 מ"ל ו דגירה 15 דקות אחר במהלך שלב 3.1.1. או 3.2.2.
3. הכנת טור הפרדה עבור טיהור Cell
   1. כן עמודת פרדה בשימוש במהלך תיוג microbead של התאים (שלב 3.1.1. או 3.2.2.). טרום חמים BSS (ללא FBS) RT ולהשתמש 2 מ"ל לשטוף לאזן את העמודה בסביבה נקייה מחיידקים. לאחר איזון עם BSS, בעמודת השטף אסור להתייבש.
      הערה: אנו משתמשים ג LSolumn במקום בעמודה LD מומלץ בשל מחדש השימושיות שלה (ראה שלב 3.4.).
   2. לאחר תיוג עם חרוזים מגנטיים, להוסיף 14 מ"ל BSS / FBS כדי לשטוף את התאים ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant מחדש להשעות את התאים 1-3 מ"ל RT BSS.
   3. צרף מחט 21 G סטרילי אל קצה הטור להפחית את קצב הזרימה במהלך תהליך של היטהרות. טען את השעית התא על טור equilibrated לאסוף את הזרימה דרך המכיל את תאי היעד המטוהרים.
      הערה: הימנע החדרת בועות לתוך הטור בעת טעינה.
   4. לשטוף את העמודה פעם עם 1 מ"ל BSS / FBS לאסוף את הזרימה דרך המכיל את התאים היעד מטוהרים. רענן בעמודה עם הזרם דרך שוב. אסוף את הזרימה דרך לאחר הטעינה השנייה בצינור אותו 15 המ"ל.
   5. לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 1 מ"ל BSS / FBS לאסוף את הזרימה דרך המכיל את התאים היעד מטוהרים. לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל BSS / FBS כדי thבעמודת E ו-, עם בוכנה, לשטוף את התא המגנטי שכותרתו מהטור לתוך צינור 15 מיליליטר חדש.
   6. בדוק את הטוהר של התאים שנאספו על ידי cytometry זרימה באמצעות נוגדנים הנקשרים אל פני השטח אנטיגנים של B מטוהרים או תאי T ^4,5.
4. שימוש מחדש טור ההפרדה
   הערה: הטור LS ניתן לעשות שימוש חוזר עד 4 פעמים מבלי להשפיע יעילות הטיהור.
   1. לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 5 מ"ל בופר פוספט (PBS) ו -3 פעמים עם 5 מ"ל מים מזוקקים מלמעלה באמצעות הבוכנה.
   2. לשטוף את העמודה עם אתנול 5 מ"ל 70% ולייבש את העמודה באמצעות ברז אוויר נרחב כדי למנוע הצטברות של חלודה בעמודה.
   3. כדי להכין עמודת LS משומשת עבור ניסוי לטיהור נפרד, לשטוף את העמודה מלמטה למעלה עם אתנול 5 מיליליטר 70% באמצעות מתאם המזרק. לאחר מכן, לשטוף את העמודה מלמטה למעלה פעמיים עם 5 מ"ל סטרילי PBS, ואחריו 5 מ"ל PBS פעם מהחלק העליון של העמודה. מוסיפים 2מ"ל RT BSS כדי לאזן את העמודה ולאחר מכן להמשיך טעינת עמודה עם תאים שכותרתו.

4. תיוג CFSE גירוי

הערה: מטוהרי תאים יכולים להיות נתונה למגוון במבחנת מבחנים תפקודיים vivo. כאן, אנו משתמשים בתאי T מטוהרים כדי לקבוע את יכולת גירוי תא T של נגמ"שים ^5.

1. פתרון תיוג טרום חם (FBS 0.1% ב- PBS) עד 37 ° C לפני CFSE טעינה.
   הערה: שימוש באחוז נמוך של FBS ב PBS מפחיתה מוות של תאים במהלך טעינת CFSE וממזערת אובדן תאים במהלך צנטריפוגה. עם זאת, מדי FBS הרבה יכול להפריע טעינת CFSE.
2. פעמיים שטפו תאים מטוהרים עם פתרון תיוג, אז מחדש תלויה ב -2 x 10 ⁷ תאים / מ"ל בתמיסה תיוג מחומם מראש בתוך שפופרת 15 מ"ל.
3. הכן 10 מיקרומטר פתרון CFSE (1: 500 דילול של 5 מ"מ CFSE פתרון המניות) בתמיסה תיוג מחומם מראש. צריך CFSE פתרוןטרי להיות מוכן כל זמן כדי להשיג תיוג אופטימלי.
4. כדי לטעון תאים עם CFSE, להוסיף ההשעיה תא 1 חלק 1 חלק 10 פתרון מיקרומטר CFSE בתוך שפופרת 15 מ"ל ו דגירה בחושך במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לריכוז סופי של 5 מיקרומטר CFSE משמש התווית 1 x 10 ⁷ תאים / מ"ל.
5. להפוך את הצינור כל 2 דקות כדי להבטיח תערובת הומוגנית של תאים במהלך טעינת CFSE.
6. כדי לעצור את התגובה, להוסיף כמה כרכים של מדיום RPMI מלא קר כקרח ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. בטעינת CFSE מוצלחת, התא הגלול יופיע צהבהב.
7. לשטוף CFSE טעון תאים עוד פעם אחת עם מדיום RPMI מלא קר כקרח ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C לפני השימוש עבור culturing במבחנה או בגירוי vivo.

5. גירוי חוץ-גופית

1. כן פתרון 2x מניות של גירויים (פתרון מניות 2x גירויים) מייד לפני שימוש כך 100 μl של פתרון גירויים המניות 2x ניתן להוסיף 100 μl של תאים כדי לנפח סופי של 200 μl לכל היטב צלחת 96-היטב.
2. אם צלחת מצופה גירויים (IgM או CD40 בתאי B או CD3 ו CD28 בתאי T) נדרש, לדלל את הגירויים PBS מראש מעיל הצלחת תרבות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לחלופין, הצליח התרבות יכולה להיות מצופה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ביום הניסוי. פעמים לשטוף את הצלחת המצופית עם PBS (אל תאפשרו הצליח להתייבש בכל עת).

עבור תאי B
גירויים	ריכוז סופי
F (ab ') 2 עיזים אנטי עכבר IgM	0.6-2.4 מיקרוגרם / מ"ל
אנטי עכבר CD40 מב	0.5-2 מיקרוגרם / מ"ל
רקומביננטיעכבר IL-4	25 U / ml
lipopolysaccharide	0.1-10 מיקרוגרם / מ"ל
(LPS) מ א coli סרוטיפ 055: B5
עבור תאי T
גירויים	ריכוז סופי
Anti-CD3 (צלחת מצופה)	2-10 מיקרוגרם / מ"ל
(50 μl / טוב לציפוי)
אנטי CD28 (צלחת מצופה)	2 מיקרוגרם / מ"ל
IL-2 רקומביננטי	40 U / ml
PDBu (אסתר phorbol)	5-50 ng / ml
A23187 (ionophore סידן)	250 ng / ml

טבלה 1: ריכוזים של גירויים משמש כדי לעורר לימפוציטים בתרבות במבחנה.

3. עבור תאים B שכותרתו CFSE, מחדש להשעות עד 3 x 10 ⁶ תאים / מ"ל במדיום RPMI להשלים ותרבות בשלושה עותקים עם 3 x 10 ⁵ תאים / גם ב 96-היטב צלחות שטוחות התחתונה למשך 72 שעות.
4. עבור תאים T שכותרתו CFSE, מחדש להשעות כדי 0.5-3 x 10 מ"ל ⁶ תאים / במדיום RPMI להשלים ותרבות בשלושה עותקים עם 0.5-3 x 10 ⁵ תאים / גם ב 96-גם בסיבוב צלחות התחתונה למשך 48 או 72 שעות .

גירוי 6. Vivo

1. עבור in vivo גירוי, העברת adoptively 4 x 10 ⁶ CFSE שכותרתו תאים T לכל עכבר (לווריד (iv) ב 200 μl PBS) לתוך כל עכבר הנמען MHC בהתאמה.
   הערה: בפרוטוקול זה, CFSE שכותרתו בתאי T ניתן להעביר adoptively באמצעות וריד הזנב או רטרו מסלולית הזרקת תאים אלה יהיה ביתם הלימפה לאיברים כגון בלוטות הטחול והלימפה.
2. אתגר עכברי נמען יום אחד מאוחר עם האנטיגן.
   הערה:בדוגמה זו, אנו משתמשים ovalbumin (חלבון OVA, 50 מיקרוגרם / עכבר) כמו אנטיגן כי OVA ספציפי, הקולטן של תאי T (TCR) -transgenic תאי T הועברו adoptively לעכברים הנמען. כן חלבון OVA ב PBS סטרילית להזריק 100 μl של חלבון OVA / PBS או שליטת PBS, באמצעות זריקה תת עורית (סי), לתוך כל עכבר נמען ^5.
3. קציר וליצור השעיות תא בודדות מאיברים הלימפה (בלוטות הלימפה טחול) של עכברי נמען 3 ימים לאחר חיסון עם חלבון OVA או PBS. בלוטות הלימפה נפרדות לתוך בלוטות הלימפה הפרוקסימלית (PLN), הכולל בית השחי, זרוע ובלוטות לימפה צוואריות שטחיות) ובלוטות לימפה דיסטלי (DLN), הכולל mesenteric, popliteal, מפשעתי, המותני, ובלוטות לימפה זנב. תאי כתם באמצעות נוגדני FACS המתאימים כדי לבדוק התפשטות תאי T.
   הערה: בניסוי מעקב CFSE התא הזה, CFSE שכותרתו תאי T מעכברי שליטה הזריקו PBS להקים קרינת בסיס הלא-dividing תאים. חלוקות תא של מתרבים, מגורה-אנטיגן, שכותרתו תאי CFSE הם דמיינו ידי מדידת פסגות קרינת ^12,13. באמצעות השלט PBS, מספר חלוקות תא של מתרבים, CFSE שכותרתו בתאי T ניתן לקבוע ^12,13.
4. לנתח את נתוני התפשטות תאים שכותרתו CFSE על ידי השוואת מספר חלוקות תא או שיאים בין דגימות (איורים 1 ו -2).
   הערה: לדוגמה, CFSE שכותרתו, OVA הספציפי בתא T adoptively הועבר לעכברי נמען מקבלים את האנטיגן OVA יעבור התפשטות פעילה לעומת עכברי השליטה הזריק PBS ^5,12. יתר על כן, ראוי לציין לציין כי ישנן דרכים רבות כדי לנתח נתוני התפשטות תאי CFSE, כפי שהוכחו על ידי הוקינס ועמיתיו ^14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

טיהור תא מגנטית של לימפוציטים מאפשרת למשתמשים לטהר אוכלוסיית תא המטרה בסכום זמן קצר יחסית. שימוש בפרוטוקול הדלדול שלנו, הצלחנו להגדיל את אחוז תאי CD8 T (OT-I-הפעלת רקומבינציה גן-1 (RAG-1) עכברי -deficient) מ 72.8% (טיהור לפני כן) 94.2% (לאחר טיהור; ^4,5 איור 1A).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים נוהל טיהור לימפוציטים מאיברים הלימפה. טיהור תא באמצעות מיון חרוז מגנטי היא שיטה מהירה ופשוטה מניב קיימא, תאי יעד מטוהרים.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

כדאיויו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
RPMI 1640 (without L-Glutamine)	Gibco	31870025
Fetal Bovine Serum			Heat inactivated
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140114
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-CD43 magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-801	Mix well prior use
Streptavidin microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101	Mix well prior use
Anti-Annexin V magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-090-201	Mix well prior use
MACS LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
96-well U-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	650180
96-well F-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	655180
100 μm cell strainer mesh			To sterilize using UV radiation prior use
0.2 μm  sterile disposable filter units	Nalgene	567-0020	Can be substituted with any sterile filter device
CellTrace Violet	Invitrogen	C34557	CTV for short; alternative to CFSE
CellTrace Yellow	Invitrogen	C34567	CTY for short; alternative to CFSE
CellTrace Far Red	Invitrogen	C34564	CTFR for short; alternative to CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor 670	eBioscience	65-0840	CPD670 for short; alternative to CFSE
PKH26	Sigma Aldrich	PKH26GL	PKH26, alternative to CFSE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Dextrose	Sigma Aldrich	G7021
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5655
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S5136
Phenol Red	Sigma Aldrich	P0290
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Sodium chloride	Merck Millipore	S7653	Can use from other sources
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Tris-base
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Molecular Probes	C-1157	Reconstitute in DMSO
Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)	Sigma Aldrich	P1269
A23187 (Calcium ionophore)	Sigma Aldrich	C7522
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and recombinant protein
CD11b biotin (clone m1/70)	Biolegend	101204	T cell depletion cocktail
CD11c biotin (clone N418)	Biolegend	117304	T cell depletion cocktail
Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)	Biolegend	108404	T cell depletion cocktail
Ter119 biotin (clone Ter119)	Biolegend	116204	T cell depletion cocktail
TCR-γδ biotin (clone GL-3)	Biolegend	118103	T cell depletion cocktail
CD19 biotin (clone 6D5)	Biolegend	115504	T cell depletion cocktail
B220 biotin (clone RA3-6B2)	Biolegend	103204	T cell depletion cocktail
CD49b biotin (clone DX5)	Biolegend	108904	T cell depletion cocktail
CD4 biotin (clone GK1.5)	Biolegend	100404	T cell depletion cocktail
CD8 biotin (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	T cell depletion cocktail
F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated)	Jackson ImmunoResearch	115-006-075	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-mouse CD40 mAb (plate coated)	Pharmingen	553722	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-4	ProSpec	Cyt-282
LPS from E. coli Serotype 055:B5	Sigma Aldrich	L-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated)	eBioscience	16-0037-85	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)	eBioscience	16-0281-85	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-2	ProSpec	Cyt-370
Albumin from chicken egg white, Ovalbumin	Sigma Aldrich	A7641