Isolement et activation de murins Lymphocytes

Résumé

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Résumé

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen^1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses³. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting⁴ and the investigation of proliferative abilities by ³H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling^5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Introduction

Mature lymphocytes generally exist in the resting state if there is no pre-existing infection or inflammation in the individual. Therefore, it is important to retain the naïve status of lymphocytes during the isolation process before performing in vitro or in vivo functional assays. The key to ensuring consistent and reproducible results is to limit any unnecessary manipulation of the cells.

Magnetic cell sorting utilizes antibodies and microbeads to label cells so as to enrich the cell population of interest. With this approach, there are two purification strategies: positive enrichment and negative depletion. Positive enrichment enriches the cell population of interest using an antibody that binds to the target cells. Negative depletion, on the other hand, depletes non-target cells, leaving the cell population of interest. In our lab, we prefer negative depletion to positive enrichment because the binding of antibodies to the target cells could potentially alter cell features and behavior. In fact, many established cell surface markers suitable for the isolation of a particular cell population are also functional receptors.

Magnetic cell sorting not only yields highly pure populations of viable target cells, it is also less time-consuming and avoids the cellular stress induced by high-pressure flow used in fluorescence-activated cell sorting (FACS). By labeling the unwanted cell populations and depleting them using a magnetic separation column, we are able to perform rapid cell isolation without compromising the viability of the target cell population. In this protocol, we demonstrate the use of negative depletion strategies to purify naïve B cells or T cells.

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Protocole

Toutes les souris sont élevées et maintenues dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques et tous les protocoles de souris sont menées en conformité avec les directives du Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnels.

1. Préparation des tampons et réactifs

1. Préparer toutes les Roswell Park Memorial Institute (RPMI) moyenne (10% de sérum inactivé par la chaleur de fœtus bovin (FBS), 2 mM de L-glutamine, de la pénicilline (100 UI / ml) / streptomycine (100 ug / ml), 55 uM de 2-mercaptoéthanol ).
2. Préparer 20x solution saline équilibrée (BSS) Stock 1 et 2 Stock, séparément.
   1. Préparer 20x BSS stock 1 (111 mM dextrose, phosphate de potassium 8,8 mM, 26,7 mM phosphate disodique dans 1 litre d'eau stérile) et ajouter 40 ml 0,5% Phénol Red 20x BSS stock 1 avant ajustement de volume final. Filtre stérile en utilisant filtre de 0,2 um avant de les stocker à 4 ° C.
   2. Préparer 20x BSS stock 2 (25,8 mM de chlorure de calcium dihydraté, 107 mM de chlorure de potassium, ch 2,73 M de sodiumLoride, 19,6 mM de chlorure de magnésium hexahydraté, 16,6 mM de sulfate de magnésium dans 1 litre d'eau stérile). Filtre stérile en utilisant filtre de 0,2 um avant de les stocker à 4 ° C.
   3. Pour préparer 1x BSS pour une utilisation expérimentale, diluer 50 ml BSS stock 1 et 50 ml BSS stock 2, séparément, dans 400 ml d'eau stérile chacun. Combiner les deux solutions diluées, ajuster le pH à 7, et ajouter 20 ml de FBS (2%). Top à 1 L avec de l'eau stérile et filtre stérile en utilisant filtre de 0,2 um.
      REMARQUE: Les solutions de stock BSS doivent être préparés séparément, car le mélange des stocks BSS concentrées directement pourrait entraîner des précipitations.
3. Red Blood Cell (RBC) Lysis Buffer
   1. Pour préparer le tampon de lyse RBC, mélanger 9 parties de chlorure stock ammonium (155 mM de chlorure d'ammonium dans l'eau stérile) à 1 partie disponible Tris-base (130 mM de Tris (hydroxyméthyl) aminométhane dans l'eau stérile, pH 7,65) avant utilisation.
      NOTE: Magasin de solutions mères stériles de chlorure d'ammonium et Tris-base à 4 ° C. Préparer la lyse buffer frais pour assurer une lyse efficace des globules rouges.

2. Génération de Lymphocytes Suspension de Spleen ou les ganglions lymphatiques

NOTE: Il est important de préparer tous les réactifs et le matériel requis pour l'expérience avant l'euthanasie de la souris et de générer des suspensions de cellules isolées de lymphocytes le plus tôt possible pour maintenir les viabilités cellulaires élevées.

1. Euthanasier souris expérimentales par dislocation cervicale ou CO ₂ asphyxie.
   NOTE: A partir de cette étape en avant, toutes les procédures expérimentales doivent être effectuées de manière aseptique.
2. Trempez la totalité de la souris dans 70% d'éthanol avant de faire des incisions. Retirer la rate et les ganglions lymphatiques aseptique ^8, et les placer dans 15 ml tubes séparés contenant 5 ml glacée RPMI / FBS (RPMI avec 2% de FBS) ou BSS / FBS (de l' étape 1.2.3).
   NOTE: Depuis BSS empêche efficacement la lyse RBC, utilisez RPMI pour la préparation de la suspension de cellules spléniques et passer à BSS AFTElyse r RBC.
3. Pour générer une suspension de cellules isolées à partir de ganglions lymphatiques spléniques ou, placer l'organe (s) entre deux morceaux de stériles 100 um cellule crépine maille dans une boîte de Pétri contenant 2 ml glacé RPMI / FBS ou BSS / FBS. En utilisant le piston d'une seringue de 1 ml, écrasez l'organe (s) jusqu'à ce qu'il ait été déchiré en morceaux très fins.
4. Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml et laver le filtre cellulaire en filet avec de la glace à froid RPMI / FBS ou BSS / FBS. Recueillir la suspension cellulaire restante, ajouter dans le même tube de 15 ml, et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant.
   NOTE: Re-suspendre les cellules granulées en tapotant le tube avec les doigts avant d'ajouter RBC tampon de lyse ou moyenne dans les étapes suivantes.
5. Préparer la température ambiante tampon de lyse (RT) RBC pendant la centrifugation de la suspension cellulaire (voir l'étape 1.3.). Après la granulation des cellules et élimination du surnageant, remettre en suspension les cellules avec 1 ml de tampon de lyse RBC pour 10 ⁸ cellules. Incubate la réaction de lyse à température ambiante pendant 3-4 min.
6. Arrêtez lyse RBC avec 14 ml glacée BSS / FBS et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C.

3. Purification de B et cellules T

1. La purification des cellules B
   1. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Re-suspendre jusqu'à 10 ⁸ cellules spléniques dans 300 ul BSS / FBS et ajouter 50 ul anti-CD43 microbilles magnétiques ^9,10. Pour éliminer les cellules mortes, ajouter 30 pi de billes magnétiques Annexin V. Faire incuber la suspension de cellules dans un réfrigérateur C à 4 ° C pendant 30 min.
2. Purification des cellules T
   1. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Remettre en suspension jusqu'à 10 ⁸ cellules non-T , l' anticorps de déplétion des cellules cocktail (anticorps biotinylés contre CD19, B220, Gr-1, le TCR γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 et CD4 ou CD8 en fonction de la population cellulaire cible être purifié), dilué à 1: 200 dans 200 ul de BSS / FBS ^4,5. Faire incuber la suspension de cellules dans un4 ° C réfrigérateur pendant 15 min.
   2. Après incubation, ajouter 10 ml BSS / FBS pour laver les cellules et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 165 ul BSS / FBS avec 30 ul microbilles de streptavidine et 15 pi de billes magnétiques Annexin V. Faire incuber la suspension de cellules dans un réfrigérateur C à 4 ° C pendant 30 min.
      REMARQUE: Pour assurer même l'étiquetage avec les microbilles magnétiques, incuber les cellules avec des microbilles pendant 15 min, puis mélanger doucement la suspension cellulaire en tapotant le tube de 15 ml et incuber encore 15 minutes lors de l'étape 3.1.1. ou 3.2.2.
3. Préparation de la colonne de séparation pour cellulaire Purification
   1. Préparer une colonne de séparation utilisé pendant l'étiquetage de microbilles des cellules (étape 3.1.1. Ou 3.2.2.). Préchauffer BSS (sans FBS) à température ambiante et utiliser 2 ml pour laver et équilibrer la colonne aseptique. Après équilibration avec BSS, lavé la colonne ne doit pas être autorisé à sécher.
      NOTE: Nous utilisons les LS cOLONNE au lieu de la colonne de LD recommandée en raison de sa réutilisation (voir étape 3.4.).
   2. Après marquage avec les billes magnétiques, ajouter 14 ml BSS / FBS pour laver les cellules et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1-3 ml RT BSS.
   3. Fixer une aiguille 21 G stérile à la pointe de la colonne afin de réduire le débit au cours du processus de purification. Charger la suspension cellulaire sur la colonne équilibrée et de recueillir le débit à travers contenant les cellules cibles purifiées.
      REMARQUE: Évitez d'introduire des bulles dans la colonne pendant le chargement.
   4. Laver la colonne une fois avec 1 ml de BSS / FBS et de recueillir le débit à travers contenant les cellules cibles purifiées. Recharger la colonne avec de l'écoulement à travers encore une fois. Recueillir l'écoulement à travers le deuxième après le chargement dans le même tube de 15 ml.
   5. Laver la colonne 3 fois avec 1 ml de BSS / FBS et de recueillir le débit à travers contenant les cellules cibles purifiées. Par la suite, ajouter 5 ml BSS / FBS à the colonne, et avec un piston, rincer les cellules marquées magnétiquement hors de la colonne dans un nouveau tube de 15 ml.
   6. Vérifier la pureté des cellules recueillies par cytométrie de flux en utilisant des anticorps qui se lient à des antigènes de surface de B ou des lymphocytes T purifiés ^4,5.
4. Réutiliser la colonne de séparation
   NOTE: La colonne LS peut être réutilisé jusqu'à 4 fois sans affecter l'efficacité de purification.
   1. Laver la colonne 3 fois avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS) et 3 fois avec 5 ml d'eau distillée à partir du haut à l'aide du piston.
   2. Laver la colonne avec 5 ml 70% d'éthanol et sécher la colonne extensive en utilisant une prise d'air pour éviter l'accumulation de rouille dans la colonne.
   3. Pour préparer une colonne LS utilisé pour une expérience de purification séparée, laver la colonne de bas en haut avec 5 ml 70% d'éthanol en utilisant l'adaptateur de seringue. Ensuite, laver la colonne de bas en haut à deux reprises avec 5 ml de PBS stérile, puis 5 ml de PBS, une fois dans la partie supérieure de la colonne. Ajouter 2ml RT BSS pour équilibrer la colonne, puis procéder au chargement de la colonne avec des cellules marquées.

4. CFSE Étiquetage et Stimulation

REMARQUE: Les cellules purifiées peuvent être soumises à divers essais in vitro et in vivo , des essais fonctionnels. Ici, nous utilisons des cellules T purifiées afin de déterminer la capacité des véhicules blindés ⁵ de stimulation des lymphocytes T.

1. solution de pré-marquage chaud (0,1% de FBS dans du PBS) à 37 ° C avant chargement CFSE.
   REMARQUE: L'utilisation d'un faible pourcentage de FBS dans du PBS réduit la mort cellulaire pendant le chargement CFSE et minimise la perte de cellules lors de la centrifugation. Cependant, trop de FBS peuvent interférer avec CFSE chargement.
2. Laver les cellules purifiées deux fois avec une solution d'étiquetage, puis remis en suspension à 2 x 10 ⁷ cellules / ml dans une solution d'étiquetage préchauffé dans un tube de 15 ml.
3. Préparer 10 solution de CFSE uM (dilution 1: 500 de 5 mM CFSE solution mère) dans une solution d'étiquetage préchauffé. solution CFSE devraitêtre fraîchement préparé chaque fois pour réaliser l'étiquetage optimal.
4. Pour charger les cellules avec CFSE, ajouter la suspension cellulaire 1 partie à 1 partie 10 solution uM de CFSE dans un tube de 15 ml et incuber dans l'obscurité pendant 10 min à 37 ° C. Une concentration finale de 5 pM de CFSE est utilisé pour marquer 1 x 10 ⁷ cellules / ml.
5. Inverser le tube toutes les 2 min pour assurer un mélange homogène de cellules CFSE pendant le chargement.
6. Pour arrêter la réaction, ajouter plusieurs volumes de milieu RPMI complet glacée et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C. Après avoir réussi à CFSE chargement, le culot cellulaire apparaît jaunâtre.
7. Wash CFSE cellules chargé une fois de plus avec un milieu RPMI complet glacée et centrifuger à 453 g pendant 5 min à 4 ° C avant d' utiliser pour la culture in vitro ou in vivo la stimulation.

5. stimulation in vitro

1. Préparer une solution 2x stock de stimuli (2x stimuli stock solution) immédiatement avant l'utilisation de telle sorte que 100 pl de 2x solution stimuli de stock peut être ajouté à 100 pi de cellules à un volume final de 200 pi par puits dans une plaque à 96 puits.
2. Si une plaque revêtue de stimuli (IgM ou CD40 pour des cellules B ou CD3 et CD28 pour les lymphocytes T) est nécessaire, on dilue les stimuli dans du PBS et de pré-enduire la plaque de culture à 4 ° C jusqu'au lendemain. En variante, la plaque de culture peut être revêtu à 37 ° C pendant 1 heure, le jour de l'expérience. Laver la plaque revêtue à deux reprises avec du PBS (Ne pas laisser sécher la plaque à tout moment).

Pour les cellules B
Stimuli	La concentration finale
F (ab ') 2 de chèvre anti-IgM de souris	0,6 à 2,4 pg / ml
Anti-souris CD40 mAb	0,5 à 2 pg / ml
recombinantsouris IL-4	25 U / ml
lipopolysaccharide	0,1 à 10 pg / ml
(LPS) de E. coli sérotype 055: B5
Pour les lymphocytes T
Stimuli	La concentration finale
Anti-CD3 (coated plate)	2 à 10 pg / ml
(50 ul / puits pour le revêtement)
Anti-CD28 (coated plate)	2 pg / ml
IL-2 recombinante	40 U / ml
PDBu (ester de phorbol)	5-50 ng / ml
A23187 (Calcium ionophore)	250 ng / ml

Tableau 1: Concentration de stimuli utilisés pour stimuler les lymphocytes en culture in vitro.

3. Pour les cellules B CFSE marqués, re-suspension à 3 x 10 ⁶ cellules / ml dans un milieu RPMI complet et de la culture en triple exemplaire , avec 3 x 10 ⁵ cellules / puits dans 96 puits de plaques à fond plat pour 72 h.
4. Pour les cellules T CFSE marqués, re-suspension à 0,5-3 x 10 ⁶ cellules / ml dans un milieu RPMI complet et culture en triple avec 0,5-3 x 10 ⁵ cellules / puits dans 96 puits de plaques à fond rond pour 48 ou 72 heures .

6. La stimulation in vivo

1. Pour la stimulation in vivo, le transfert de manière adoptive 4 x 10 ⁶ cellules T marquées au CFSE par souris ( par voie intraveineuse (iv) dans 200 ul de PBS) dans chaque souris receveuse MHC assorti.
   NOTE: Dans ce protocole, les cellules T CFSE-marquées peuvent être transférées en utilisant adoptivement veine de la queue ou par injection rétro-orbital, car ces cellules seront à la maison lymphoïdes organes tels que les ganglions lymphatiques et la rate.
2. Récuser les souris receveuses un jour plus tard avec l'antigène.
   REMARQUE:Dans cet exemple, on utilise l'ovalbumine (protéine OVA, 50 ug / souris) comme antigène en raison spécifiques de l'OVA, le récepteur des cellules T (TCR) des cellules T -transgenic ont été transférés de manière adoptive chez des souris receveuses. Préparer la protéine OVA dans du PBS stérile et injecter 100 pi de OVA protéine / PBS ou le contrôle PBS, par injection sous - cutanée (si), dans chaque souris receveuse ^5.
3. La récolte et de générer des suspensions individuelles de cellules à partir des organes lymphoïdes (ganglions lymphatiques et la rate) des souris receveuses 3 jours après l'immunisation avec la protéine OVA ou du PBS. ganglions lymphatiques séparés dans proximales des ganglions lymphatiques (PLN), qui comprend axillaire, brachial et les ganglions lymphatiques cervicaux superficiels) et distales des ganglions lymphatiques (DLN), qui comprend mésentérique, poplitée, inguinale, lombaire, et les ganglions lymphatiques caudales. cellules Stain utilisant les anticorps FACS appropriés pour vérifier T la prolifération cellulaire.
   NOTE: Dans cette expérience, la cellule de suivi de CFSE, CFSE marqué les cellules T provenant de souris témoins PBS injecté établir une fluorescence de base pour les non-diViding cellules. Divisions cellulaires de prolifération, cellules CFSE marqués stimulés par un antigène sont visualisés par la mesure des pics de fluorescence ^12,13. Avec le contrôle PBS, le nombre de divisions cellulaires de prolifération, les cellules T CFSE marquées peut être déterminée ^12,13.
4. Analyser les données de prolifération de cellules CFSE marqué en comparant le nombre de divisions cellulaires ou des pics entre les échantillons (figures 1 et 2).
   REMARQUE: par exemple, CFSE marqué, des cellules T spécifiques de l' OVA par transfert adoptif dans des souris receveuses recevant l'antigène OVA feront l' objet d'une prolifération active par rapport aux souris témoins PBS injecté ^5,12. En outre, il est remarquable de souligner qu'il existe de nombreuses façons d'analyser les données de prolifération des cellules CFSE, comme démontré par Hawkins et ses collègues ^14.

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Résultats

la purification magnétique des cellules de lymphocytes permet de purifier une population de cellules cibles dans un temps relativement court laps de temps. En utilisant notre protocole d'épuisement, nous avons été en mesure d'augmenter le pourcentage de cellules T CD8 (OT-I dans la recombinaison activant le gène-1 (RAG-1) souris ayant un déficit) de 72,8% (avant purification) à 94,2% (après purification; La figure 1A) ^4,5. Ces lymphocytes purif...

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Discussion

Dans ce protocole, nous démontrons une procédure pour la purification de lymphocytes provenant d'organes lymphoïdes. purification cellulaire utilisant bille magnétique tri est une méthode simple et rapide qui donne des cellules cibles viables et hautement purifiés.

Étapes critiques dans le Protocole

La viabilité cellulaire et le rendement des cellules

Le maintien de la viabilité des cellule...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
RPMI 1640 (without L-Glutamine)	Gibco	31870025
Fetal Bovine Serum			Heat inactivated
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140114
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-CD43 magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-801	Mix well prior use
Streptavidin microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101	Mix well prior use
Anti-Annexin V magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-090-201	Mix well prior use
MACS LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
96-well U-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	650180
96-well F-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	655180
100 μm cell strainer mesh			To sterilize using UV radiation prior use
0.2 μm  sterile disposable filter units	Nalgene	567-0020	Can be substituted with any sterile filter device
CellTrace Violet	Invitrogen	C34557	CTV for short; alternative to CFSE
CellTrace Yellow	Invitrogen	C34567	CTY for short; alternative to CFSE
CellTrace Far Red	Invitrogen	C34564	CTFR for short; alternative to CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor 670	eBioscience	65-0840	CPD670 for short; alternative to CFSE
PKH26	Sigma Aldrich	PKH26GL	PKH26, alternative to CFSE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Dextrose	Sigma Aldrich	G7021
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5655
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S5136
Phenol Red	Sigma Aldrich	P0290
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Sodium chloride	Merck Millipore	S7653	Can use from other sources
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Tris-base
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Molecular Probes	C-1157	Reconstitute in DMSO
Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)	Sigma Aldrich	P1269
A23187 (Calcium ionophore)	Sigma Aldrich	C7522
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and recombinant protein
CD11b biotin (clone m1/70)	Biolegend	101204	T cell depletion cocktail
CD11c biotin (clone N418)	Biolegend	117304	T cell depletion cocktail
Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)	Biolegend	108404	T cell depletion cocktail
Ter119 biotin (clone Ter119)	Biolegend	116204	T cell depletion cocktail
TCR-γδ biotin (clone GL-3)	Biolegend	118103	T cell depletion cocktail
CD19 biotin (clone 6D5)	Biolegend	115504	T cell depletion cocktail
B220 biotin (clone RA3-6B2)	Biolegend	103204	T cell depletion cocktail
CD49b biotin (clone DX5)	Biolegend	108904	T cell depletion cocktail
CD4 biotin (clone GK1.5)	Biolegend	100404	T cell depletion cocktail
CD8 biotin (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	T cell depletion cocktail
F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated)	Jackson ImmunoResearch	115-006-075	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-mouse CD40 mAb (plate coated)	Pharmingen	553722	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-4	ProSpec	Cyt-282
LPS from E. coli Serotype 055:B5	Sigma Aldrich	L-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated)	eBioscience	16-0037-85	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)	eBioscience	16-0281-85	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-2	ProSpec	Cyt-370
Albumin from chicken egg white, Ovalbumin	Sigma Aldrich	A7641