Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

Zusammenfassung

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Zusammenfassung

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen^1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses³. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting⁴ and the investigation of proliferative abilities by ³H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling^5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Einleitung

Mature lymphocytes generally exist in the resting state if there is no pre-existing infection or inflammation in the individual. Therefore, it is important to retain the naïve status of lymphocytes during the isolation process before performing in vitro or in vivo functional assays. The key to ensuring consistent and reproducible results is to limit any unnecessary manipulation of the cells.

Magnetic cell sorting utilizes antibodies and microbeads to label cells so as to enrich the cell population of interest. With this approach, there are two purification strategies: positive enrichment and negative depletion. Positive enrichment enriches the cell population of interest using an antibody that binds to the target cells. Negative depletion, on the other hand, depletes non-target cells, leaving the cell population of interest. In our lab, we prefer negative depletion to positive enrichment because the binding of antibodies to the target cells could potentially alter cell features and behavior. In fact, many established cell surface markers suitable for the isolation of a particular cell population are also functional receptors.

Magnetic cell sorting not only yields highly pure populations of viable target cells, it is also less time-consuming and avoids the cellular stress induced by high-pressure flow used in fluorescence-activated cell sorting (FACS). By labeling the unwanted cell populations and depleting them using a magnetic separation column, we are able to perform rapid cell isolation without compromising the viability of the target cell population. In this protocol, we demonstrate the use of negative depletion strategies to purify naïve B cells or T cells.

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Protokoll

Alle Mäuse gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen und alle Maus-Protokolle werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Use Committee geführt gehalten.

1. Herstellung von Puffer und Reagenzien

1. Bereiten vollständige Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium (10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (100 IU / ml) / Streptomycin (100 ug / ml), 55 uM 2-Mercaptoethanol ).
2. Bereiten Sie 20x Balanced Salt Solution (BSS) Lager 1 und Lager 2, getrennt.
   1. Bereiten Sie 20x BSS Lager 1 (111 mM Dextrose, 8,8 mM Kaliumphosphat, 26,7 mM Dinatriumhydrogenphosphat in 1 l sterilem Wasser) und 40 ml 0,5% Phenolrot bis 20x BSS Lager 1 vor Endvolumeneinstellung. Sterilfilter unter Verwendung von 0,2-um-Filter, bevor bei 4 ° C lagern.
   2. Bereiten Sie 20x BSS Lager 2 (25,8 mM Calciumchloriddihydrat, 107 mM Kaliumchlorid, 2,73 M Natrium chloride, 19,6 mM Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 16,6 mM Magnesiumsulfat in 1 l sterilem Wasser). Sterilfilter unter Verwendung von 0,2-um-Filter, bevor bei 4 ° C lagern.
   3. 1x BSS für den experimentellen Einsatz, verdünnen 50 ml BSS Lager 1 und 50 ml BSS Lager 2, getrennt, in 400 ml sterilem Wasser je vorzubereiten. Kombinieren Sie beide verdünnten Lösungen, passen auf pH 7 und 20 ml FBS (2%). Top bis zu 1 L mit sterilem Wasser und Sterilfilter mit 0,2 um Filter.
      HINWEIS: BSS Stammlösungen separat hergestellt werden sollte, weil die Mischung von konzentrierter BSS Aktien direkt in Ausfällen führen kann.
3. Rote Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer
   1. RBC Lysispuffer, mischen 9 Teile Lager Ammoniumchlorid (155 mM Ammoniumchlorid in sterilem Wasser) zu 1 Teil Lager Tris-Base (130 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan in sterilem Wasser, pH-Wert 7,65) vor dem Gebrauch zu bereiten.
      HINWEIS: Shop sterilen Stammlösungen von Ammoniumchlorid und Tris-Base bei 4 ° C. Bereiten Sie die Lyse bUffer frisch effiziente Lyse von roten Blutkörperchen zu gewährleisten.

2. Erzeugung von Lymphozytensuspension aus Milz oder Lymphknoten

Hinweis: Es ist wichtig, dass alle Reagenzien und Geräte für das Experiment vor Maus Euthanasie und zur Erzeugung Einzelzellsuspensionen von Lymphozyten so schnell wie möglich zu halten hohe Zellviabilitäten erforderlich vorzubereiten.

1. Euthanize experimentellen Maus durch Genickbruch oder CO ₂ Ersticken.
   HINWEIS: Von diesem Schritt an gelten alle experimentellen Verfahren unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden sollte.
2. Tauchen Sie die gesamte Maus in 70% Ethanol, bevor irgendwelche Schnitte zu machen. Entfernen Sie die Milz und Lymphknoten aseptisch ^8, und legen Sie sie in einem separaten 15 - ml - Röhrchen , die 5 ml eiskaltem RPMI / FBS (RPMI mit 2% FBS) oder BSS / FBS (aus Schritt 1.2.3).
   HINWEIS: Da BSS effiziente RBC-Lyse verhindert, verwenden RPMI für die Herstellung der Milz- Zellsuspension und wechseln Sie zu BSS nacr RBC-Lyse.
3. Um eine einzelne Zellsuspension aus der Milz oder Lymphknoten, legen Sie das Organ (e) zwischen zwei Stücken von sterilen 100 & mgr; m Zellsieb mesh in einer Petrischale mit 2 ml eiskaltem RPMI / FBS oder BSS / FBS erzeugen. Mit dem Kolben einer 1-ml-Spritze, zerdrücken die Orgel (n), bis er in sehr feine Teile zerrissen wurde.
4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen und waschen Sie die Zelle Sieb mit eiskaltem RPMI / FBS oder BSS / FBS Netz. Sammeln Sie die restlichen Zellsuspension, fügen Sie ihn auf den gleichen 15-ml-Tube und Spin-down bei 453 × g für 5 Minuten bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand.
   HINWEIS: Die pelletierten Zellen erneut zu suspendieren, indem das Rohr mit den Fingern Ausklopfen vor RBC-Lyse Puffer oder Medium in den nachfolgenden Schritten hinzugefügt wird.
5. Vorbereitung Raumtemperatur (RT) RBC-Lyse-Puffer während der Zentrifugation der Zellsuspension (siehe Schritt 1.3.). Nachdem die Zellen pelletiert und Entfernen des Überstands, resuspendieren der Zellen mit 1 ml Puffer RBC - Lyse je 10 ⁸ Zellen. Incubate die Lysereaktion bei RT für 3-4 min.
6. Stopp RBC Lyse mit 14 ml eiskaltem BSS / FBS und Spin-down bei 453 × g für 5 Minuten bei 4 ° C.

3. Reinigung von B und T-Zellen

1. Reinigung von B-Zellen
   1. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Re-suspendieren bis zu 10 ⁸ Milzzellen in 300 & mgr; l BSS / FBS und 50 & mgr; l anti-CD43 ^9,10 magnetischen Mikrokügelchen hinzuzufügen. Zum Entfernen von toten Zellen, fügen Sie 30 ul Annexin V magnetischen Kügelchen. Inkubieren der Zellsuspension in einem 4 ° C Kühlschrank für 30 min.
2. Reinigung von T-Zellen
   1. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Re-suspendieren bis zu 10 ⁸ Zellen in nicht-T - Zell - Depletion - Antikörper - Cocktail (biotinylierter Antikörper gegen CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 und CD4 oder CD8 abhängig von der Zielzellpopulation gereinigt werden), 1: 200 verdünnt in 200 & mgr; l BSS / FBS ^4,5. Inkubieren der Zellsuspension in ein4 ° C Kühlschrank für 15 min.
   2. Nach der Inkubation, 10 ml BSS / FBS die Zellen und Spin-down bei 453 × g für 5 Minuten bei 4 ° C zu waschen. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in 165 & mgr; l BSS / FBS mit 30 & mgr; l Streptavidin-Mikrokügelchen und 15 & mgr; l Annexin V magnetischen Kügelchen. Inkubieren der Zellsuspension in einem 4 ° C Kühlschrank für 30 min.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass auch mit den magnetischen Mikrokügelchen Markierung, die Zellen mit Microbeads für 15 min inkubieren, dann die Zellsuspension vorsichtig mischen, indem die 15-ml-Röhrchen klopfen und weitere 15 min bei Schritt 3.1.1 inkubiert. oder 3.2.2.
3. Herstellung von Trennsäule für Zellreinigung
   1. Bereiten Sie eine nicht verwendete Trennsäule während Mikrobead Markierung der Zellen (Schritt 3.1.1. Oder 3.2.2.). Vorwärmen BSS (ohne FBS) auf RT und verwenden 2 ml die Säule aseptisch zu waschen und ins Gleichgewicht. Nach Äquilibrierung mit BSS sollte die gewaschene Säule nicht austrocknen gelassen werden.
      HINWEIS: Wir verwenden die LS cPALTE anstelle der Spalte empfohlen LD aufgrund seiner Wiederverwendbarkeit (siehe Schritt 3.4.).
   2. Nach der Markierung mit den magnetischen Kügelchen, fügen Sie 14 ml BSS / FBS die Zellen und Spin-down bei 453 × g für 5 Minuten bei 4 ° C zu waschen. Entfernen Sie den Überstand und erneut die Zellen in 1-3 ml RT BSS.
   3. Befestigen eines sterilen 21 G Nadel an der Spitze der Säule, die Durchflussrate während des Prozesses der Reinigung zu reduzieren. Laden die Zellsuspension auf die äquilibrierte Säule und Sammeln des Durchflusses durch die gereinigten Zielzellen enthält.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Blasen in die Spalte während des Ladens einzuführen.
   4. Die Säule wird einmal mit 1 ml BSS / FBS und sammle die Strömung durch die gereinigten Zielzellen enthält. Neuladen der Säule mit dem Fluss durch wieder. Sammeln Sie die Strömung durch nach dem zweiten Laden in der gleichen 15-ml-Tube.
   5. Die Säule wird 3-mal mit 1 ml BSS / FBS und sammeln die Strömung durch die gereinigten Zielzellen enthält. Danach werden 5 ml BSS / FBS zu the-Säule und mit einem Kolben, spülen Sie die magnetisch markierten Zellen aus der Säule in ein neues 15-ml-Tube.
   6. Überprüfen Sie die Reinheit der durch Strömungs gesammelten Zellen Zytometrie unter Verwendung von Antikörpern , die Antigene binden , ^4,5 gereinigtes B oder T - Zellen an die Oberfläche.
4. Die Wiederverwendung von der Trennsäule
   HINWEIS: Die LS Spalte bis 4 Mal wiederverwendet werden kann, ohne Reinigungswirkungsgrad zu beeinträchtigen.
   1. Die Säule wird 3-mal mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 3-mal mit 5 ml destilliertem Wasser von oben den Kolben verwendet wird.
   2. Die Säule wird mit 5 ml 70% Ethanol und trocknet die Säule ausgiebig einen Lufthahn mit dem Aufbau von Rost in der Säule zu verhindern.
   3. Um eine gebrauchte LS-Säule für eine separate Reinigung Experiment vorzubereiten, waschen Sie die Säule von unten nach oben mit 5 ml 70% Ethanol mit dem Spritzenadapter. Als nächstes waschen Sie die Spalte von unten einmal von der Spitze der Säule mit 5 ml PBS zweimal mit 5 ml sterilem PBS, gefolgt. In 2ml RT BSS die Säule und dann fahren Sie mit dem Laden der Säule mit markierten Zellen zu äquilibrieren.

4. CFSE Labeling und Stimulation

HINWEIS: Gereinigte Zellen können auf eine Vielzahl von in vitro und in vivo funktionellen Assays unterzogen werden. Hier verwenden wir gereinigten T - Zellen , die T - Zell - Stimulation Fähigkeit von APCs ⁵ zu bestimmen.

1. Vorwärmen Markierungslösung (0,1% FBS in PBS) auf 37 ° C vor der CFSE Belastung.
   HINWEIS: einen geringen Prozentsatz an FBS in PBS Verwendung reduziert Zelltod während CFSE Laden und minimiert Zellverlust während der Zentrifugation. Doch zu viel FBS kann mit CFSE Laden stören.
2. Bei 2 x 10 ⁷ Zellen / ml in vorgewärmten Markierungslösung in einem Rohr 15 ml Waschen gereinigt Zellen zweimal mit Markierungslösung, dann wieder suspendiert.
3. Bereiten Sie 10 & mgr; M CFSE-Lösung (1: 500 Verdünnung von 5 mM CFSE Stammlösung) in vorgewärmten Markierungslösung. CFSE Lösung solltewerden jeweils frisch zu erreichen optimale Kennzeichnung vorbereitet.
4. Um Zellen mit CFSE laden, fügen 1 Teil Zellsuspension zu 1 Teil 10 & mgr; M CFSE-Lösung in einem 15-ml-Röhrchen und Inkubation im Dunkeln für 10 min bei 37 ° C. Eine Endkonzentration von 5 & mgr; M CFSE verwendet ml zu etikettieren 1 x 10 ⁷ Zellen /.
5. Drehen Sie das Röhrchen alle 2 Minuten eine homogene Mischung von Zellen während der CFSE Belastung zu gewährleisten.
6. Um die Reaktion zu stoppen, mehrere Bände eiskaltem komplettem RPMI Medium hinzufügen und Spin-down bei 453 × g für 5 Minuten bei 4 ° C. Nach dem erfolgreichen CFSE Laden wird das Zellpellet gelblich erscheinen.
7. Wash CFSE Zellen ein weiteres Mal mit eiskaltem kompletten RPMI - Medium und Spin - down bei 453 × g für 5 Minuten bei 4 ° C geladen , bevor sie für in - vitro - Kultivierung oder in vivo Stimulation verwendet wird .

5. In - vitro - Stimulation

1. Bereiten Sie eine 2x-Stammlösung von Reizen (2x Stimuli Stammlösung) unmittelbar vor der Anwendung, so dass 100 & mgr; l 2x Stimuli Stammlösung kann in einer 96-Well-Platte zu 100 ul Zellen zu einem Endvolumen von 200 & mgr; l pro Vertiefung zugegeben werden.
2. Wenn eine Platte mit Stimuli (IgM oder CD40 für B-Zellen oder CD3 und CD28 für T-Zellen), aufgetragen erforderlich ist, verdünnt die Stimuli in PBS und pre-coat der Kulturplatte bei 4 ° C über Nacht. Alternativ kann der Kulturplatte bei 37 ° C für 1 Stunde am Tag des Versuchs überzogen werden. Waschen Sie die beschichtete Platte zweimal mit PBS (Nicht in die Platte zu jeder Zeit zu trocknen).

Für B - Zellen
Stimuli	Die Endkonzentration
F (ab ') 2 Ziegen-anti-Maus-IgM	0,6-2,4 & mgr; g / ml
Anti-Maus-CD40 mAb	0,5-2 & mgr; g / ml
RekombinanteMaus-IL-4	25 U / ml
Lipopolysaccharide	0,1-10 & mgr; g / ml
(LPS) aus E. coli Serotyp 055: B5
Für T - Zellen
Stimuli	Die Endkonzentration
Anti-CD3 (Platte beschichtet)	2-10 & mgr; g / ml
(50 & mgr; l / Vertiefung für die Beschichtung)
Anti-CD28 (Platte beschichtet)	2 & mgr; g / ml
Rekombinantes IL-2	40 U / ml
PDBu (Phorbol ester)	5-50 ng / ml
A23187 (Calciumionophor)	250 ng / ml

Tabelle 1: Die Konzentrationen von Stimuli Lymphozyten in in - vitro - Kultur zu stimulieren.

3. Für CFSE-markierten B - Zellen, resuspendieren bis 3 x 10 ⁶ Zellen / ml in komplettem RPMI - Medium und der Kultur in dreifacher Ausfertigung mit 3 x 10 ⁵ Zellen / Vertiefung in 96-well - Flachbodenplatten für 72 Stunden.
4. Für CFSE-markierten T - Zellen, resuspendieren zu 0,5-3 x 10 ⁶ Zellen / ml in komplettem RPMI - Medium und der Kultur in dreifacher Ausführung mit 0,5-3 x 10 ⁵ Zellen / Well in 96-Well - Rundbodenplatten für 48 oder 72 Std .

6. In - vivo - Stimulation

1. Für in vivo Stimulation, adoptiv Übertragungs 4 x 10 ⁶ CFSE-markierten T - Zellen pro Maus (intravenös (iv) in 200 & mgr; l PBS) in jedes MHC-angepaßten Empfängermaus.
   HINWEIS: In diesem Protokoll CFSE-markierten T-Zellen adoptiv übertragen werden können Schwanzvene oder retroorbitale Injektions da diese Zellen verwendet werden Hause Organe wie die Milz und Lymphknoten lymphoiden.
2. Fordern Sie die Empfängermäuse 1 Tag später mit dem Antigen.
   HINWEIS:In diesem Beispiel verwenden wir Ovalbumin (OVA-Protein, 50 & mgr; g / Maus) als Antigen weil OVA-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) -transgene T-Zellen adoptiv in Empfängermäuse transferiert. Bereiten Sie OVA Protein in sterilem PBS und injizieren 100 ul OVA Protein / PBS oder PBS - Kontrolle wird über eine subkutane Injektion (si), in jede Empfängermaus ^5.
3. Ernte und Einzelzellsuspensionen aus lymphatischen Organen (Lymphknoten und Milz) erzeugen von Empfängermäuse 3 Tage nach der Immunisierung mit OVA-Protein oder PBS. Separate Lymphknoten in proximal-Lymphknoten (PLN), die Achsel umfasst, brachialis und oberflächlicher Lymphknoten) und distale Lymphknoten (dLN), die mesenterischen umfasst, popliteal, inguinal, Lenden- und caudal Lymphknoten. Stain Zellen die entsprechenden FACS unter Verwendung von Antikörpern für T-Zellproliferation zu überprüfen.
   HINWEIS: In diesem CFSE Zelle Tracking-Experiment, CFSE-markierten T-Zellen von PBS-injizierten Kontrollmäusen eine Fluoreszenzbasis für Nicht-di etablierenViding Zellen. Zellteilungen von proliferierenden, Antigen-stimulierten, CFSE-markierten Zellen werden durch Messen Fluoreszenzpeaks ^12,13 visualisiert. Mit der PBS - Kontrolle, die Anzahl der Zellteilungen von proliferierenden, CFSE-markierten T - Zellen können ^12,13 bestimmt werden.
4. Analyse der CFSE-markierten Zellproliferationsdaten durch die Anzahl der Zellteilungen zu vergleichen oder Spitzen zwischen den Proben (1 und 2).
   HINWEIS: Zum Beispiel CFSE-markierte, OVA-spezifischen T - Zellen adoptiv Empfängermäuse übertragen in das OVA - Antigen empfangen wird aktiv proliferieren im Vergleich zu den PBS-injizierten Kontrollmäusen ^5,12. Darüber hinaus ist es bemerkenswert , darauf hinweisen , dass es viele Wege gibt CFSE Zellproliferationsdaten zu analysieren, wie ¹⁴ von Hawkins und Kollegen gezeigt.

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Ergebnisse

Magnetzellreinigung von Lymphozyten erlaubt Benutzern, eine Zielzellpopulation in einer relativ kurzen Zeit zu reinigen. Mit unserem Verarmungs Protokoll konnten wir den Prozentsatz der CD8-T-Zellen (OT-I in Rekombinations-aktivierendes Gen-1 (RAG-1) -defiziente Mäuse) von 72,8% (vor Reinigung) auf 94,2% (nach der Reinigung zu erhöhen; 1A) ^4,5. Diese gereinigten Lymphozyten können dann für die nachfolgende funktionelle Assays verwendet werden , um die Lymp...

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Diskussion

In diesem Protokoll zeigen wir ein Verfahren für die Lymphozyten aus lymphoiden Organen zu reinigen. Zellreinigung magnetischen Kügelchen Sortieranlage verwendet, ist eine schnelle und einfache Methode, die lebensfähige, hochgereinigten Zielzellen ergibt.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Die Lebensfähigkeit der Zellen und Zellausbeute

Die Aufrechterhaltung Lebensfähigkeit von hämatopoet...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
RPMI 1640 (without L-Glutamine)	Gibco	31870025
Fetal Bovine Serum			Heat inactivated
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140114
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-CD43 magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-801	Mix well prior use
Streptavidin microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101	Mix well prior use
Anti-Annexin V magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-090-201	Mix well prior use
MACS LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
96-well U-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	650180
96-well F-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	655180
100 μm cell strainer mesh			To sterilize using UV radiation prior use
0.2 μm  sterile disposable filter units	Nalgene	567-0020	Can be substituted with any sterile filter device
CellTrace Violet	Invitrogen	C34557	CTV for short; alternative to CFSE
CellTrace Yellow	Invitrogen	C34567	CTY for short; alternative to CFSE
CellTrace Far Red	Invitrogen	C34564	CTFR for short; alternative to CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor 670	eBioscience	65-0840	CPD670 for short; alternative to CFSE
PKH26	Sigma Aldrich	PKH26GL	PKH26, alternative to CFSE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Dextrose	Sigma Aldrich	G7021
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5655
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S5136
Phenol Red	Sigma Aldrich	P0290
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Sodium chloride	Merck Millipore	S7653	Can use from other sources
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Tris-base
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Molecular Probes	C-1157	Reconstitute in DMSO
Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)	Sigma Aldrich	P1269
A23187 (Calcium ionophore)	Sigma Aldrich	C7522
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and recombinant protein
CD11b biotin (clone m1/70)	Biolegend	101204	T cell depletion cocktail
CD11c biotin (clone N418)	Biolegend	117304	T cell depletion cocktail
Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)	Biolegend	108404	T cell depletion cocktail
Ter119 biotin (clone Ter119)	Biolegend	116204	T cell depletion cocktail
TCR-γδ biotin (clone GL-3)	Biolegend	118103	T cell depletion cocktail
CD19 biotin (clone 6D5)	Biolegend	115504	T cell depletion cocktail
B220 biotin (clone RA3-6B2)	Biolegend	103204	T cell depletion cocktail
CD49b biotin (clone DX5)	Biolegend	108904	T cell depletion cocktail
CD4 biotin (clone GK1.5)	Biolegend	100404	T cell depletion cocktail
CD8 biotin (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	T cell depletion cocktail
F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated)	Jackson ImmunoResearch	115-006-075	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-mouse CD40 mAb (plate coated)	Pharmingen	553722	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-4	ProSpec	Cyt-282
LPS from E. coli Serotype 055:B5	Sigma Aldrich	L-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated)	eBioscience	16-0037-85	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)	eBioscience	16-0281-85	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-2	ProSpec	Cyt-370
Albumin from chicken egg white, Ovalbumin	Sigma Aldrich	A7641