L'isolamento e l'attivazione di linfociti murini

Riepilogo

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Abstract

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen^1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses³. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting⁴ and the investigation of proliferative abilities by ³H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling^5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Introduzione

Mature lymphocytes generally exist in the resting state if there is no pre-existing infection or inflammation in the individual. Therefore, it is important to retain the naïve status of lymphocytes during the isolation process before performing in vitro or in vivo functional assays. The key to ensuring consistent and reproducible results is to limit any unnecessary manipulation of the cells.

Magnetic cell sorting utilizes antibodies and microbeads to label cells so as to enrich the cell population of interest. With this approach, there are two purification strategies: positive enrichment and negative depletion. Positive enrichment enriches the cell population of interest using an antibody that binds to the target cells. Negative depletion, on the other hand, depletes non-target cells, leaving the cell population of interest. In our lab, we prefer negative depletion to positive enrichment because the binding of antibodies to the target cells could potentially alter cell features and behavior. In fact, many established cell surface markers suitable for the isolation of a particular cell population are also functional receptors.

Magnetic cell sorting not only yields highly pure populations of viable target cells, it is also less time-consuming and avoids the cellular stress induced by high-pressure flow used in fluorescence-activated cell sorting (FACS). By labeling the unwanted cell populations and depleting them using a magnetic separation column, we are able to perform rapid cell isolation without compromising the viability of the target cell population. In this protocol, we demonstrate the use of negative depletion strategies to purify naïve B cells or T cells.

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Protocollo

Tutti i topi sono allevati e mantenuti in specifiche condizioni di assenza di patogeni e tutti i protocolli del mouse sono condotte in conformità con le linee guida del Comitato Cura e uso istituzionale degli animali.

1. Preparazione di tamponi e reagenti

1. Preparare completa Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (siero 10% inattivato al calore bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, penicillina (100 UI / ml) / streptomicina (100 mcg / ml), 55 mM 2-mercaptoetanolo ).
2. Preparare 20x soluzione salina bilanciata (BSS) 1 Stock e della 2, separatamente.
   1. Preparare 20x BSS magazzino 1 (111 mm destrosio, potassio fosfato 8,8 mm, 26,7 mM sodio fosfato bibasico in 1 L di acqua sterile) e aggiungere 40 ml di 0,5% rosso fenolo a 20x BSS giacenza 1 prima della messa a punto finale del volume. filtro sterile con 0,2 micron filtro prima di riporre a 4 ° C.
   2. Preparare 20x BSS magazzino 2 (25.8 mM cloruro di calcio diidrato, cloruro di potassio 107 mM, ch 2,73 M di sodioLoride, 19.6 mM di cloruro di magnesio esaidrato, 16,6 mM solfato di magnesio in 1 L di acqua sterile). filtro sterile con 0,2 micron filtro prima di riporre a 4 ° C.
   3. Per preparare 1x BSS per uso sperimentale, diluire 50 ml di BSS magazzino 1 e 50 ml BSS magazzino 2, separatamente, in 400 ml di acqua sterile ciascuno. Combinare entrambe le soluzioni diluite, regolare a pH 7, e aggiungere 20 ml di FBS (2%). Top fino a 1 L con acqua sterile e filtro sterile con 0,2 micron filtro.
      NOTA: soluzioni madri BSS devono essere preparati separatamente perché la miscelazione delle scorte BSS concentrati direttamente può provocare precipitazioni.
3. Globuli rossi (RBC) Lysis Buffer
   1. Per preparare tampone di lisi RBC, mescolare 9 parti magazzino cloruro di ammonio (155 mm cloruro di ammonio in acqua sterile) e 1 parte di magazzino Tris-base (130 mm Tris (idrossimetil) aminomethane in acqua sterile, pH 7,65) prima dell'uso.
      NOTA: Conservare soluzioni madre sterili di cloruro di ammonio e Tris-base a 4 ° C. Preparare lisi BUffer fresco per garantire efficiente lisi dei globuli rossi.

2. Generazione di linfociti sospensione dalla milza o linfonodi

NOTA: E 'importante preparare tutti i reagenti e le attrezzature necessarie per l'esperimento prima che l'eutanasia del mouse e di generare sospensioni singola cella di linfociti nel più breve tempo possibile mantenere alti Viabilità cellulari.

1. Eutanasia del mouse sperimentale di dislocazione cervicale o CO ₂ asfissia.
   NOTA: Da questo punto in poi, tutte le procedure sperimentali devono essere eseguite in modo asettico.
2. Immergere l'intero del mouse in etanolo al 70% prima di effettuare qualsiasi incisioni. Rimuovere la milza e linfonodi asettico ^8, e metterli in separati da 15 ml provette contenenti 5 ml di ghiacciata RPMI / FBS (RPMI con il 2% FBS) o BSS / FBS (dal punto 1.2.3).
   NOTA: Dal momento che BSS impedisce efficiente lisi RBC, usare RPMI per la preparazione della sospensione cellulare della milza e passare a BSS after RBC lisi.
3. Per generare una sospensione singola cella da milza o linfonodi, posizionare l'organo (s) tra due pezzi di sterile 100 mesh filtro micron delle cellule in una capsula di Petri contenente 2 ml di ghiacciata RPMI / FBS o BSS / FBS. Utilizzando lo stantuffo di una siringa da 1 ml, schiacciare l'organo (s) finché non è stato strappato in parti molto fini.
4. Trasferire la sospensione di cellule in una provetta da 15 ml e lavare il filtro cella di maglia con ghiacciata RPMI / FBS o BSS / FBS. Raccogliere la sospensione cellulare residua, aggiungerlo alla stessa tubo da 15 ml, e spin down a 453 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
   NOTA: risospendere le cellule in pellet muovendo il tubo con le dita prima di aggiungere buffer di lisi RBC o medio nelle fasi successive.
5. Preparare temperatura ambiente tampone di lisi (RT) RBC durante la centrifugazione della sospensione cellulare (vedi passo 1.3.). Dopo pellet cellule e rimuovere il surnatante, risospendere le cellule con 1 ml di tampone di lisi RBC per ogni 10 ⁸ cellule. Incubate la reazione di lisi a temperatura ambiente per 3-4 min.
6. Smettere di RBC lisi con 14 ml di BSS ghiacciata / FBS e spin down a 453 xg per 5 minuti a 4 ° C.

3. Purificazione di B e le cellule T

1. Purificazione di cellule B
   1. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Risospendere fino a 10 ⁸ cellule della milza in 300 ml BSS / FBS e aggiungere 50 ml di anti-CD43 microsfere magnetiche ^9,10. Per rimuovere le cellule morte, aggiungere 30 ml annessina V sfere magnetiche. Incubare la sospensione cellulare in frigorifero a 4 ° C per 30 min.
2. Purificazione di cellule T
   1. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Risospendere fino a 10 ⁸ cellule in non-T anticorpi deplezione delle cellule cocktail (anticorpi biotinilati contro CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 e CD4 o CD8 seconda popolazione di cellule bersaglio per essere purificato), diluito 1: 200 in 200 ml BSS / FBS ^4,5. Incubare la sospensione cellulare in un4 ° C frigorifero per 15 min.
   2. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 ml BSS / FBS per lavare le cellule e spin down a 453 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 165 microlitri BSS / FBS con 30 microlitri microsfere streptavidina e 15 microlitri annessina V sfere magnetiche. Incubare la sospensione cellulare in frigorifero a 4 ° C per 30 min.
      NOTA: per garantire anche l'etichettatura con le microsfere magnetiche, incubare le cellule con microsfere per 15 minuti, poi mescolare la sospensione cellulare con delicatezza toccando il tubo da 15 ml e incubare un altro 15 minuti durante la fase 3.1.1. o 3.2.2.
3. Preparazione di separazione colonna per Cell Purificazione
   1. Preparare una colonna di separazione non utilizzata durante l'etichettatura microperla delle cellule (fase 3.1.1. E 3.2.2.). Pre-caldo BSS (senza FBS) per RT e utilizzare 2 ml per lavare ed equilibrare la colonna in modo asettico. Dopo equilibrio con BSS, la colonna lavato non dovrebbe essere permesso di asciugare.
      NOTA: Usiamo i LS column invece della colonna LD consigliato a causa della sua riutilizzabilità (vedi punto 3.4.).
   2. Dopo l'etichettatura con le sfere magnetiche, aggiungere 14 ml BSS / FBS per lavare le cellule e spin down a 453 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1-3 ml di RT BSS.
   3. Attaccare sterile 21 ago G alla punta della colonna di ridurre la portata durante il processo di purificazione. Caricare la sospensione cellulare sulla colonna equilibrata e raccogliere il flusso attraverso contenente cellule bersaglio purificate.
      NOTA: evitare l'introduzione di bolle nella colonna durante il caricamento.
   4. Lavare la colonna una volta con 1 ml BSS / FBS e raccogliere il flusso attraverso contenente le cellule bersaglio purificate. Ricarica la colonna con il flusso attraverso nuovamente. Raccogliere il flusso attraverso dopo il secondo carico nello stesso tubo 15 ml.
   5. Lavare la colonna 3 volte con 1 ml BSS / FBS e raccogliere il flusso attraverso contenente le cellule bersaglio purificate. Successivamente, aggiungere 5 ml BSS / FBS a the colonna e, con stantuffo, lavare le cellule marcate magneticamente su colonna in un nuovo tubo 15 ml.
   6. Controllare la purezza delle cellule raccolte mediante citometria di flusso utilizzando anticorpi che si legano alla superficie antigeni di B purificati o cellule T ^4,5.
4. Riutilizzare la colonna di separazione
   NOTA: La colonna LS può essere riutilizzato fino a 4 volte senza compromettere l'efficienza di purificazione.
   1. Lavare la colonna 3 volte con 5 ml di tampone fosfato salino (PBS) e 3 volte con 5 ml di acqua distillata dall'alto con il pistone.
   2. Lavare la colonna con 5 ml di etanolo al 70% e asciugare la colonna ampiamente utilizzando un rubinetto dell'aria per evitare la formazione di ruggine nella colonna.
   3. Per preparare una colonna LS utilizzato per un esperimento di purificazione separata, lavare la colonna dal basso verso l'alto con 5 ml di etanolo al 70% utilizzando l'adattatore siringa. Successivamente, lavare la colonna dal basso verso l'alto due volte con 5 ml di PBS sterile, seguiti da 5 ml di PBS volta dalla sommità della colonna. Aggiungere 2ml RT BSS per equilibrare la colonna e quindi procedere al caricamento la colonna con cellule marcate.

4. CFSE Etichettatura e stimolazione

NOTA: Purified cellule possono essere sottoposte ad una varietà di in vitro e in vivo saggi funzionali. Qui, usiamo le cellule T purificate per determinare la capacità di stimolazione delle cellule T di APC ^5.

1. soluzione Pre-caldo etichettatura (0,1% FBS in PBS) per 37 ° C prima del CFSE carico.
   NOTA: l'utilizzo di una bassa percentuale di FBS in PBS riduce la morte delle cellule durante CFSE carico e riduce al minimo la perdita di cellule durante la centrifugazione. Tuttavia, troppo FBS possono interferire con CFSE carico.
2. Lavare le cellule due volte con purificate soluzione di etichettatura, poi ri-sospese a 2 x 10 ⁷ cellule / ml in soluzione di etichettatura pre-riscaldato in una provetta da 15 ml.
3. Preparare 10 soluzione CFSE mM (1: 500 diluizione di 5 mm CFSE soluzione madre) in soluzione di etichettatura pre-riscaldato. soluzione CFSE dovrebbeessere preparato fresco ogni volta per ottenere l'etichettatura ottimale.
4. Per caricare cellule con CFSE, aggiungere sospensione cellulare 1 parte a 1 parte 10 mM soluzione CFSE in una provetta da 15 ml e incubare al buio per 10 minuti a 37 ° C. Una concentrazione finale di 5 mM CFSE viene utilizzato per etichettare 1 x 10 ⁷ cellule / ml.
5. Invertire il tubo ogni 2 minuti per assicurare una miscela omogenea di cellule durante CFSE carico.
6. Per arrestare la reazione, aggiungere diversi volumi di medie RPMI completo ghiacciata e spin down a 453 xg per 5 minuti a 4 ° C. Al successo CFSE di carico, il pellet cellulare apparirà giallastro.
7. Lavare CFSE caricato cellule una volta con RPMI completo ghiacciata e spin giù a 453 xg per 5 minuti a 4 ° C prima dell'uso per la coltura in vitro o in vivo di stimolazione.

5. In Vitro Stimolazione

1. Preparare una soluzione 2x magazzino di stimoli (2x stimoli soluzione stock) immediatamente prima dell'uso in modo che il 100 microlitri di 2x stimoli soluzione madre può essere aggiunto a 100 ml di cellule in un volume finale di 200 microlitri per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti.
2. Se è necessaria una piastra ricoperta di stimoli (IgM o CD40 per le cellule B o CD3 e CD28 per le cellule T), diluire gli stimoli in PBS e pre-coat la piastra di coltura a 4 ° C durante la notte. In alternativa, la piastra di coltura può essere rivestita a 37 ° C per 1 ora il giorno dell'esperimento. Lavare la piastra rivestita due volte con PBS (Non lasciare che la piastra si asciughi in qualsiasi momento).

Per le cellule B
Stimoli	concentrazione finale
(Ab ') 2 di capra anti-topo IgM F	0.6-2.4 mg / ml
Anti-topo CD40 mAb	0,5-2 mg / ml
ricombinanteMouse IL-4	25 U / ml
lipopolisaccaride	0.1-10 mg / ml
(LPS) da E. coli sierotipo 055: B5
Per le cellule T
Stimoli	concentrazione finale
Anti-CD3 (piatto rivestito)	2-10 mg / ml
(50 ul / pozzetto per il rivestimento)
Anti-CD28 (piatto rivestito)	2 ug / ml
Ricombinante IL-2	40 U / ml
PDBu (Phorbol estere)	5-50 ng / ml
A23187 (calcio ionoforo)	250 ng / ml

Tabella 1: Concentrazioni di stimoli utilizzati per stimolare i linfociti in coltura in vitro.

3. Per le cellule B CFSE-etichettati, ri-sospendere o 3 x 10 ⁶ cellule / ml in terreno completo RPMI e cultura in triplice copia con 3 x 10 ⁵ cellule / pozzetto in piastre da 96 pozzetti fondo piatto per 72 ore.
4. Per le cellule T CFSE-etichettati, ri-sospendere a 0,5-3 x 10 ⁶ cellule / ml in terreno RPMI completo e la cultura in triplice copia con 0,5-3 x 10 ⁵ cellule / pozzetto in piastre da 96 pozzetti a fondo sferico per 48 o 72 ore .

6. In Vivo Stimolazione

1. Per la stimolazione in vivo, trasferimento adoptively 4 x 10 ⁶ cellule T CFSE-etichettati per mouse (per via endovenosa (iv) in 200 ml di PBS) in ogni mouse destinatario MHC-abbinato.
   NOTA: In questo protocollo, le cellule T CFSE-etichettati possono essere trasferiti utilizzando adoptively vena della coda o iniezione retro-orbitale come queste cellule saranno a casa per linfoidi organi come i milza e nei linfonodi.
2. Sfida i topi riceventi un giorno in più con l'antigene.
   NOTA:In questo esempio, usiamo ovalbumina (proteina OVA, 50 mg / mouse) come antigene perché OVA-specifici, recettore delle cellule T (TCR), le cellule T sono state -transgenic adoptively trasferite in topi riceventi. Preparare proteine OVA in PBS sterile e iniettare 100 ml di OVA proteine / PBS o il controllo PBS, per via sottocutanea (SI), in ogni topo ricevente ^5.
3. Harvest e generare sospensioni singola cellula da organi linfoidi (linfonodi e milza) di topi riceventi 3 giorni dopo l'immunizzazione con la proteina OVA o PBS. linfonodi separare in linfonodi prossimali (PLN), che comprende ascellare, brachiale e superficiali linfonodi cervicali) e linfonodi distali (DLN), che comprende mesenterica, poplitea, inguinali, lombari, e linfonodi caudale. cellule macchia con gli anticorpi FACS appropriate per verificare la presenza di proliferazione delle cellule T.
   NOTA: In questo esperimento di monitoraggio delle cellule CFSE, CFSE-etichettati cellule T da topi di controllo PBS-iniettati stabilire una linea di base per la fluorescenza non dividing cellule. Divisioni cellulari di proliferare, le cellule, CFSE-etichettati antigene-stimolata sono visualizzati misurando i picchi di fluorescenza ^12,13. Con il controllo PBS, il numero di divisioni cellulari di proliferanti, cellule T CFSE etichettati può essere determinato ^12,13.
4. Analizzare i dati di proliferazione cellulare CFSE marcato confrontando il numero di divisioni cellulari o picchi tra i campioni (figure 1 e 2).
   NOTA: Per esempio, CFSE marcato, le cellule T specifiche per OVA adoptively trasferite in topi riceventi ricevono l'antigene OVA saranno sottoposti proliferazione attiva rispetto ai topi di controllo PBS-iniettati ^5,12. Inoltre, è degno di nota sottolineare che ci sono molti modi per analizzare i dati di proliferazione cellulare CFSE, come dimostrato da Hawkins e colleghi ^14.

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Risultati

depurazione cellule magnetica dei linfociti consente di purificare una popolazione di cellule bersaglio in un tempo relativamente breve lasso di tempo. Utilizzando il nostro protocollo di esaurimento, siamo stati in grado di aumentare la percentuale di cellule T CD8 (OT-I in ricombinazione attivante del gene-1 (RAG-1) topi -carente) dal 72,8% (prima della depurazione) al 94,2% (dopo la depurazione; Figura 1A) ^4,5. Questi linfociti purificati possono poi essere...

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Discussione

In questo protocollo, dimostriamo una procedura per purificare i linfociti da organi linfoidi. la purificazione delle cellule usando magnetica ordinamento tallone è un metodo semplice e veloce che produce vitali, cellule bersaglio altamente purificate.

I passaggi critici all'interno del protocollo

La vitalità cellulare e la resa delle cellule

Il mantenimento di vitalità delle cellule lignaggio ematopoietiche ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
RPMI 1640 (without L-Glutamine)	Gibco	31870025
Fetal Bovine Serum			Heat inactivated
L-glutamine	Gibco	25030024
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140114
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-CD43 magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-801	Mix well prior use
Streptavidin microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101	Mix well prior use
Anti-Annexin V magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-090-201	Mix well prior use
MACS LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
96-well U-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	650180
96-well F-bottom sterile culture plate	Greiner Bio-one	655180
100 μm cell strainer mesh			To sterilize using UV radiation prior use
0.2 μm  sterile disposable filter units	Nalgene	567-0020	Can be substituted with any sterile filter device
CellTrace Violet	Invitrogen	C34557	CTV for short; alternative to CFSE
CellTrace Yellow	Invitrogen	C34567	CTY for short; alternative to CFSE
CellTrace Far Red	Invitrogen	C34564	CTFR for short; alternative to CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor 670	eBioscience	65-0840	CPD670 for short; alternative to CFSE
PKH26	Sigma Aldrich	PKH26GL	PKH26, alternative to CFSE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Dextrose	Sigma Aldrich	G7021
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5655
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S5136
Phenol Red	Sigma Aldrich	P0290
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Sodium chloride	Merck Millipore	S7653	Can use from other sources
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Tris-base
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	Molecular Probes	C-1157	Reconstitute in DMSO
Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)	Sigma Aldrich	P1269
A23187 (Calcium ionophore)	Sigma Aldrich	C7522
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and recombinant protein
CD11b biotin (clone m1/70)	Biolegend	101204	T cell depletion cocktail
CD11c biotin (clone N418)	Biolegend	117304	T cell depletion cocktail
Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)	Biolegend	108404	T cell depletion cocktail
Ter119 biotin (clone Ter119)	Biolegend	116204	T cell depletion cocktail
TCR-γδ biotin (clone GL-3)	Biolegend	118103	T cell depletion cocktail
CD19 biotin (clone 6D5)	Biolegend	115504	T cell depletion cocktail
B220 biotin (clone RA3-6B2)	Biolegend	103204	T cell depletion cocktail
CD49b biotin (clone DX5)	Biolegend	108904	T cell depletion cocktail
CD4 biotin (clone GK1.5)	Biolegend	100404	T cell depletion cocktail
CD8 biotin (clone 53-6.7)	Biolegend	100704	T cell depletion cocktail
F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated)	Jackson ImmunoResearch	115-006-075	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-mouse CD40 mAb (plate coated)	Pharmingen	553722	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-4	ProSpec	Cyt-282
LPS from E. coli Serotype 055:B5	Sigma Aldrich	L-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated)	eBioscience	16-0037-85	50 µl/well for coating (96-well)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)	eBioscience	16-0281-85	50 µl/well for coating (96-well)
Recombinant IL-2	ProSpec	Cyt-370
Albumin from chicken egg white, Ovalbumin	Sigma Aldrich	A7641