ترتيب القراءة طويلة جداً لتحليل الحمض النووي كله

Summary

تسلسلات طويلة القراءة يسهل الجمعية جينومات المعقدة وتوصيف التغير الهيكلي. يصف لنا طريقة لإنشاء تسلسلات طويلة جداً بالأنظمة الأساسية المستندة إلى نانوبوري التسلسل. ويعتمد النهج أمثل استخراج الحمض النووي تليها مكتبة تعديل الأعمال التحضيرية لتوليد مئات يقرأ كيلوباسي مع تغطية معتدلة من الخلايا البشرية.

Abstract

قراءة الجيل الثالث التي توفر تكنولوجيات تسلسل الحمض النووي جزيء واحد لم يعد إلى حد كبير المدة التي يمكن أن تيسر الجمعية جينومات معقدة وتحليل المتغيرات الهيكلية المعقدة. منصات نانوبوري إجراء تسلسل جزيء واحد بقياس التغيرات الحالية بمرور الحمض النووي عن طريق المسام وساطة مباشرة، ويمكن أن تولد مئات من كيلوبس (kb) على ما يلي مع الحد الأدنى من التكاليف الرأسمالية. قد اعتمد هذا المنبر العديد من الباحثين لمجموعة متنوعة من التطبيقات. تحقيق أطوال قراءة التسلسل هو العامل الأهم الاستفادة من قيمة منصات التسلسل نانوبوري. لتوليد يقرأ طويلة جداً، مطلوب اعتبارا خاصا لتجنب الكسور الحمض النووي واكتساب الكفاءة لإنشاء قوالب تسلسل الإنتاجية. هنا، نحن نقدم البروتوكول مفصلاً لزمن تسلسل الحمض النووي بما في ذلك ارتفاع الوزن الجزيئي (حمو) استخراج الحمض النووي من الخلايا الطازجة أو المجمدة، وبناء مكتبة بالقص الميكانيكية أو تجزئة ترانسبوساسي، وتسلسل على جهاز نانوبوري. من 20-25 ميكروغرام من "الحمض النووي حمو"، الأسلوب يمكن تحقيق N50 قراءة طول 50-70 كيلوبايت مع القص الميكانيكية و N50 من 90-100 كيلو بايت قراءة طول مع ترانسبوساسي بوساطة التجزؤ. يمكن تطبيق البروتوكول على الحمض النووي المستخرج من خلايا الثدييات لإجراء تسلسل الجينوم الكامل للكشف عن المتغيرات الهيكلية والجمعية الجينوم. تحسينات إضافية على استخراج الحمض النووي والتفاعلات الانزيمية سوف زيادة طول القراءة وزيادة فائدته.

Introduction

على مدى العقد الماضي، موازية لنطاق واسع وتكنولوجيات دقيقة للغاية التسلسل الفائق من الجيل الثاني دفعت انفجار اكتشاف الطبية الحيوية والابتكار التكنولوجي^1،،من²³. وعلى الرغم من أوجه التقدم التقني، قصيرة-قراءة البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة منصات الجيل الثاني من غير فعالة في حل مناطق الجينوم معقدة ومحدودة في الكشف عن المتغيرات الهيكلية الجينوم (SVs)، التي تلعب أدواراً هامة في الإنسان تطور والأمراض^4،5. وعلاوة على ذلك، قصيرة-قراءة البيانات غير قادر على حل تكرار الاختلاف وغير ملائمة للمميزين هابلوتيبي التدريجي للمتغيرات الجينية⁶.

التقدم الذي أحرز مؤخرا في تسلسل واحد جزيء عروض أطول بشكل ملحوظ قراءة الطول، التي يمكن أن تسهل الكشف عن النطاق الكامل ل SVs^7،،من⁸⁹، وعروض الجمعية دقيقة وكاملة لمجمع الجينومات الميكروبية والثدييات^6،10. ينفذ منهاج نانوبوري تسلسل جزيء واحد بقياس التغيرات الحالية بمرور الحمض النووي عن طريق المسام^11،،من¹²¹³وساطة مباشرة. خلافا لأي الكيمياء تسلسل الحمض النووي القائمة، يمكن أن تولد التسلسل نانوبوري طويلة (عشرات الآلاف من كيلوبس) ما يلي: في الوقت الحقيقي دون الاعتماد على حركية بوليميريز أو اصطناعية تضخيم عينات الحمض النووي. ولذلك، نانوبوري طويلة قراءة التسلسل (NLR-seq) يحمل وعدا كبيرا لتوليد أطوال قراءة طويلة جداً تتجاوز 100 كيلو بايت، التي ستعزز إلى حد كبير تحليل الجينوم والطب الأحيائي¹⁴، لا سيما في تعقيد منخفض أو الغنية بتكرار مناطق الجينوم¹⁵.

الميزة الفريدة للتسلسل نانوبوري قدرته على توليد طويلة يقرأ دون وجود قيود طول نظرية. ولذلك، طول القراءة تعتمد على طول الفعلي من الحمض النووي الذي يتأثر بصورة مباشرة بنوعية القالب النزاهة وتسلسل الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، تبعاً لمدى التلاعب وعدد الخطوات التي تنطوي عليها، مثل قوات بيبيتينج وشروط الاستخراج، نوعية الحمض النووي اختلافاً كبيرا. ولذلك، أنها تمثل تحديا لأحد الخضوع الطويل ما يلي: بمجرد تطبيق البروتوكولات استخراج الحمض النووي القياسية والشركة المصنعة للمكتبة التي تم توفيرها أساليب البناء. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير قوي الأسلوب لتوليد طويلة جداً قراءة (مئات كيلوبس) تسلسل البيانات بدءاً من الخلية المقطوع الكريات. لقد اعتمدنا عدة تحسينات في إجراءات إعداد مكتبة واستخراج الحمض النووي. نحن تبسيط البروتوكول لاستبعاد الإجراءات غير الضرورية التي تسبب تدهور الحمض النووي والأضرار. ويتألف هذا البروتوكول من ارتفاع الوزن الجزيئي (حمو) استخراج الحمض النووي وبناء مكتبة الحمض النووي طويلة جداً وتعاقب على منصة نانوبوري. لإحياء الجزيئية المدربين تدريبا جيدا، يستغرق عادة 6 ح من الخلية الحصاد للانتهاء من استخراج الحمض النووي حمو، 90 دقيقة أو ح 8 لتشييد المكتبة اعتماداً على أسلوب القص، وحتى 48 ساعة أخرى لتسلسل الحمض النووي. استخدام البروتوكول ستمكن المجتمع الجينوم لتحسين فهمنا لتعقيد الجينوم واكتساب المعرفة الجديدة إلى تباين المجين في الأمراض التي تصيب الإنسان.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول NLR seq يتكون من ثلاث خطوات متتالية: 1) استخراج عالية الجزيئية الوزن الحمض النووي (همو)؛ 2) ينتهي الحمض النووي فائقة طويلة مكتبة البناء، الذي يشمل تجزئة "الحمض النووي حمو" إلى الأحجام المطلوبة وربط محولات التسلسل للحمض النووي؛ و 3) تحميل من الحمض النووي المحول متصلة على صفائف نانوبوريس (الشكل 1).

1-استخراج الحمض النووي حمو

1. إعداد كاشف. جعل 1 × الفوسفات المالحة مخزنة (PBS) المخزن المؤقت (1,000 مل) بإضافة 100 مل من برنامج تلفزيوني (10 x) إلى 900 مل من الماء ومزيج جيد. جعل تحلل المخزن المؤقت (50 مل) عن طريق إضافة 43.5 مل من الماء في أنبوب 50 مل. إضافة 500 ميكروليتر من تريس (م 1، الرقم الهيدروجيني 8.0) 1 مل كلوريد الصوديوم (NaCl) (م 5)، 2.5 مل حمض الإيثيلين (يدتا) (0.5 م، الرقم الهيدروجيني 8.0) و 2.5 مل من الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) (10%، wt/المجلد) إلى الأنبوبة ومزيج جيد.
   ملاحظة: يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. ويمكن تخزين المخزن المؤقت تحلل premade في RT لمدة تصل إلى شهرين.
2. التحقق من الوفيات بين الخلية وحساب الخلايا. ضمان أن يعيش نسبة > 85% وعدد الخلايا الكلي هو 30 × 10⁶.
   ملاحظة: الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول من HG00733 الخلية خط، خط خلية ليمفوبلاستويد بشرية من أصل بورتوريكي تستخدم على نطاق واسع في الكونسورتيوم الجينوم 1000 لتحليل التباين الهيكلي (انظر الجدول للمواد اللازمة لطلب المعلومات)، التي ينتمي إليها أن الجينوم الدولي عينة من الموارد.
3. جمع الخلايا من سينتريفوجينج في 200 x ز لمدة 5 دقائق في تجاهل الرايت المتوسطة وريسوسبيند بيليه الخلية (30 × 10⁶ خلايا) مع 5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت. الطرد المركزي مرة أخرى في 200 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية.
   ملاحظة: 25-35 × 10⁶ خلايا تكون مقبولة لهذا النهج. زيادة تباين قدرة الخلايا المستخدمة سوف تحتاج إلى مزيد من التحسين. ويمكن تخزين بيليه الخلية في −80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
4. ريسوسبيند بيليه الخلية في 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني x 1. في حالة استخدام بيليه خلية مجمدة، يغسل مع 5 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني 1 x. الطرد المركزي الحل في 200 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر 1 × المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني.
5. إعداد 10 مل من المخزن المؤقت لتحلل في أنبوب 50 مل. أضف تعليق خلية 200 ميكروليتر إلى المخزن المؤقت لتحلل ودوامه على أعلى سرعة للحل في 37 درجة مئوية ح 1 3 س. إينكوباتي.
6. إضافة 2 ميكروليتر من رناسي A (100 مغ/مل) ليساتي. تدوير بلطف على أنبوب 50 مل لخلط العينة. احتضان الحل في 37 درجة مئوية ح 1.
7. إضافة 50 ميكروليتر بروتيناز ك (20 ملغ/مل). تدوير بلطف على أنبوب 50 مل لخلط العينة. احتضان الحل عند 50 درجة مئوية ح 2. أثناء الحضانة، بلطف مزج العينة كل 30 دقيقة.
8. إزالة أنبوب 50 مل من 50 درجة مئوية واسمحوا الوقوف على RT لمدة 5 دقائق.
9. إضافة 10 مل طبقة الفينول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل الكحول (25:24:1، المجلد/المجلد/المجلد) إلى وتدوير الأنبوب في خلاط المدورة (انظر الجدول للمواد) في RT في غطاء دخان 20 لفة في الدقيقة للحد الأدنى 10 لف غطاء أنبوب مع بارافيلم لمنع التسرب خلال التناوب.
10. إعداد اثنان أنابيب هلام 50 مل (انظر الجدول للمواد) التي سينتريفوجينج في 1,500 س ز 2 دقيقة في الرايت
    ملاحظة: الهلام يشكل حاجزاً مستقرة بين المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي والمذيبات العضوية.
11. صب الحل عينة/الفينول في واحدة من 50 مل استعداد أنابيب هلام من "الخطوة 1، 10". الطرد المركزي الحل في س 3,000 ز لمدة 10 دقائق في الرايت
12. صب المادة طافية في أنبوب 50 مل جديدة. أضف 10 مل طبقة الفينول من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل (25:24:1، المجلد/المجلد/المجلد) وتدوير الأنبوب في خلاط المدورة في RT في غطاء دخان 20 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
13. كرر الخطوة 1.11 مرة واحدة بالثانية أعدت جل أنبوب.
14. صب المادة طافية في أنبوب 50 مل جديدة. إضافة 25 مل من المثلج 100 ٪ الإيثانول ولطف تدوير الأنبوبة باليد حتى رواسب الحمض النووي (الشكل 2).
    ملاحظة: أن النهج هطول الأمطار يساعد على استقرار "الحمض النووي حمو".
15. ثني طرف 20 ميكروليتر جعل هوك. عناية إخراج "الحمض النووي حمو" مع هوك وتدع قطره السائل.
16. ضع "الحمض النووي حمو" في أنبوب 50 مل يحتوي على 40 مل إيثانول 70%. يغسل الحمض النووي بلطف عكس الأنبوب 3 مرات.
17. كرر الخطوة 1.15 مرة واحدة لجمع الحمض النووي من الأنبوب إيثانول 70%.
18. ضع "الحمض النووي همو" إلى أنبوب 2 مل تحتوي على 1.8 مل إيثانول 70%.
19. الطرد المركزي "الحمض النووي همو" غسلها في 10,000 س ز 3 s في إزالة الرايت قدر من الإيثانول المتبقي قدر الإمكان قبل بيبيتينج.
    ملاحظة: عدم الإزعاج بيليه الحمض النووي عندما بيبيتينج الإيثانول المتبقية.
20. احتضان أنبوب 2 مل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع الغطاء مفتوحاً لتجف العينة.
    1. إذا تواصل مع خطوة 2.1 (مع القص الميكانيكية وطقم تسلسل عملية ربط د 1)، إضافة 1 مل من الشركة المصرية للاتصالات (10 مم يدتا تريس و 1 مم، الرقم الهيدروجيني 8.0) إلى أنبوب 2 مل.
    2. إذا تواصل مع 2.2 خطوة (بالتجزئة على أساس ترانسبوساسي وطقم التسلسل السريع)، بإضافة 200 ميكروليتر من 10 ملم تريس (pH 8.0) بنسبة 0.02 في المائة X-100 تريتون.
       ملاحظة: عدم الإزعاج بيليه الحمض النووي. ترك الأنبوب الوقوف عند 4 درجة مئوية في الظلام ح 48 سوف تساعد العينة تماما ريسوسبيند. ويمكن تخزين "الحمض النووي حمو" عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. قد يعرض أطول وقت التخزين أو ظروف التخزين الأخرى أكثر أجزاء قصيرة.

2. فائقة طويلة بناء مكتبة الحمض النووي

ملاحظة: هناك طريقتان لإنشاء مكتبات الحمض النووي طويلة جداً استناداً إلى اثنين من أساليب القص مختلفة مقترنة بمجموعات تسلسل نانوبوري. مكتبة القائم على القص ميكانيكية تنتج البيانات مع N50 من 50-70 كيلوبايت، أخذ حوالي 8 ح لبناء مكتبة. مكتبة القائم على تفتيت ترانسبوساسي تنتج N50 البيانات 90-100 كيلو بايت، وأخذ فقط 90 دقيقة لبناء مكتبة. ويعطي البروتوكول القص الميكانيكية غلة أعلى من الحمض النووي نفسه الإدخال باستخدام إصدارات متطابقة من تسلسل محول والجودة نانوبوري تدفق الخلايا.

1. البناء الميكانيكية مكتبة القائم على القص
   1. ذوبان الجليد ومزيج الكواشف من الربط كيت (انظر الجدول للمواد). إصلاح المخزن المؤقت ونهاية إصلاح/دا-تراجع المخزن المؤقت على الجليد، ثم دوامة ذوبان الجليد FFPE الحمض النووي وتدور وصولاً إلى المزيج. ذوبان الجليد ميكس محول (قراء) ومحول حبة ملزمة المخزن المؤقت (أي بي بي) على الجليد، ثم ماصة وتدور إلى أسفل مزيج. تشغيل المخزن المؤقت مع مزيج الوقود (المصرف) وشطف المخزن المؤقت (الصناعيين) RT، ثم دوامة وتدور إلى أسفل مزيج من الدفء. ذوبان الجليد مكتبة تحميل الخرز (ليسانس الحقوق) RT وماصة لخلط قبل الاستخدام.
      1. بمجرد إذابة، تبقى كافة مكونات طقم على الجليد. تأخذ بها الإنزيمات عند الحاجة فقط. إحضار الخرز المغناطيسي إلى RT للاستخدام.
         ملاحظة: لتوصيات بشأن الخرز المغناطيسي لاستخدام راجع الجدول للمواد.
   2. التحقق من نوعية وكمية من "الحمض النووي حمو" من الخطوة 1.21.1. ماصة من 20 ميكروليتر من الحمض النووي في أنابيب 1.5 مل جديدة من ثلاثة مواقع مختلفة في أنبوب "حمو الحمض النووي" باستخدام P200 واسعة تتحمل نصائح. تأخذ 1 ميكروليتر من مختبرين الثلاثة للكشف عن تركيز استخدام فلوروميتير والجودة استخدام الأشعة فوق البنفسجية القراءة. تحقق عدة مرات لتأكيد النتائج.
      ملاحظة: تظهر النتائج المتوقعة في الشكل 3 ألف. هو قيمة_260/280 OD حوالي 1.9 وقيمة_260/230 OD حوالي 2.3.
   3. نقل ميكروليتر 940 المتبقية من "الحمض النووي حمو" إلى غطاء أنبوب 50 مل مع P1000 واسعة تتحمل تلميح.
   4. نضح كل الحمض الخلوي الصبغي في محقن 1 مل دون الإبرة.
   5. وضع الإبرة ز 27 على المحاقن وإخراج جميع الحمض النووي إلى الحد الأقصى بلطف وببطء (~ 10 s). خلع الإبرة ز 27 من المحاقن.
   6. كرر الخطوات 2.1.4 و 2.1.5 29 مرة لما مجموعة 30 يمر عن طريق الإبرة.
      ملاحظة: يمكن تخزين "الحمض النووي همو" المنفصمة عند 4 درجة مئوية في الظلام ليصل إلى 24 h. مراقبة الجودة (QC) ينصح بشدة بالتفريد جل الحقل نابض، إلا أنها مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. إذا كان أداء مراقبة الجودة على جهاز التفريد جل حقل نبض الآلي يستخدم بروتوكول 5-150 كيلو بايت ح 20 تشغيل. يتم إظهار النتائج المتوقعة في الشكل 4.
   7. إعداد رد فعل إصلاح الحمض النووي في أنبوب 0.2 مل بإضافة 100 ميكروليتر المنفصمة حمو الحمض الخلوي الصبغي (20 ميكروغرام)، 15 ميكروليتر من المخزن المؤقت لإصلاح "الحمض النووي فب" و 12 ميكروليتر من مزيج إصلاح "الحمض النووي فب" ميكروليتر 16 من المياه خالية من نوكلاس. خلط رد فعل بالتحريك بلطف 6 مرات وتدور وصولاً إلى إزالة الفقاعات.
   8. احتضان رد فعل عند 20 درجة مئوية على 60 دقيقة نقل العينة في أنبوب 1.5 مل جديدة مع معلومات واسعة وتتحمل P200.
   9. ريسوسبيند الخرز المغناطيسي من بيبيتينج أو فورتيكسينج. إضافة الخرز ميكروليتر 143 (س 1) إلى رد فعل إصلاح الحمض النووي والمزيج بلطف خلال يسددها الأنبوب 6 مرات. قم بتدوير الأنبوب في خلاط المدورة في الرايت 20 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
   10. تدور أسفل العينة في 1,000 س ز 2 s في مكان الرايت الأنبوب على رف مغناطيسي للحد الأدنى 10 إبقاء الأنبوب على الرف المغناطيسية وتجاهل المادة طافية.
   11. إبقاء الأنبوب على الرف المغناطيسي، إضافة 400 ميكروليتر من الإيثانول 70% طازجة دون إزعاج بيليه. إزالة الإيثانول 70% بعد 30 ثانية.
   12. كرر الخطوة 2.1.11 مرة واحدة.
   13. تدور أسفل العينة في 1,000 س ز 2 s في مكان الرايت الأنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسية. قم بإزالة أي الإيثانول المتبقية والهواء الجاف لمدة 30 ثانية. لا جاف أكثر بيليه.
   14. إزالة الأنبوب من الرف المغناطيسية وإضافة ميكروليتر 103 من الشركة المصرية للاتصالات (10 مم يدتا تريس و 1 مم، الرقم الهيدروجيني 8.0). بلطف نفض الغبار على أنبوب لضمان أن الخرز مشمولة في المخزن المؤقت، واحتضان في خلاط المدورة في RT للحد الأدنى 30 بلطف نفض الغبار على أنبوب كل 5 دقائق للمساعدة في استثارة لبيليه.
   15. بيليه الخرز على الرف المغناطيسي لتتحمل على الأقل 10 دقيقة نقل 100 ميكروليتر من النذرة مع P200 واسعة تلميح إلى أنبوب 0.2 مل.
   16. إعداد إصلاح نهاية ورد دا-تراجع في أنبوب 0.2 مل بإضافة 100 ميكروليتر من إصلاح "الحمض النووي حمو"، ميكروليتر 14 من نهاية إصلاح/دا-تراجع المخزن المؤقت وميكروليتر 7 من نهاية إصلاح/دا-تراجع مزيج. خلط رد فعل بالتحريك بلطف 6 مرات، وتدور وصولاً إلى إزالة الفقاعات.
   17. احتضان رد فعل عند 20 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة تليها 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ومن ثم اضغط على 22 درجة مئوية. نقل العينة في أنبوب 1.5 مل جديدة باستخدام P200 واسعة تتحمل تلميح.
   18. ريسوسبيند الخرز المغناطيسي من بيبيتينج أو فورتيكسينج. إضافة ميكروليتر 48 من الخرز (0.4 x) إلى نهاية إصلاح/دا-تراجع رد الفعل والمزيج بلطف بالتحريك الأنبوب 6 مرات. قم بتدوير الأنبوب في خلاط المدورة في الرايت 20 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
   19. كرر الخطوات 2.1.10-2.1.13 مرة واحدة.
   20. إزالة الأنبوب من الرف المغناطيسية وإضافة 33 ميكروليتر من الشركة المصرية للاتصالات (10 مم يدتا تريس و 1 مم، الرقم الهيدروجيني 8.0). بلطف نفض الغبار على أنبوب لضمان أن الخرز مشمولة في المخزن المؤقت، واحتضان في خلاط المدورة في RT للحد الأدنى 30 بلطف نفض الغبار على أنبوب كل 5 دقائق للمساعدة في استثارة لبيليه.
   21. بيليه الخرز على الرف المغناطيسي لتتحمل على الأقل 10 دقيقة نقل 30 ميكروليتر من النذرة مع P200 واسعة تلميح إلى أنبوب 1.5 مل جديدة. تأخذ ميكروليتر 1-2 إضافية للكشف عن تركيز استخدام فلوروميتير.
       ملاحظة: من المتوقع انتعاش ميكروغرام 5-6 في هذه الخطوة.
   22. إعداد رد فعل ربط في أنبوب عينة 1.5 مل بإضافة 30 ميكروليتر نهاية إصلاح "الحمض النووي حمو"، 20 ميكروليتر من مزيج محول (قراء د 1)، و 50 ميكروليتر من مزيج الرئيسي ربط بلانت/تا. مزيج من رد فعل بالتحريك بلطف 6 مرات بين كل إضافة متسلسلة وتدور وصولاً إلى إزالة الفقاعات.
   23. تبني رد فعل على RT لمدة 60 دقيقة.
   24. ريسوسبيند الخرز المغناطيسي من بيبيتينج أو فورتيكسينج. إضافة 40 ميكروليتر الخرز (0.4 x) لربط رد فعل والمزيج بلطف بالتحريك الأنبوب 6 مرات. قم بتدوير الأنبوب في خلاط المدورة في الرايت 20 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
   25. كرر الخطوة 2.1.10 مرة واحدة.
   26. إضافة ميكروليتر 400 محول حبة الملزمة (أي بي بي) المخزن المؤقت في الأنبوب. نفض الغبار الأنبوب بلطف 6 مرات ريسوسبيند الخرز. ضع الأنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي لفصل الخرز من المخزن المؤقت وتجاهل المادة طافية.
   27. كرر الخطوة 2.1.26 مرة واحدة.
   28. تدور أسفل العينة في 1,000 س ز 2 s في مكان الرايت الأنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسية. قم بإزالة أي المخزن المؤقت المتبقية والهواء الجاف لمدة 30 ثانية. لا جاف أكثر بيليه.
   29. إزالة الأنبوب من الرف المغناطيسية وريسوسبيند بيليه في ميكروليتر 43 شطف المخزن المؤقت. بلطف نفض الغبار على أنبوب لضمان أن الخرز مشمولة في المخزن المؤقت، واحتضان في خلاط المدورة في RT للحد الأدنى 30 بلطف نفض الغبار على أنبوب كل 5 دقائق للمساعدة في استثارة لبيليه.
   30. بيليه الخرز على الرف المغناطيسي لتتحمل على الأقل 10 دقيقة نقل 40 ميكروليتر من النذرة مع P200 واسعة تلميح إلى أنبوب 1.5 مل جديدة. تأخذ ميكروليتر 1-2 إضافية للكشف عن تركيز استخدام فلوروميتير.
       ملاحظة: من المتوقع انتعاش من 1-2 ميكروغرام في هذه الخطوة. المكتبة على أساس القص الميكانيكية جاهزة للتحميل. ويمكن تخزين المكتبة على الجليد ليصل إلى 2 حاء حتى التحميل للتسلسل إذا لزم الأمر.
2. بناء مكتبة على أساس تجزئة ترانسبوساسي
   1. ذوبان الجليد الكواشف من ترانسبوساسي كيت (انظر الجدول للمواد). ذوبان الجليد تجزئة المزيج (فرنسا) ومحول السريع (الراب) على الجليد وماصة المزيج. ذوبان الجليد التسلسل المخزن المؤقت (سكب)، تحميل الخرز (رطل) ومسح المخزن المؤقت (فلب) ومسح الحبل (أنطوني) على RT و "الماصة؛" لخلط. ذوبان الجليد تحميل الخرز (رطل) RT وماصة لخلط قبل الاستخدام. بمجرد إذابة، تبقى كافة مكونات طقم على الجليد. تأخذ بها الإنزيمات عند الحاجة فقط.
   2. التحقق من نوعية وكمية من "الحمض النووي حمو" من الخطوة 1.21.2. ماصة من 20 ميكروليتر من الحمض النووي في أنابيب 1.5 مل جديدة من ثلاثة مواقع مختلفة في أنبوب "حمو الحمض النووي" باستخدام P200 واسعة تتحمل نصائح. تأخذ 1 ميكروليتر من مختبرين الثلاثة للكشف عن تركيز استخدام فلوروميتير والجودة استخدام الأشعة فوق البنفسجية القراءة. تحقق عدة مرات لتأكيد النتائج.
      ملاحظة: تظهر النتائج المتوقعة في الشكل 3B. هو قيمة_260/280 OD حوالي 1.9 وقيمة_260/230 OD حوالي 2.3.
   3. إعداد رد فعل تاجمينتيشن الحمض النووي في أنبوب 0.2 مل بإضافة ميكروليتر 22 حمو الحمض النووي، ميكروليتر 1 10 مم تريس (pH 8.0) مع 0.02 في المائة تريتون X-100 و 1 ميكروليتر من تجزئة المزيج (فرنسا). تحمل مزيج من بيبيتينج مع P200 واسعة في تلميح بقدر الإمكان من بطء 6 مرات، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات.
   4. احتضان رد فعل عند 30 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تليها 80 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ومن ثم اضغط على 4 درجة مئوية. تحويل المزيج إلى أنبوب 1.5 مل جديدة مع P200 واسعة تتحمل نصيحة والانتقال إلى الخطوة التالية مباشرة.
   5. أضف 1 ميكروليتر من المحول السريع (الراب) إلى أنبوب عينة 1.5 مل. تحمل مزيج من بيبيتينج مع P200 واسعة في تلميح بقدر الإمكان من بطء 6 مرات، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات.
   6. تبني رد فعل على RT لمدة 60 دقيقة.
      ملاحظة: المكتبة على أساس تجزئة ترانسبوساسي جاهز للتحميل. ويمكن تخزين المكتبة على الجليد ليصل إلى 2 حاء حتى التحميل للتسلسل إذا لزم الأمر.

3-تسلسل على جهاز نانوبوري

1. قم بفحص الجهاز تسلسل نانوبوري (انظر الجدول للمواد). تأكد من أن كل البرامج والأجهزة تعمل وهناك مساحة تخزين كافية.
2. فحص الخلية التدفق. فتح خلية تدفق جديد وإدراج الخلية تدفق الجهاز نانوبوري. تحقق من المربع موقع الخلية تدفق تم إدراجه في (X1-X5). حدد نوع الخلية التدفق الصحيح. انقر فوق التحقق من الخلايا تدفق سير العمل. انقر فوق الزر بدء تشغيل الاختبار لبدء تدفق خلية التحليل ومراقبة الجودة.
   ملاحظة: إذا كان عدد المسام النشطة مجموع المبلغ عنها أقل من 800، استخدام خلية تدفق جديدة مختلفة للتسلسل.
3. إعداد المخزن المؤقت فتيلة. لمكتبة على أساس القص ميكانيكية، إضافة ميكروليتر 576 من تشغيل المخزن المؤقت مع مزيج الوقود (المصرف) و 624 ميكروليتر مياه خالية من نوكلاس في أنبوب 1.5 مل. دوامة وتدور وصولاً إلى مزيج فتيلة المخزن المؤقت. لمكتبة على أساس تجزئة ترانسبوساسي وإضافة 30 ميكروليتر من حبل دافق (أنطوني) إلى الأنبوب من تدفق المخزن المؤقت (فلب). دوامة وتدور وصولاً إلى مزيج فتيلة المخزن المؤقت.
4. في الخلية، وتدفق حرك غطاء منفذ فتيلة عقارب الساعة لفضح المنفذ فتيلة.
5. تعيين ماصة P1000 إلى 100 ميكروليتر وإدراج التلميح بمنفذ التفجير. رسم يعود صغر حجم المخزن المؤقت (أقل من 30 ميكروليتر) لإزالة أي فقاعات من الخلية تدفق. وقف بيبيتينج حالما يدخل كمية صغيرة من السائل الأصفر التلميح.
6. استخدام ماصة P1000 تحميل ميكروليتر 800 من مزيج فتيلة داخل الخلية التدفق عبر منفذ التفجير. لتجنب إدخال فقاعات، إضافة 30 ميكروليتر من مزيج فتيلة لتغطية الجزء العلوي من الميناء فتيلة أولاً، ثم إدراج التلميح بمنفذ التفجير وإضافة ما تبقى المزيج فتيلة ببطء. تأخذ بها التلميح عندما يكون هناك حوالي 50 ميكروليتر اليسار. إضافة ما تبقى مزيج فتيلة على رأس الميناء فتيلة. سوف تذهب السوائل داخل بحد ذاته.
7. اترك الإعداد لاحتضان لمدة 5 دقائق. وفي الوقت نفسه، تعد المزيج مكتبة في أنبوب 1.5 مل يحتوي على المكتبة.
   ملاحظة: لمكتبة على أساس القص ميكانيكية إضافة 35 ميليلتر لتشغيل المخزن المؤقت مع مزيج الوقود (المصرف) إلى ميليلتر 40 مكتبة الحمض النووي. إضافة لمكتبة على أساس تجزئة ترانسبوساسي ميليلتر 34 من التسلسل المخزن المؤقت (سقب) و 16 ميليلتر مياه خالية من نوكلياسي إلى 25 ميليلتر من المكتبة الحمض النووي.
8. افتح غطاء منفذ عينة خلية تدفق برفق لفضح المنفذ عينة. استخدام ماصة P1000 إضافة 200 ميكروليتر من مزيج فتيلة من خلال منفذ فتيلة في الخلية تدفق كما هو موضح في الخطوة 3، 5. تأكد من أنه لم يتم تحميل ميكس فتيلة في الخلية التدفق من خلال منفذ عينة.
9. تعيين ماصة P200 إلى 80 ميكروليتر. ميكس المكتبة بلطف مع مجموعة واسعة تتحمل نصيحة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 6 مرات فقط قبل التحميل.
10. تحميل ميكس مكتبة dropwise عبر منفذ عينة في الخلية التدفق. قم بإضافة كل قطره فقط بعد إسقاط السابقة يتم تحميلها بالكامل في المنفذ.
11. إعادة وضع غطاء منفذ عينة بلطف وتأكد من المنفذ عينة مغطى تغطية كاملة. تحريك غطاء منفذ فتيلة الفيلتر لتغطية منفذ التفجير. إغلاق غطاء الجهاز.
12. انقر فوق سير العمل تجربة جديدة . اكتب اسم المكتبة، حدد المجموعة الصحيحة وفقا للإجراءات المتبعة، وتحقق من صحة الإعدادات الصحيحة (48 ح تشغيل، على قاعدة الاتصال في الوقت الحقيقي).
13. انقر فوق بدء تشغيل. بعد 10 دقيقة، سجل معرف خلية تدفق وأرقام نانوبوري النشطة (العدد الإجمالي وأرقام كل أربع مجموعات) من معلومات التشغيل.
14. تحليل البيانات. نسخ البيانات إلى كمبيوتر محلي أو مجموعة في أي وقت تسلسل أو عند الانتهاء من التشغيل. استخدام Minimap2¹⁶ (https://github.com/lh3/minimap2) بمحاذاة البيانات تسلسل الجينوم مرجع. تلخيص أداء التسلسل من البيانات الأولية تسلسل وأن التحالفات التي نانوبلوت¹⁷ (https://github.com/wdecoster/NanoPlot).

النتائج

ينطبق البروتوكول تسلسل الحمض النووي طويلة جداً "حمو الحمض النووي" لبناء مكتبة. ولذلك، من الأهمية بمكان اختيار الخلايا المستزرعة جيدا مع نسبة لايف > 85% في الخلية حصاد خطوة. كمية الخلايا المستخدمة لاستخراج الحمض النووي سيؤثر على النوعية والكمية من "الحمض النووي همو". تحلل الخلية لا يعمل جيدا إذا بدأت مع عدد كبير جداً من الخلايا. استخدام عدد قليل جداً من الخلايا لا تولد ما يكفي من الحمض النووي لبناء مكتبة لترسيب "الحمض النووي همو" تتم باستخدام التناوب لطيف باليد بدلاً من الطرد المركزي عالية السرعة. مثال من "الحمض النووي حمو" بعد إضافة المثلج 100 ٪ الإيثانول والتناوب هو كما هو موضح متسرعا مثل القطن الأبيض في الشكل 2.

من المهم التحقق من جودة المدخلات الحمض النووي قبل البدء في إنشاء المكتبة. يمكن أن يكون التدهور الكمي غير صحيحة والتلوث (مثلاً، البروتينات، والكشف، والمنظفات، الفاعل، والفينول المتبقية أو الإيثانول) والوزن الجزيئي المنخفض الحمض النووي أثر كبير على الإجراءات اللاحقة وعلى النهائي قراءة طول. نوصي بإجراء التحليل ومراقبة الجودة باستخدام الحمض النووي من ثلاثة مواقع مختلفة في الأنبوبة التي تحتوي على "الحمض النووي حمو". من الأشعة فوق البنفسجية قراءة النتائج "الحمض النووي حمو"، قيمة₂₈₀ /OD₂₆₀OD حوالي 1.9 وهو قيمة₂₃₀ /OD₂₆₀OD حوالي 2.3 (الشكل 3 أ، ب). وتتسق هذه القيم نسبة بين ثلاثة اختبارات عينة "الحمض النووي حمو" جيدة. أساليب القص مختلفة تتطلب كميات مختلفة من الحمض النووي الإدخال. يتعين تركيز "الحمض النووي همو" > 200 نانوغرام/ميليلتر للقص الميكانيكية في حين أنها تحتاج إلى أن تكون > 1 ميكروغرام/ميليلتر لتجزئة ترانسبوساسي. تركز الكشف عنها بواسطة fluorometer أقل قليلاً من الأشعة فوق البنفسجية القراءة. ومع ذلك، معامل الاختلاف لتركيز العينة "حمو الحمض النووي" نفسه مطلوب أن تكون أقل من 15% مع فلوروميتير والأشعة فوق البنفسجية قراءة فحوصات. وينطبق حقنه بإبرة لكسر "همو الحمض النووي" حيث أن عدد تصاريح الدخول عن طريق الإبرة سوف تؤثر على حجم الحمض النووي المنفصمة والقراءة النهائية طول القص الميكانيكية. من المستحسن القيام بحجم مراقبة الجودة بعد إبرة القص لضمان أغلبية "الحمض النووي حمو" أكبر من 50 كيلو بايت كما هو موضح في الشكل 4. في أسلوب القص الميكانيكية، ولدت يمر 30 أفضل النتائج تسلسل النظر سواء في الطول والإخراج.

N50 من مكتبة على أساس القص الميكانيكية 50-70 كيلوبايت بينما مكتبة القائم على تفتيت ترانسبوساسي 90-100 كيلو بايت. وترد نتائج تشغيل أربعة باستخدام خط الخلية HG00733 في الجدول 1. كافة المجريات الأربعة قد يقرأ أكثر 2,300 مع طول أطول من 100 كيلو بايت. الحد الأقصى للطول أطول في ترانسبوساسي المستندة إلى تجزئة المكتبات (455 كيلو بايت و 489 كيلو بايت) بالمقارنة مع المكتبات على أساس القص الميكانيكية (348 كيلو بايت و 387 كيلو بايت) بينما الأخيرة أنتجت أكثر من ما يلي: مجموع، تشير إلى ارتفاع عائد. بناء مكتبة على أساس تجزئة ترانسبوساسي له عدد أقل من الخطوات وأقصر مدة التحضير حتى أنها ستقدم أجزاء قصيرة أقل. تشغيل اثنين باستخدام ترانسبوساسي يكون أطول يعني (> 30 كيلو بايت) ومتوسط طول (> 10 كيلو بايت). وبالإضافة إلى ذلك، تظهر البيانات متسقة ذات جودة عالية في كافة المجريات (نقاط الجودة يعني حوالي 10.0، ~ 90% دقة قاعدة). كانت الانحياز أكثر من 97 في المائة من مجموع الأسس المرجعية البشرية بالمجين (hg19) باستخدام Minimap2¹⁶ مع الإعدادات الافتراضية. ويبين الشكل 5توزيعات الحجم المتوقع من الخام على ما يلي. وقد يدير كل نسبة كبيرة من البيانات أعلاه 50 كيلو بايت بينما ترانسبوساسي المستندة إلى تجزئة مكتبات لديها أعلى نسبة من يقرأ طويلة جداً (مثل > 100 كيلو بايت). هذا البروتوكول قد طبق بنجاح في خطوط الخلايا البشرية متعددة (تكميلية الجدول 1).

رقم 1: نظرة عامة التخطيطي لسير العمل منذ فترة طويلة-قراءة التسلسل (NLR-seq) نانوبوري- أورانج، ترانسبوساسي المعقدة. الأصفر والأخضر، محول نانوبوري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: ترسيب الحمض النووي الممثل من طريقة استخراج الفينول كلوروفورم. ويشير السهم الأبيض إلى "الحمض النووي حمو". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: نتائج مراقبة الجودة مثال من "الحمض النووي حمو" من قراءة الأشعة فوق البنفسجية- (أ) "حمو الحمض النووي" من الخطوة 1.21.1 جاهزة للبناء الميكانيكية مكتبة القائم على القص. (ب) "حمو الحمض النووي" من الخطوة 1.21.2 للبناء القائم على تجزئة مكتبة ترانسبوساسي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: نتائج مراقبة الجودة من الإبرة المنفصمة "حمو الحمض النووي" بالتفريد جل الحقل نابض. L1: تحميل سريع 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي؛ L2: سرعة التحميل 1 كيلو بايت تمديد سلم الحمض النووي. 1-8: الحمض النووي مع أوقات مرور مختلفة عن طريق القص الإبرة. 1-3، لا القص؛ 4، 10 مرات؛ 5، 20 مرة؛ 6، 30 ضعفا؛ 7، 40 مرة؛ 8، 50 مرة. هذه الخطوة مراقبة الجودة اختياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 5: من المتوقع توزيع حجم المكتبات الحمض النووي طويلة جداً نانوبوري- مرض التصلب العصبي المتعدد، المكتبات على أساس القص الميكانيكية. TF، المكتبات على أساس تجزئة ترانسبوساسي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

	Shearing_rep1 الميكانيكية	Shearing_rep2 الميكانيكية	Fragmentation_rep1 ترانسبوساسي	Fragmentation_rep2 ترانسبوساسي
خط الخلية	HG00733	HG00733	HG00733	HG00733
N50 من ما يلي	55,180	63,007	98,237	95,629
عدد القراءات أكثر من 100 كيلو بايت	2,500	3,082	2,386	2,355
عدد مجموع ما يلي:	97,859	80,465	24,166	21,032
الحد الأقصى للطول (bp)	348,482	387,113	454,660	489,426
يعني الطول (bp)	17,861	20,395	33,528	38,175
متوسط الطول (bp)	5,335	5,894	10,249	15,656
يعني نوعية ما يلي:	10.0	10.1	9.9	10.0
مجموع الأسس الأولية ما يلي:	1,747,849,822	1,641,058,932	810,229,733	802,886,304
مجموع أسس الانحياز ما يلي:	1,693,300,832	1,607,975,925	791,422,077	778,417,627
نسبة معين من مجموع القواعد (hg19، Minimap2)	96.9%	98، 0%	97.7%	97.0%
عدد المسام النشطة	1225:480، 402، 254، 89	1058:480، 356، 176، 46	958:452، 328، 148، 30	1092:487، 367، 195، 43

الجدول 1: موجز من مقاييس الأداء يعمل مع مختلف البروتوكولات الإمالة.

	مكتبة 1	مكتبة 2
خط الخلية	K562	GM19240
خلية معلومات الطلب	ATCC، لجنة مناهضة التعذيب. لا. شركة CCL-243	معهد كوريل، ولجنة مناهضة التعذيب. لا. GM19240
بروتوكول	القص الميكانيكية	القص الميكانيكية
N50 من ما يلي	60,063	55,295
عدد مجموع ما يلي:	193,783	120,807
متوسط الطول (bp)	1,843	4,688
يعني الطول (bp)	9,825	17,408
الحد الأقصى للطول (bp)	548,780	212,338
مجموع الأسس الأولية ما يلي:	1,903,989,686	2,103,015,331
مجموع أسس الانحياز ما يلي:	1,837,350,047	1,997,419,761
نسبة معين من مجموع القواعد (hg19، Minimap2)	96.6%	95.0%
عدد المسام النشطة	1111:482، 371، 203، 55	1032:447، 333، 196، 56

التكميلية الجدول 1: موجز لدورتين كاملتين NLR seq استخدام خطوط الخلايا الأخرى مع البروتوكول القص الميكانيكية.

Discussion

من حيث المبدأ، تسلسل نانوبوري قادرة على توليد 100 كيلو بايت ليقرأ مجباس بطول^11،،من¹²¹³. أربعة عوامل رئيسية سوف تؤثر على أداء نوعية البيانات وتشغيل التسلسل: 1) أرقام المسام النشطة ونشاط المسام؛ 2) بروتين السيارات، الذي يتحكم في سرعة الحمض النووي مرورا نانوبوري؛ 3) قالب الحمض النووي (طول والنقاء والجودة، جماعية)؛ 4) تسلسل محول ربط الكفاءة، الذي يحدد الحمض النووي صالحة للاستعمال من العينة الإدخال. أول اثنين من العوامل تعتمد على الإصدار من الخلية تدفق وتسلسل مجموعة توفيرها من قبل الشركة المصنعة. ثاني العاملين هما خطوات حاسمة في هذا البروتوكول (استخراج "الحمض النووي حمو" والقص والربط).

يتطلب هذا البروتوكول من الصبر والممارسة. نوعية "حمو الحمض النووي" مهم ل مكتبات الحمض النووي طويلة جداً⁶. البروتوكول ويبدأ بالخلايا التي تم جمعها مع بقاء عالية (> 85% خلية قابلة للتطبيق المفضل)، يحد من الحمض النووي المتدهورة من الخلايا الميتة. وينبغي تجنب أي عملية قاسية مما قد يعرض الأضرار بالحمض النووي (مثلاً، قوية مثيرة للقلق، والهز، ودوامه، متعددة بيبيتينج، وتكرار تجميد وذوبان الجليد). في تصميم البروتوكول، يمكننا حذف بيبيتينج في عملية استخراج الحمض النووي برمتها. نصائح تتحمل واسعة تحتاج لاستخدامه عند بيبيتينج ضروري بعد القص الميكانيكية أثناء تشييد مكتبة وتسلسلها. نانوبوريس حساسة لكيمياء في المخزن المؤقت الدائرة¹²، هناك ينبغي أن الملوثات المتبقية قليلة (مثلاً، المنظفات، التوتر السطحي، الفينول، الإيثانول، البروتينات الكشف، إلخ) ممكن في الحمض النووي. ونظرا لطول والغلة، يبين طريقة استخراج الفينول نتائج أفضل وأكثر استنساخه بالمقارنة مع أساليب الاستخراج مختلفة متعددة اختبار حتى الآن.

وعلى الرغم من قدرة هذا البروتوكول على إنتاج تسلسلات طويلة للقراءة، لا تزال هناك العديد من القيود. أولاً، هذا البروتوكول كان الأمثل استناداً إلى جهاز التسلسل نانوبوري المتاحة في وقت النشر؛ وهكذا، يقتصر على كيمياء تسلسل الانتقائي القائم على نانوبوري ويمكن أن تكون دون المستوى الأمثل عند القيام بأنواع أخرى من أجهزة تسلسل طويلة للقراءة. ثانيا، والنتيجة تعتمد اعتماداً كبيرا على النوعية من الحمض النووي المستخرج من المواد البداية (الأنسجة أو الخلايا). طول القراءة ستتأثر إذا كان الحمض النووي انطلاق الفعل المتدهورة أو أضرار. ثالثا، على الرغم من أن العديد من الخطوات ومراقبة الجودة مدرجة في بروتوكول للتحقق من جودة الحمض النووي، المحصول النهائي وطول على ما يلي يمكن أن يتأثر تدفق الخلية والمسام النشاط، الذي يمكن أن يكون المتغير في هذه المرحلة المبكرة من منصة التسلسل نانوبوري التنمية.

هنا يستخدم بروتوكول وصف عينات خط الخلية البشرية تعليق لاستخراج الحمض النووي. ونحن قد الأمثل مرات يمر بإبرة القص، نسبة "الحمض النووي حمو" ترانسبوساسي والوقت عملية ربط لإنتاج نتائج وصف. ويمكن توسيع البروتوكول بأربع طرق. أولاً، يمكن للمستخدمين بدء مع خلايا الثدييات الأخرى المستزرعة وكمية مختلفة من الخلايا والأنسجة والعينات السريرية، أو الكائنات الحية الأخرى. ستكون هناك حاجة إلى مزيد التحسين في وقت الحضانة تفسخ وحجم رد الفعل والطرد المركزي. ثانيا، من الصعب التنبؤ بحجم الهدف لتسلسل قراءة طويلة جداً. إذا كانت أطوال اقرأ أقصر مما كان متوقعا، للمستخدمين ضبط مرات عابرة في الأسلوب القائم على القص الميكانيكية أو تغيير النسبة من "الحمض النووي حمو" ترانسبوساسي في الأسلوب القائم على تجزئة ترانسبوساسي. وقت الربط وشطف أطول خلال خطوات تنظيف مفيدة لأن "الحمض النووي حمو" عالية اللزوجة. ثالثا، مع أجهزة تسلسل نانوبوري مختلفة، واحد ضبط مقدار وحجم الحمض النووي لتلبية معايير جهاز التسلسل. رابعا، سوف التسلسل فقط الحمض النووي متصلة بمحولات التسلسل. لزيادة تحسين كفاءة عملية ربط، يمكن محاولة أحد تيتراتي تركيزات ليجاسى ومحول. ربط تعديل الوقت وعوامل الازدحام الجزيئية مثل شماعة¹⁸ يمكن تطبيقها في المستقبل. قد توفر فائقة طويلة البروتوكول تسلسل الحمض النووي جنبا إلى جنب مع كريسبر^19،20 أداة فعالة لهدف إثراء التسلسل.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Agencourt AMPure XPbeads	Beckman	A63881	magnetic beads for cleanup
BD conventional needles	Becton Dickinson	305136	27G, for mechanical shearing
BD Luer-Lok syringe	Becton Dickinson	309628	for mechanical shearing
Blunt/TA Ligase Master Mix	NEB	M0367S
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228	for cell counting
EDTA	Invitrogen	AM9261	pH 8.0, 0.5 M, 500 mL
Flow Cell	Oxford Nanopore Technologies	FLO-MIN106	R9.4.1
HG00773 cells	Coriell Institute	HG00733	cells used in this protocol
Ligation Sequencing Kit 1D	Oxford Nanopore Technologies	SQK-LSK108	nanopore ligation kit
MaXtract High Density tubes	Qiagen	129073	gel tubes
NEBNext FFPE DNA Repair Mix	NEB	M6630S
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module	NEB	M7546S
Nuclease-free water	Invitrogen	AM9937
Phosphate-Buffered Saline, PBS	Gibco	70011044	10X, pH 7.4
Phenol:chloroform:IAA	Invitrogen	AM9730
Proteinase K	Qiagen	19131	20 mg/mL
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32850	fluorometer assays for DNA quantification
Rapid Sequencing Kit	Oxford Nanopore Technologies	SQK-RAD004	nanopore transposase kit
RNase A	Qiagen	19101	100 mg/mL
SDS	Invitrogen	AM9822	10% (wt/vol)
Sodium chloride solution	Invitrogen	AM9759	5.0 M
TE buffer	Invitrogen	AM9849	pH 8.0
Tris	Invitrogen	AM9856	pH 8.0, 1 M
Triton X-100 solution	Sigma-Aldrich	93443	~10%
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Bio-Rad C1000 Thermal Cycler	Bio-Rad	1851196EDU
Centrifuge 5810R	Eppendorf	22628180
Countess II FL Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000	for cell counting
DynaMag-2 Magnet	Life Technologies	12321D	magnetic rack
Eppendorf ThermoMixer	Eppendorf	5382000023	for incubation
Freezer	LabRepCo	LHP-5-UFMB
GridION	Oxford Nanopore Technologies	GridION X5	nanopore device used in this protocol
HulaMixer Sample Mixer	Thermo Fisher Scientific	15920D	rotator mixer
MicroCentrifuge	Benchmark Scientific	C1012
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-1000	for UV reading
Pippin Pulse	Sage Science	PPI0200	pulsed-field gel electrophoresis instrument
Qubit 3.0 Fluorometer	Invitrogen	Q33216	fluorometer
Refrigerator	LabRepCo	LABHP-5-URBSS
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-A236
Water bath	VWR	89501-464