تنقية الكسر الدندي الغنية فيلبوديا

Summary

في هذا البروتوكول، نقدم طريقة لتنقية الكسر الغنية بالفيلوبوديا الدرورية من بنية البروز الشبيهة بالأكواب الفاغوية على الخلايا العصبية الفرسامة المستزرعة من خلال الاستفادة من التقارب المحدد والقوي بين الفيلوبودي الدندرية جزيء التصاق، TLCN، وجزيء مصفوفة خارج الخلية، فيتورينيكستين.

Abstract

فيلبوديا الددرية رقيقة وطويلة على أساس خيوط الأكتين، وأنها تمتد وتتراجع كما لو كان البحث عن محور الهدف. عندما ينشئ الفيلبوديا الددرية الاتصال مع محور الهدف، فإنها تبدأ في النضج في العمود الفقري، مما يؤدي إلى تشكيل متشابك. يتم توطين Telencephalin (TLCN) بوفرة في فيلوبوديا الددرية ويتم استبعاده تدريجيا من العمود الفقري. الإفراط في التعبير عن TLCN في الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة يحفز تشكيل فيلبوديا dendritic. أظهرنا أن التيلجيزين يرتبط بقوة بجزيء مصفوفة خارج الخلية، فيتورينيكستين. فيترونيكستين المغلفة microbeads الناجمة عن تشكيل كأس phagocytic على dendrites الخلايا العصبية. في الكأس phagocytic، TLCN، TLCN ملزمة البروتينات مثل الفسفوريلاتيد إزرين / راديكسين / موسين (فوسفو-ERM)، وF-أكتين تتراكم، مما يشير إلى أن مكونات الكأس phagocytic مماثلة لتلك التي من filopodia dendritic. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة لتنقية الكأس phagocytic بدلا من فيلبوديا dendritic. كانت مغلفة الخرز البوليسترين المغناطيسي مع فيتوريتكن، الذي هو موجود بوفرة في وسط الثقافة من الخلايا العصبية فرس النهر والتي تحفز تشكيل كأس phagocytic على dendrites الخلايا العصبية. بعد 24 ساعة من الحضانة، كانت الكؤوس phagocytic الذوبان أقل ما يقال مع المنظفات وجمعها باستخدام فاصل المغناطيس. بعد غسل الخرز، تم تلطخ البروتينات الملزمة وتحليلها من قبل تلطيخ الفضة والنشاف الغربية. في الكسر ملزمة, [تلكن] و [أكتين] كان بوفرة حاضرة. وبالإضافة إلى ذلك، تم توطين العديد من البروتينات التي تم تحديدها من الكسر إلى فيلوبوديا الدندية. وهكذا، أطلقنا على الكسر الملزم كجزء غني بالفيلوبوديا الدندية. توضح هذه المقالة تفاصيل فيما يتعلق بطريقة تنقية للكسر الغنية بالفيلوبوديا dendritic.

Introduction

ويعتقد أن فيلبوديا الددرية هي سلائف العمود الفقري. خيوط أكتين في فيلوبوديا dendritic تنظيمتمديدها والتراجع 1،^2،3. بعد الاتصال مع محور، فيلوبوديا dendritic مختارة تبدأ نضجها في العمود الفقري، ويتم تشكيل متشابك^4،5. وقد تم تحديد مكونات العمود الفقري من التحليل الشامل للكسور الكثافة المشاركات^6،7، في حين أن مكونات filopodia dendritic لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. وقد تبين أن telencephalin (TLCN)، ERM، SynGAP، راس، PI3 كيناز، Akt، mTOR، البولو مثل كيناز 2، CaMKII، syndecan-2، paralemin-1، ARF6، وEphB تنظيم تشكيل فيلبوديا dendritic^{5،8،9 ،10،11}، في حين لم يتم تطوير طريقة للتحليل الشامل للجزيئات الموجودة في فيلبوديا dendritic.

يتم التعبير عن TLCN (ICAM-5) على وجه التحديد من قبل الخلايا العصبية الشائكة في الجزء الدماغ الأكثر rostral, وtelencephalon¹². TLCN لديها 9 مجالات مثل Ig في منطقتها خارج الخلية، ومنطقة عبر الغشاء، والذيل السيتوبلازمي¹³. TLCN يربط إلى فيتورينيكستين (VN) وLFA-1 integrin في منطقتها خارج الخلية، إلى presenilin في منطقتها عبر الغشاء، وphospho-ERM وα-actinin في منطقتها السيتوبلازمية^{5،8،14،15 ،16}. TLCN يربط إلى الهيكل السيتوني الأكتين من خلال PHOSPHo-ERM في نصائح من فيلبوديا dendritic وα-actinin في العمود الفقري ومهاوي dendritic^8،16.

أظهرنا أن الإفراط في التعبير عن TLCN تعزيز تشكيل فيلبوديا dendritic وحفزت على إعادة العمود الفقري إلى filopodia¹⁰. الشكل التأسيسي النشط من ezrin ملزمة لمنطقة السيتوبلازمية TLCN وتعزيز تشكيل فيلبوديا dendritic⁸. وهكذا، ينظم TLCN تشكيل فيلبوديا الدندرية من خلال البروتينات الملزمة للأكتين. وقد أثبت Esselens وآخرون أن الخرز الصغير الناجم عن تراكم TLCN على الخلايا العصبية المستزرعة¹⁷. أظهرنا أن هياكل كأس phagocytic تشكلت على dendrites الخلايا العصبية حول الخرز الصغير المغلفة VN بطريقة تعتمد على TLCN¹⁵. مكونات فيلبوديا dendritic مماثلة لتلك التي من كأس phagocytic. من الصعب جمع فيلبوديا dendritic، ولكن من الأسهل نسبيا لجمع الكأس phagocytic باستخدام microbeads المغناطيسي. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة لتنقية الكأس phagocytic بدلا من فيلبوديا dendritic¹⁸. هنا، ونحن نصف طريقة تنقية للجزء الفيلوبوديا الدندي.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها من RIKEN واكو.

1. ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر

1. إعداد وسط الثقافة
   1. إعداد مزيج فيتامين 200x. حل 100 ملغ من حمض البانتوثيك ملح الهيميكالسيوم، 100 ملغ من كلوريد الكولين، 100 ملغ من حمض الفوليك، 180 ملغ من i-inositol، 100 ملغ من النياسيناميد، 100 ملغ من حمض الهيدروكلوريك البيريدوكسال، و 100 ملغ من حمض الهيدروكلوريك الثيامين في 500 مل من المياه النقية باستخدام النمام المغناطيسي. الحل لا يذوب تماما. يُمزج بعناية، ويُخلط في أنابيب 50 مل ويُخزن عند -20 درجة مئوية.
   2. إعداد محلول الريبوفلافين. حل 100 ملغ من الريبوفلافين في 500 مل من المياه فائقة النقية باستخدام النمام المغناطيسي. الحل لا يذوب تماما. يُمزج بعناية، ويُخلط في أنابيب 50 مل ويُخزن عند -20 درجة مئوية.
   3. إعداد 1 M CaCl₂. حل 7.35 غرام من CaCl₂·2H₂O في 50 مل من المياه النقية باستخدام النمام المغناطيسي.
   4. إعداد الحد الأدنى من المتوسط الأساسي (MEM). حل 400 ملغ من كل شيء، 6800 ملغ من حمض الكلس، 2200 ملغ من NaHCO_3،158 ملغ من NaH₂PO₄·2H₂O، 7000 ملغ من D-الجلوكوز، و 200 ملغ من MgSO₄-7H₂O في 950 مل من المياه النقية باستخدام النمام المغناطيسي.
   5. Titrate 1.8 مل من 1 M CaCl₂ إلى MEM بطريقة قطرة بقطرة باستخدام أنبوب 1 مل مع التحريض المستمر على النمام المغناطيسي. ضبط الوظيفة الهيدروجينية للMEM إلى pH 7.25 مع 1 مول / لتر حمض الهيدروكلوريك.
   6. إضافة 5 مل من مزيج فيتامين 200X و 200 ميكرولتر من محلول الريبوفلافين إلى MEM. ضبط حجم الحل إلى 1000 مل مع المياه فائقة النقاء. قم بتصفية الحل باستخدام نظام فلتر بمقدار 0.22 متر وتخزينه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   7. إعداد 10X DNase-I حلول الأسهم. حل 100 ملغ من DNase-I في 12.5 مل من حل الملح المتوازن هانكس (HBSS)، تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر، aliquot في أنابيب 1.5 مل، وتخزين الأنابيب في -20 درجة مئوية.
   8. إعداد السيتوسين β-D-أرابينومورانوسيد (آرا-C) حل الأسهم. حل 25 ملغ من Ara-C في 8.93 مل من المياه فائقة النقاء (التركيز النهائي من 10 MM)، مرشح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر، aliquot في أنابيب 1.5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية
   9. إعداد وسط الطلاء. مزيج 1 مل من محلول الأحماض الأمينية MEM، 750 ميكرولتر من 1 م HEPES، 1 مل من B27، 125 ميكرولتر من 200 مل الجلوتامين، 250 ميكرولتر من البنسلين / العقديات، 2.5 مل من المصل البقري الجنيني (FBS)، و 44.375 مل من MEM في أنبوب 50 مل.
   10. إعداد وقف المتوسطة. مزيج 1 مل من حل الأحماض الأمينية MEM، 750 درجة مئوية من 1 م HEPES، 5 مل من FBS (النهائي 10٪)، و 43.25 مل من MEM في أنبوب 50 مل.
2. إعداد الأطباق المغلفة بولي-L-يسين
   1. معطف 35 ملم أطباق زراعة الخلايا البلاستيكية مع 0.2 ملغ / مل من بولي-L-يسين هيدروبروميد لمدة يوم واحد في 25 درجة مئوية.
      ملاحظة: ولا ينبغي استخدام بروميد البولي -L-يسين بدلاً من بروميد مائي متعدد الليسين.
   2. اغسل الأطباق بـ 2 مل من الماء النقي 3 مرات. تحضن الأطباق مع 1.5 مل من إيقاف المتوسطة في 25 درجة مئوية حتى استخدامها.
3. تشريح الخلايا العصبية الحصية من جنين الماوس
   1. مصدر أنسجة الخلايا العصبية الحصية. تشريح الحصين من الفئران من النوع البري وTLCN ناقص C57BL6/J في الأيام الجنينية 16-17 وفقا لطريقة لو وآخرون¹⁹.
   2. احتضان تشريح فرس النهر في 0.25٪ تريبسين و 1X DNaseI في HBSS تحتوي على 15 M HEPES، درجة الحموضة 7.2 لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية مع التحريض كل 3 دقائق. حضانة فرس النهر في 10 مل من وقف المتوسطة لتعطيل التربسين في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   3. نقل hippocampi إلى 10 مل من المتوسطة توقف الطازجة وحضانة في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أنبوب مل. فصل فرس النهر في الخلايا العصبية المعزولة عن طريق الأنابيب 20 مرة باستخدام أنبوب 1 مل.
      ملاحظة: طرف الأنابيب 1 مل يمس قليلا الجزء السفلي من أنبوب 15 مل خلال تفكك فرس النهر.
   4. إضافة 9 مل من الطلاء المتوسطة، وتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل. عد عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيمتر وضبط إلى 3.5 × 10⁴ خلايا / مل في الطلاء المتوسطة.
   5. أسطاب وقف المتوسطة من الأطباق المغلفة بولي-L-يسين. تُصفيح الخلايا على الأطباق المغلفة بالبولي-إل-ليسين في 7 × 10⁴ خلايا/طبق (2 مل/طبق).
   6. بعد 60-64 ساعة من الحضانة تحت 5٪ CO₂ في 37 درجة مئوية، إضافة 2 ميكرولتر من حل الأسهم Ara-C (النهائي 10 μM) إلى الخلايا العصبية، ويهز الطبق ببطء. الحفاظ على أطباق الثقافة في مربع رطب دون تغيير وسط الثقافة تحت 5٪ CO₂ في 37 درجة مئوية.

2. تنقية الكسر الدندية الغنية فيلبوديا

1. بعد 13 يوما في المختبر (DIV)، إضافة microbeads البوليسترين المغناطيسي (3 × 10⁶ الجسيمات / طبق) إلى 20 أطباق تحتوي على الخلايا العصبية المستزرعة. بعد يوم واحد، وغسل الخلايا العصبية في 1 مل من PBS مع التحريض 3 مرات لإزالة microbeads المتوسطة وغير منضم. بعد إزالة PBS، lyse الخلايا العصبية مع 500 درجة مئوية / طبق من العازلة lysis (PBS تحتوي على 0.01٪ تريتون X-100، EDTA خالية من البروتياز كوكتيل المانع، وكوكتيل مثبطات الفوسفاتيز).
2. جمع lysate مع مكشطة الخلية ونقل lysate إلى الأنابيب الدقيقة منخفضة البروتين ملزمة (10 أنابيب). تعيين الأنابيب على فاصل المغناطيس والانتظار لمدة 1 دقيقة.
3. نقل الخرز إلى ميكروتوب جديدة منخفضة البروتين ملزمة، وضعت على فاصل المغناطيسي، وإزالة تماما supernatant. إضافة 500 درجة مئوية من العازلة lysis وغسل الخرز باستخدام خلاط دوامة لمدة 15 ق. تعيين الأنبوب على فاصل المغناطيس، والانتظار لمدة 1 دقيقة، وإزالة supernatant، وإضافة 500 درجة مئوية من العازلة lysis. كرر غسل الخرز 10 مرات وإزالة supernatant.
4. البروتينات المنضمة إلى الخرز (الكسر المنضم) بإضافة 50 ميكرولتر من 1x SDS عينة العازلة (62.5 mM Tris HCl، ودرجة الحموضة 6.8، 2.5٪ SDS، و 10٪ الجلسرين) ويغلي الأنبوب في 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. على فاصل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
5. قياس تركيزات البروتين من الكسور غير المنضمة والمقيدة عن طريق تحليل البروتين BCA. تصور حلول البروتين مع بروموفينول الأزرق وضبط التركيز إلى 5 نانوغرام / ميكرولتر لSDS-PAGE.

3. تلطيخ الفضة وتحليل وصمة عار الغربية

1. افصل الكسور المنضمة وغير المنضمة (50 نانوغرام) بواسطة SDS-PAGE باستخدام جل متدرج بنسبة 5-20%. الفضة وصمة عار هلام.
2. وصمة عار الغربية باستخدام المضادة لTLCN-C (1/3,000), مكافحة البقر فيترونيكستين (1/5,000), المضادة للأكتين (1/1,000), ومكافحة α-tubulin (1/1,000) كالأجسام المضادة الأولية وHRP-مترافق الماعز المضادة للأرنب IgG (1/5,000) كالأجسام المضادة الثانوية. تصور المستضدات باستخدام الكاشف الكشف عن النشاف الغربية chemiluminescent وصورة chemiluminescence.

النتائج

في الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة، تم توطين TLCN بوفرة إلى فيلبوديا dendritic، رمح، وسوما وcolocalized مع F-actin (الشكل1A،B). عندما أضيفت microbeads البوليسترين إلى الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة، كانت مغلفة تلقائيا الخرز مع فيتورينيكستين (VN) المستمدة من ?...

Discussion

قمنا بتطوير طريقة تنقية للجزء الغنية بالفيلوبوديا الددرية باستخدام التقارب بين جزيء التصاق الخلية TLCN وبروتين بروتين فيترونيكستين المصفوفة خارج الخلية. بالمقارنة مع كسر PSD، يمكن أن يكون من الممكن تحديد البروتينات متشابك تعمل على متشابك غير ناضجة من الكسر الفيلوبوديا الدندي الغنية. وهكذا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1.7 ml Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamine	Gibco	2530149
35-mm plastic cell culture dishes	Corning	430165
Anti-actin	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-alpha-Actinin	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-alpha-tubulin	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
BCA protein assay kit	Thermo	23227
Bromophenol blue	Merck	1.08122.0005
calcium chrolide, hydrous	Wako	038-19735
Cell scraper	Falcon	353085
Cell strainer	Falcon	352350
Choline chloride	Sigma-Aldrich	C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel	ATTO	E-T520L
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads	Sperotech	PM-20-10
MEM amino acid solution	Gibco	11130-051	30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system	ATTO	AE-6530
Niacinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilin / Streptomycin	Gibco	15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail	Roche	4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide	Nacali	28360-14
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit wako	Wako	291-5031
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	1703940JA
Ultra pure water	MilliQ		For production of ultra pure water