Очистка дендритной филоподии богатой фракцией

Резюме

В этом протоколе мы внедряем метод очистки дендритной филоподии богатой фракцией от фагоцитарной структуры выступа на культивированных гиппокампальных нейронах, воспользовавшись специфической и сильной близостью между дендритным филоподиалом молекула адгезии, TLCN и внеклеточная матричная молекула, витронектин.

Аннотация

Дендритная филоподия тонкие и длинные выступы на основе нити актина, и они расширяются и убираются, как будто ища целевой аксон. Когда дендритная филоподия устанавливает контакт с аксоном-мишенью, они начинают созревать в шипы, что приводит к образованию синапса. Теленцефин (ТЛКН) обильно локализован в дендритной филоподии и постепенно исключается из шипов. Переэкспрессия TLCN в культивированных гиппокампальных нейронов вызывает дендритное образование филоподии. Мы показали, что теленцефин сильно связывается с внеклеточной молекулой матрицы, витронэктином. Микрошарики с покрытием витронектина индуцированные фагоцитарные чаши на нейрональных дендритов. В фагоцитической чашке, TLCN, TLCN-связывающих белков, таких как фосфорилированный эзрин/ Радисин / Моезин (фосфо-ERM), и F-актин накапливаются, что свидетельствует о том, что компоненты фагоцитарной чашки похожи на дендритный филоподия. Таким образом, мы разработали метод очистки фагоцитарной чашки вместо дендритной филоподии. Магнитные бусы полистирола были покрыты витронектином, который обильно присутствует в культуре среды гиппокампа нейронов и который вызывает формирование фагоцитарной чашки на нейрональных дендритов. После 24 ч инкубации, фагоцитарные чашки были слегка растворимы с моющим средством и собраны с помощью магнитного сепаратора. После мытья бисера, связывающие белки были eluted и проанализированы серебра окрашивания и западного blotting. В связывающей фракции, TLCN и актин были обильно присутствуют. Кроме того, многие белки, идентифицированные из фракции, были локализованы в дендритную филоподию; Таким образом, мы назвали связывающую фракцию дендритной филоподией богатой фракцией. В этой статье описаны детали относительно метода очистки для дендритной фракции, богатой филоподией.

Введение

Дендритная филоподия считается предшественниками шипов. Актиновые нити в дендритной филоподии регулируютих расширение и опрокиды 1,^2,3. После контакта с аксоном, выбранный дендритный филоподия начинает свое созревание в шипы, и синапс образуется^4,5. Компоненты шипов были определены на основе всестороннегоанализа постсинаптических фракций плотности 6,^7,в то время как компоненты дендритной филоподии остаются в значительной степени неизвестными. Было показано, что теленцефин (TLCN), ERM, SynGAP, Рас, PI3 киназы, Akt, mTOR, поло-как киназа 2, CaMKII, синдекан-2, паралемин-1, ARF6, и ЭфБ регулировать дендритное образование филоподии^{5,8,9 ,10,11}, в то время как метод не был разработан для всестороннего анализа молекул, присутствующих в дендритной филоподии.

TLCN (ICAM-5) специально выражается колючими нейронами в самом ростральном сегменте мозга, теленефалионе¹². TLCN имеет 9 Ig-подобных доменов в внеклеточной области, трансмембранной области, и цитоплазмический хвост¹³. TLCN связывается с витронектином (VN) и lfA-1 в его внеклеточной области, пресенилином в трансмембранной области, а также с фосфо-ЭРМ и А-актинином в его цитоплазменской области^{5,8,14,15 ,16}. TLCN связывается с актином цитоскелетом через фосфо-ЭРМ на кончиках дендритной филоподии и актинина в шипах и дендритных валах^8,16.

Мы показали, что переэкспрессия TLCN расширенной дендритной филоподии формирования и индуцированных реверсии шипов к филоподии¹⁰. Консилитативная активная форма эзрина связана с цитоплазменным регионом TLCN и усиленным дендритным образованием филоподия⁸. Таким образом, TLCN регулирует образование дендритного филоподии с помощью актиносвязных белков. Esselens et al. продемонстрировали, что микробусы индуцированные накопления TLCN на культурных нейронах¹⁷. Мы показали, что фагоцитные структуры чашки были сформированы на нейрональных дендритов вокруг VN покрытием микробусы в TLCN-зависимым образом¹⁵. Компоненты дендритной филоподии аналогичны фагоцитарной чашке. Трудно собрать дендритную филоподию, но собрать фагоцитарную чашку с помощью магнитных микробусов относительно легче. Таким образом, мы разработали метод очистки фагоцитарной чашки вместо дендритной филоподии¹⁸. Здесь мы описываем метод очищения дендритной фракции, богатой филоподией.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию RIKEN Wako.

1. Культура Гиппокампальных нейронов

1. Подготовка культуры среды
   1. Приготовление 200-х витаминной смеси. Растворите 100 мг D-пантотеновой кислоты гемикальциевной соли, 100 мг холинового хлорида, 100 мг фолиевой кислоты, 180 мг иинозитол, 100 мг ниацинамида, 100 мг пиридоксала HCl и 100 мг тиамина HCl в 500 мл ультрачистой воды. Раствор не полностью растворяется. Тщательно перемешайте, аликот в 50 мл труб и хранить при -20 градусах Цельсия.
   2. Приготовление раствора рибофлавина. Растворите 100 мг рибофлавина в 500 мл ультрачистой воды с помощью магнитного мешалки. Раствор не полностью растворяется. Тщательно перемешайте, аликот в 50 мл труб и хранить при -20 градусах Цельсия.
   3. Приготовление 1 M CaCl₂. Растворите 7,35 г CaCl₂2H₂O в 50 мл ультрачистой воды с помощью магнитного мешалки.
   4. Подготовка минимальной основной среды (МЭМ). Растворите 400 мг KCl, 6800 мг NaCl, 2200 мг NaHCO₃, 158 мг₂PO₄2H₂O, 7000 мг D-глюкозы и 200 мг MgSO₄-7H₂O в 950 мл ультрачистой воды с помощью магнитного мешалка.
   5. Титрат 1,8 мл 1 M CaCl₂ в МЭМ в падение за падением образом с помощью 1 мл трубки с постоянным возбуждением на магнитном мешалке. Отрегулируйте рН MEM до pH 7.25 с 1 мол/л HCl.
   6. Добавьте в МЭМ 5 мл 200-х витаминных смесей и 200 л раствора рибофлавина. Отрегулируйте объем раствора до 1000 мл с помощью ультрачистой воды. Фильтр решение с помощью 0,22 мкм фильтр системы и хранить его при 4 градусах Цельсия.
   7. Подготовка 10x dNase-I фондовых решений. Растворите 100 мг DNase-I в 12,5 мл сбалансированного соляного раствора Хэнкса (HBSS), процедите фильтр 0,22 мкм, аликвот в трубках 1,5 мл и храните трубки при -20 градусов по Цельсию.
   8. Приготовление цитозиня-D-арабиноураганид (Ara-C) стокового раствора. Растворите 25 мг Ара-С в 8,93 мл ультрачистой воды (окончательная концентрация 10 мМ), процедите через фильтр 0,22 мкм, аликот в трубках 1,5 мл и храните при -20 градусах Цельсия
   9. Подготовка плаксивной среды. Смешайте 1 мл аминокислотного раствора MEM, 750 л из 1 M HEPES, 1 мл B27, 125 л глутамина 200 мм, 250 л пенициллина/стрептомицина, 2,5 мл сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 44,375 м м м м.
   10. Подготовка стоп-среды. Смешайте 1 мл аминокислотного раствора MEM, 750 л из 1 M HEPES, 5 мл FBS (окончательный 10%), и 43,25 мл МЕМ в трубке 50 мл.
2. Приготовление посуды с поли-Л-лизинпокрытием
   1. Пальто 35 мм пластиковых клеточных культур блюд с 0,2 мг/мл поли-L-лизина гидробромид в течение 1 дня при 25 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поли-L-лизина не следует использовать вместо поли-L-лизина гидробромида.
   2. Вымойте посуду с 2 мл ультрачистой воды 3 раза. Инкубировать блюда с 1,5 мл стоп-среды при 25 градусах Цельсия до использования.
3. Рассечение гиппокампа нейронов из эмбриона мыши
   1. Ткань источник гиппокампа нейронов. Вскрыть гиппокампа от дикого типа и TLCN-дефицит C57BL6/J мышей на эмбриональных дней 16-17 в соответствии с методом Лу и др.¹⁹.
   2. Инкубировать расчлененные гиппокампа в 0,25% трипсина и 1x DNaseI в HBSS, содержащий 15 мМ HEPES, рН 7.2 на 15 мин при 37 градусов с возбуждением каждые 3 мин. Удалить раствор. Инкубировать гиппокампа в 10 мл STOP средних инактивировать трипсин при 4 кв КС в течение 5 минут.
   3. Переместите гиппокампа в 10 мл свежей среды STOP и инкубировать на 4 КК в течение 5 мин. Переместить гиппокампа в 10 мл свежей среды STOP и инкубировать на 4 кв. C в течение еще 5 мин. Перемещение бегемота в 900 л STOP среднего и 100 л 10x DNaseI в 15 мЛ трубка. Диссоциатив гиппокампа в изолированных нейронов путем pipetting 20 раз с помощью 1 мл пипетка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик трубы 1 мл слегка касается нижней части трубки 15 мл во время диссоциации гиппокампа.
   4. Добавьте 9 мл покрытия среднего, и фильтр через 70 мкм ячейки ситечко в 50 мл трубки. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоситометра и отрегулируйте до 3,5 х 10⁴ ячеек/мл в среде покрытия.
   5. Аспир СТОП-среда из посуды с поли-Л-лизинпокрытием. Плита клетки на поли-L-лизин покрытием блюда на 7 х 10⁴ ячейки / блюдо (2 мл/ блюдо).
   6. После 60-64 ч инкубации под 5% CO₂ при 37 градусах По Цельсию добавьте 2 qL бульонного раствора Ara-C (окончательный 10 мкм) к нейронам и медленно встряхните блюдо. Храните культурные блюда в увлажненной коробке, не меняя культурную среду под 5% CO₂ при 37 градусах Цельсия.

2. Очищение дендритных Филоподия богатых Фракция

1. После 13 дней in vitro (DIV) добавьте магнитные полистиролные микробусы (3 х 10⁶ частиц/блюдо) к 20 блюдам, содержащим культивированные нейроны. После 1 дня, мыть нейроны в 1 мл PBS с возбуждением 3 раза, чтобы удалить средних и несвязанных микробусов. После удаления PBS, лисизировать нейроны с 500 Л /блюдо из буфера лиза (PBS, содержащий 0,01% Тритон X-100, EDTA-бесплатный коктейль ингибитор протеазы, и фосфатазный ингибитор коктейль).
2. Соберите лизат с помощью клеточного скребока и переместите лизат в низкобелковые микротрубки (10 труб). Установите трубки на магнитный сепаратор и ждите 1 мин. Соберите супернатант и используйте его в качестве несвязанной фракции для окрашивания серебра и анализа западной подрезки.
3. Перенесите бусины в новую низкобелково-связывающую микротрубку, установленную на магнитном сепараторе, и полностью удалите супернатант. Добавьте 500 кл. буфера лисиса и промойте бисер с помощью вихревого смесителя на 15 с. Установите трубку на магнитный сепаратор, подождите 1 минуту, удалите супернатант и добавьте 500 л буфера лисиса. Повторите мытье бисера 10 раз и удалить супернатант.
4. Elute белки связаны с бисером (связанная фракция) путем добавления 50 qL 1x SDS образец буфера (62,5 мм Tris HCl, рН 6,8, 2,5% SDS, и 10% глицерола) и варить трубку при 98 КС в течение 5 мин. Centrifuge трубки на 860 х г для 10 s набор на магнитном сепараторе в течение 1 мин. Соберите супернатант и используйте его в качестве связанной фракции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
5. Измерьте концентрации белка несвязанных и связанных фракций по анализу белка BCA. Визуализируйте белковые растворы с голубым бромофенолом и отрегулируйте концентрацию до 5 нг/Л для SDS-PAGE.

3. Серебряное окрашивание и западный анализ пятна

1. Разделите связанные и несвязанные фракции (50 нг) sDS-PAGE с помощью 5-20% градиентного геля. Серебряно-пятно гель.
2. Западная подьеносец с использованием анти-TLCN-C (1/3,000), анти-бывина витронектин (1/5,000), анти-актин (1/1,000), и анти-я-тубулин (1/1,000) в качестве первичных антител и HRP-конъюгированный козаig IgG (1/5,000). Визуализируйте антигены с помощью хемилюминесцентного западного реагента обнаружения blotting и хемилюминесценции.

Результаты

В культивированных гиппокампе нейронов, TLCN был обильно локализован дендритной филоподии, вала, и сома и colocalized с F-актин(Рисунок 1A, B). Когда полистирол микробусы были добавлены в культивированные гиппокампа нейронов, бисер были автоматически п?...

Обсуждение

Мы разработали метод очистки дендритной фракции, богатой филоподией, используя сродство между молекулой клеточной адгезии TLCN и внеклеточным матричным белками vitronectin. По сравнению с фракцией PSD, можно было бы определить синаптические белки, действующие на незрелый синапс из дендритной ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1.7 ml Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamine	Gibco	2530149
35-mm plastic cell culture dishes	Corning	430165
Anti-actin	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-alpha-Actinin	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-alpha-tubulin	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
BCA protein assay kit	Thermo	23227
Bromophenol blue	Merck	1.08122.0005
calcium chrolide, hydrous	Wako	038-19735
Cell scraper	Falcon	353085
Cell strainer	Falcon	352350
Choline chloride	Sigma-Aldrich	C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel	ATTO	E-T520L
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads	Sperotech	PM-20-10
MEM amino acid solution	Gibco	11130-051	30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system	ATTO	AE-6530
Niacinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilin / Streptomycin	Gibco	15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail	Roche	4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide	Nacali	28360-14
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit wako	Wako	291-5031
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	1703940JA
Ultra pure water	MilliQ		For production of ultra pure water