טיהור של הדנדריטים הדנדריפיאה-חלק עשיר

Summary

בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לטיהור החלק הדנדריטי-עשיר של השבר הדנדריטים של הגביע phagocytic כמו מבנה בליטה על הנוירונים היפוקמאל תרבותי על ידי ניצול הזיקה הספציפית והחזקה בין מחוגה הדנדריטי מולקולת הדבקה, TLCN ומולקולת מטריקס בעלי מטריצה, vitronectin.

Abstract

פילפאות דנדריטי הן בליטות דקות וארוכות המבוססות על הפילטין, והן מרחיבות ומסגת כאילו מחפשים מטרה אקסון. כאשר filפאות הדנדריטים ליצור קשר עם axon היעד, הם מתחילים התבגרות לתוך הקוצים, המוביל היווצרות סינפסה. Telencephalin (TLCN) הוא מקומי בשפע בפילפיאה דנדריטי והוא נשלל בהדרגה מהקוצים. הבעות יתר של TLCN בנוירונים מתורבתים היפוקמאל מעוררת היווצרות הדנדריטים. הצגנו שtelencephalin מאגד בחוזקה למולקולה של מטריקס, ויטרופקטין. ויטרופקטין מצופה בחרוזי מיקרו-חרוזים. שנגרמה כתוצאה מהדנדריטים העצביים בגביע phagocytic, TLCN, טלCN-מחייב חלבונים כגון זרחנת אזרין/Radixin/מוסין (פוספהו-אה), ו-F-actin נצבר, אשר מציע כי מרכיבים של הגביע phagocytic דומים לאלה של פילפיאה הדנדריטי. לכן, פיתחנו שיטה לטיהור הגביע phagocytic במקום filפאות הדנדריטים. חרוזי קלקר מגנטיים היו מצופים vitronectin, אשר בשפע בתווך התרבות של נוירונים היפוקמאל ואשר משרה היווצרות גביע phagocytic על הדנדריטים העצביים. לאחר 24 שעות של דגירה, כוסות phagocytic היו מסיסות במקצת עם חומרי ניקוי ונאסף באמצעות מפריד מגנט. לאחר שטיפת החרוזים, החלבונים המחייבים היו מנותחים ונותחו על ידי כתמים מכסף וכתמים מערביים. בשבר הכריכה, tlcn ו-אקטין היו נוכחים בשפע. בנוסף, חלבונים רבים שזוהו מן השבר היו מותאמים לפילפיאה הדנדריטי; לכן, קראנו את השבר המחייב כמו השבר הדנדריפיאה-עשיר. מאמר זה מתאר פרטים בנוגע לשיטת הטיהור של השבר הדנדריטי-עשיר.

Introduction

פילפיאה דנדריטי נחשבים להיות סמנים מוקדמים של שפני השדרה. שקעים לוויסות השלוחה והנסיגה שלהם^1,2,3. לאחר יצירת קשר עם axon, הדנדריטים הדנדריטי הנבחר להתחיל ההבשלה שלהם לתוך השדרה, ו סינפסה נוצרת^4,5. מרכיבים של שפני השדרה נקבעו מניתוח מקיף של שברים בצפיפות הפוסט-סינפטיות^6,7, בעוד שרכיבים של פילופיאה דנדריטי נשארים לא ידועים. הוכח כי telencephalin (tlcn), אה, סינקופה, ראס, PI3 קינאז, akt, mtor, פולו-כמו קינאז 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, ולהסדיר את המבנה הדנדריטי הדנדריטים⁵,^{8,9 ,10,11}, בעוד שיטה לא פותחה עבור ניתוח מקיף של מולקולות נוכח בפילפיאה הדנדריטי.

TLCN (ICAM-5) מתבטאת במיוחד על ידי נוירונים קוצני בחלק המוח הrostral ביותר, הטלנצאלון¹². TLCN 9 תחומים כמו Ig באזור החילוץ שלה, אזור טרנסקרום, ו cytoplasmic זנב¹³. Tlcn נקשר ל vitronectin (VN) ו-lfa-1 אינטגרציה באזור המוטרתאי שלה, לפרזלין באזור הטרנסג שלה, ולפואהו-אה ולα-אקטין באזור cytoplasmic^{5,8,14,15 ,16}. Tlcn נקשר לשלד ציטוטין באמצעות פוספהו-אה בקצות הפילפיאה הדנדרידיה ובα-אקמין ב שבקוצים ופירים דנדריטים^8,16.

הראנו כי ביטוי יתר של TLCN היווצרות הדנדריטים הדנדריטי משופרת והמושרה גרסה מחודשת של השדרה לפילפיאה¹⁰. הצורה האקטיבית והפעילה של אזרין כרוך באזור cytoplasmic של TLCN ובמערך הדנדריטים הדנדריטי המשופר⁸. לפיכך, TLCN מווסת את היווצרות הדנדריטים הדנדריטי דרך actin-מחייב חלבונים. Esselens ואח ' הפגינו כי מיקרוחרוזים המושרה הצטברות TLCN על נוירונים מתורבתים¹⁷. הצגנו כי מבנים של גביע phagocytic הוקמה על הדנדריטים העצביים סביב מיקרוחרוזי VN מצופה באמצעות TLCN באופן תלוי¹⁵. מרכיבים של פילפיאה דנדריטי דומים לאלה של הגביע phagocytic. קשה לאסוף filפאות הדנדריטים, אבל זה קל יחסית לאסוף את הגביע phagocytic באמצעות מיקרוחרוזי מגנטי. לכן, פיתחנו שיטה כדי לטהר את הגביע phagocytic במקום filפיאה הדנדריטים¹⁸. כאן, אנו מתארים את שיטת הטיהור עבור השבר הדנדריפיאה עשיר.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש של RIKEN Wako.

1. תרבות ההיפוקאמאל הנוירונים

1. הכנת מדיום לתרבות
   1. הכנת מיקס ויטמין 200x. לפזר 100 מ"ג של D-פנטטטום חומצה hemicalcium מלח, 100 mg של כולין כלוריד, 100 mg של חומצה פולית, 180 mg של i-inositol, 100 mg של niacinamide, 100 mg של pyridoxal HCl, ו-100 mg של תיאמין HCl בתוך 500 mL של מים אלקטרופורזה באמצעות מיקרו מגנטי. הפתרון אינו מומס לחלוטין. לערבב בקפידה, סדרת מחלקים ב 50 מ ל צינורות וחנות ב-20 ° c.
   2. הכנת תמיסת הריבופלאווין. מתמוסס 100 מ"ג של ריבופלאווין ב 500 מ ל של מים אלקטרופורזה באמצעות מערבב מגנטי. הפתרון אינו מומס לחלוטין. לערבב בקפידה, סדרת מחלקים ב 50 מ ל צינורות וחנות ב-20 ° c.
   3. הכנה של 1 מ ל₂. מתמוסס 7.35 g של cacl₂· 2h₂O ב 50 מ ל של מים אלקטרופורזה באמצעות מערבב מגנטי.
   4. הכנת מדיום חיוני מינימלי (הגברת). לפזר 400 מ"ג של KCl, 6800 mg של הנאל, 2,200 mg של נחקו₃, 158 mg של נה₂פו₄· 2h₂o, 7000 mg של D-גלוקוז, ו-200 mg של mgso₄-7h₂O ב 950 mL של מים באולטרטהורים באמצעות מערבב מגנטי.
   5. Titrate 1.8 mL של 1 M CaCl₂ ל-הגברת באופן שחרור על ידי שחרור באמצעות 1 mL pipet עם עצבנות מתמדת על מערבב מגנטי. להתאים את ה-pH של הגברת ל-pH 7.25 עם 1 מול/L HCl.
   6. הוסף 5 מ ל של מיקס ויטמין 200x ו-200 μL של פתרון הריבופלאווין ל-הזיכרון. כוונן את נפח הפתרון ל-1,000 mL עם מים באולטרטהורים. סנן את הפתרון באמצעות מערכת מסנני 0.22 יקרומטר ואחסן אותה ב-4 ° c.
   7. הכנת פתרונות מניות 10x DNase-I. התמוססות 100 מ"ג של dnase-I ב 12.5 mL של הנקס ' מאוזנת תמיסת מלח (hbss), לסנן דרך מסנן 0.22 יקרומטר, סדרת מחלקים בצינורות 1.5 mL, ולאחסן את הצינורות ב-20 ° c.
   8. הכנת ציטוסינוס β-D-arabinofuranoside (Ara-C) פתרון מניות. התמוססות 25 מ ג של Ara-C ב 8.93 מ ל של מים אלקטרופורזה (הריכוז הסופי של 10 מ"מ), לסנן דרך מסנן 0.22 יקרומטר, סדרת מחלקים ב 1.5 mL וחנות ב-20 ° c
   9. הכנת מדיום לציפוי. מערבבים 1 מ ל של הפתרון חומצה אמינית, 750 μL של 1 M HEPES, 1 מ ל של B27, 125 μL של 200 mM גלוטמין, 250 μL של פניצילין/סטרפטומיצין, 2.5 mL של סרום של שור העוברי (FBS), ו 44.375 mL של הגברת בתוך 50 mL שפופרת.
   10. הכנת מדיום Stop. מערבבים 1 מ ל הפתרון חומצה אמינית, 750 μL של 1 מ' HEPES, 5 מ ל של FBS (הסופי 10%), ו 43.25 mL של הגברת בצינור ה50 mL.
2. הכנת מנות פולי-ל-ליזין מצופות
   1. מעיל 35 מ"מ מנות מפלסטיק בשילוב של מאכלים עם 0.2 mg/mL של פולי-ל-ליזין הידרוברומיד ליום אחד ב -25 ° c.
      הערה: אין להשתמש בפולי-L-ליזין במקום ב-פולי-ליזין הידרורומיד.
   2. רוחצים את הכלים עם 2 מ ל של מים באולטרסאונד 3 פעמים. מודיית את הכלים עם 1.5 mL של מדיום Stop ב -25 ° צ' עד השימוש.
3. חיתוך נוירונים היפוקמאל מתוך העובר העכבר
   1. מקור הרקמה של נוירונים. בהיפוקמאל לנתח את ההיפוקמפוס מן פראי סוג ו TLCN-C57BL6/J עכברים בימים עובריים 16-17 על פי שיטת Lu et al.¹⁹.
   2. דגירה של היפוקמאני ב 0.25% טריפסין ו 1x DNaseI ב HBSS המכיל 15 מ"מ HEPES, pH 7.2 עבור 15 דקות ב 37 ° צ' עם עצבנות כל 3 דקות. הסר את הפתרון. מודחלת ההיפוקמאני ב 10 מ ל של מדיום STOP כדי להשבית טריפסין ב 4 ° צ' עבור 5 דקות.
   3. להעביר את ההיפוקמאני לתוך 10 מ ל של מדיום להפסיק טריים ו-דגירה ב 4 ° c עבור 5 דקות. להעביר את ההיפוקמאני לתוך 10 ml של מדיום להפסיק טרי ו-דגירה ב 4 ° c עבור עוד 5 דקות. להעביר את ההיפוקמאני לתוך 900 μl של מדיום stop ו 100 μl של 10 . שפופרת ממ הנתק את ההיפוקמאני לתוך נוירונים מבודדים על ידי ליטוף 20 פעמים באמצעות 1 mL pipetting.
      הערה: הקצה של 1 מ ל pipet במקצת נוגע בתחתית של 15 מ"ל צינור במהלך הדיסוציאציה של היפוקמאני.
   4. הוסף 9 מ ל של ציפוי בינונית, ולסנן דרך מסננת תא 70 יקרומטר לתוך צינור 50 mL. לספור את מספר התאים באמצעות הטציטוטומטר ולהתאים 3.5 x 10⁴ תאים/mL ב ציפוי בינוני.
   5. שאיפה לעצור מנות מצופות פולי L-ליזין. לוחית התאים על מנות פולי-L-ליזין מצופות 7 x 10⁴ תאים/צלחת (2 מ ל/מנה).
   6. לאחר 60-64 h של דגירה תחת 5% CO₂ ב 37 ° c, להוסיף 2 μl של פתרון מלאי Ara-C (הסופי 10 μm) אל הנוירונים, ולנער את התבשיל לאט. השאר את מנות התרבות בקופסא לחות מבלי לשנות את מדיום התרבות תחת 5% CO₂ ב 37 ° c.

2. טיהור הדנדריטים הדנדריפיאה-שבר עשיר

1. לאחר 13 ימים בתוך מבחנה (DIV), להוסיף מיקרוחרוזי פוליסטירן מגנטיים (3 x 10⁶ חלקיקים/צלחת) כדי 20 מנות המכילות נוירונים תרבותי. לאחר יום אחד, לשטוף את הנוירונים ב 1 מ ל של PBS עם עצבנות 3 פעמים כדי להסיר את המיקרוחרוזים בינונית ולא מאוגד. לאחר הסרת PBS, lyse הנוירונים עם 500 μL/צלחת של מאגר לפירוק (PBS המכיל 0.01% טריטון X-100, EDTA-חינם מעכב פרוטאז קוקטייל, ו פוספספטאז קוקטייל מעכבי).
2. לאסוף את הליפוסט עם מגרד התא ולהעביר את ליפוסט לחלבון נמוך מחייב מיקרוצינורות (10 שפופרות). הגדר את הצינורות על מפריד מגנט ולחכות 1 דקות. לאסוף את supernatant ולהשתמש בו כשבר לא מאוגד עבור כתמי כסף וניתוח כתמים מערבי.
3. העבר את החרוזים למיקרו-צינורית נמוך-חלבון חדש, שנקבע על מפריד מגנטי, והסר לחלוטין את הסופרנטאנט. הוסף 500 μL של מאגר הליזה ושטוף את החרוזים באמצעות מערבל מערבולת עבור 15 s. הגדר את הצינור על מפריד מגנט, לחכות 1 דקות, להסיר את supernatant, ולהוסיף 500 μL של מאגר הליזה. חזרו על נטילת החרוזים 10 פעמים והסירו את הסופרנטאנט.
4. חלבונים elute הקשורים החרוזים (השבר המאוגד) על ידי תוספת של 50 μL של 1x SDS מאגר לדוגמה (62.5 mM טריס HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, ו 10% גליצרול) ו להרתיח את הצינור ב-98 c במשך 5 דקות ולהגדיר את הצינור על מפריד מגנטי במשך 1 דקות. אסוף את הסופרנטנט והשתמש בו כשבר מאוגד.
   הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
5. מדידת ריכוזי חלבון של שברים לא מאוגדים ומאוגדים על ידי שיטת החלבון BCA. המחש פתרונות חלבונים עם כחול ברומרופנול והתאם את הריכוז ל-5 ng/μL עבור SDS-PAGE.

3. כתמי כסף וניתוח כתמים מערביים

1. הפרד בין השברים המאוגדים והלא מאוגדים (50 ng) ב-SDS-PAGE באמצעות ג'ל מעבר צבע של 5-20%. . כתמי כסף את הג'ל
2. כתם מערבי באמצעות anti-TLCN-C (1/3000), אנטי השור ויטרונטין (1/5000), נגד actin (1/1000), ו anti-α-טובולין (1/1000) כמו נוגדנים הראשי ו HRP מצוח עז הפנים נגד ארנב IgG (1/5000) כמו הנוגדן המשני. המחש את האנטיגנים באמצעות כימוע מערבי לזיהוי מגיב ומיגראומיאנריבורגר.

תוצאות

ב מתורבת נוירונים היפוקמאל, TLCN היה מקומי בשפע לפילפיאה הדנדריטי, פיר, ואת הסומה ואת מקומי עם F-actin (איור 1A, B). כאשר מיקרוחרוזי פוליסטירן התווספו לנוירונים מתורבתים, החרוזים היו מצופים באופן אוטומטי עם vitronectin (VN) נגזר סרום שור עוברי (FBS) במדיום התרבות; ...

Discussion

פיתחנו שיטת טיהור עבור השבר הדנדריטים הדנדריפיאה-עשיר באמצעות זיקה בין מולקולת תא הדבקה TLCN לבין מטריקס חלבון מטריצה vitronectin. בהשוואה לשבר PSD, זה יכול להיות אפשרי כדי לזהות את החלבונים סינפטיות פועל על הסינפסה בלתי בוגר מן השבר הדנדריטי-עשיר. לפיכך, המרכיבים של השבר הדנדריטי-עשיר, שונים מאלה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1.7 ml Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamine	Gibco	2530149
35-mm plastic cell culture dishes	Corning	430165
Anti-actin	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-alpha-Actinin	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-alpha-tubulin	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
BCA protein assay kit	Thermo	23227
Bromophenol blue	Merck	1.08122.0005
calcium chrolide, hydrous	Wako	038-19735
Cell scraper	Falcon	353085
Cell strainer	Falcon	352350
Choline chloride	Sigma-Aldrich	C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel	ATTO	E-T520L
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads	Sperotech	PM-20-10
MEM amino acid solution	Gibco	11130-051	30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system	ATTO	AE-6530
Niacinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilin / Streptomycin	Gibco	15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail	Roche	4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide	Nacali	28360-14
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit wako	Wako	291-5031
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	1703940JA
Ultra pure water	MilliQ		For production of ultra pure water