Purificazione della Frazione ricca di Filopodia Dendritica

Riepilogo

In questo protocollo, introduciamo un metodo per purificare la frazione dendritica ricca di filopodia dalla struttura di protrusione simile a una coppa fagocitica sui neuroni ippocampali coltivati sfruttando l'affinità specifica e forte tra un filopopodiale dendritico molecola di adesione, TLCN, e una molecola di matrice extracellulare, vitronectina.

Abstract

I filodidi dendrici sono sporche sottili e lunghe basate sul filamento di actin, e si estendono e si ritraggono come se cercassero un assone bersaglio. Quando la filopodia dendritica stabilisce il contatto con un assone bersaglio, iniziano a maturare in spine, portando alla formazione di una sinapsi. La telencefine (TLCN) è abbondantemente localizzata nella filopodia dendritica ed è gradualmente esclusa dalle spine. La sovraespressione del TLCN nei neuroni ippocampali coltivati induce la formazione di filopodia dendritica. Abbiamo dimostrato che la telencefine si lega fortemente a una molecola di matrice extracellulare, la vitronectina. Le microsfere rivestite di cellavanguardia in vitronectine hanno indotto la formazione di coppe fagocitiche sui dendriti neuronali. Nella tazza fagocitica, si accumulano proteine che legano il TLCN, come Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), e F-actin, il che suggerisce che i componenti della coppa fagocitica sono simili a quelli della filodia dendritica. Così, abbiamo sviluppato un metodo per purificare la coppa fagocitica invece di filopodi a dendritica. Le perle di polistirene magnetico sono state rivestite con vitronectina, che è abbondantemente presente nel mezzo di coltura dei neuroni ippocampali e che induce la formazione di coppe fagocitiche sui dendriti neuronali. Dopo 24 h di incubazione, le tazze fagocitiche erano leggermente solubili con detergente e raccolte utilizzando un separatore magnete. Dopo aver lavato le perline, le proteine leganti sono state eluite e analizzate dalla colorazione d'argento e dalla gonfiore occidentale. Nella frazione vincolante, TLCN e actin erano abbondantemente presenti. Inoltre, molte proteine identificate dalla frazione sono state localizzate alla filopodica dendritica; così, abbiamo chiamato la frazione di legame come la frazione dendritica ricca di filopodia. Questo articolo descrive i dettagli relativi al metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia.

Introduzione

Si pensa che la filopodi dendritica sia precursore delle spine. I filamenti di Actin nella filopodi adendriticane regolano l'estensione e la retrazione 1,^2,3. Dopo aver contattato un assone, la filopodia dendritica selezionata inizia la loro maturazione in spine, e si forma una sinapsi^4,5. I componenti delle spine sono stati determinati dall'analisi completa delle frazioni di densità postsinaptica^6,7, mentre i componenti della filopodia dendritica rimangono in gran parte sconosciuti. È stato dimostrato che telencephalin (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 kinase, Akt, mTOR, polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, e EphB regolano la formazione di filopodi dendritici^{5,8,9 ,10,11}, mentre un metodo non è stato sviluppato per l'analisi completa delle molecole presenti nella filopodia dendritica.

TLCN (ICAM-5) è specificamente espresso dai neuroni spinosi nel segmento cerebrale più rostrale, il telencephalon¹². TLCN ha 9 domini simili a Ig nella sua regione extracellulare, una regione transmembrana e una coda citoplasmica¹³. TLCN si lega alla vitronectina (VN) e all'integrina LFA-1 nella sua regione extracellulare, alla presenilina nella sua regione transmembrana, e alla fosfora-ERM e alla z-actinina nella sua regione citoplasmica^{5,8,14,15 ,16}. TLCN si lega al citoscheletro dell'actina attraverso il fosforo-ERM su punta di filopodia dendritica e di z-actininina nelle spine e negli alberi dendritici^8,16.

Abbiamo dimostrato che la sovraespressione del TLCN ha migliorato la formazione di filopodi a dendritici e ha indotto la reversione delle spine alla filopodia¹⁰. La forma attiva costituiscista di ezrin legata alla regione citoplasmica TLCN e la formazione di filopodia dendritica migliorata⁸. Così, TLCN regola la formazione di filopodi dendritici attraverso proteine che legano l'atto. Esselens et al. ha dimostrato che le microsfere hanno indotto l'accumulo di TLCN sui neuroni coltivati¹⁷. Abbiamo dimostrato che le strutture della coppa fagocitica si sono formate sui dendriti neuronali intorno alle microsfere rivestite di VN in modo dipendente dalla TLCN¹⁵. Costituenti di filopodi dendritici sono simili a quelli della coppa fagocitica. È difficile raccogliere la filopodi dendritica, ma è relativamente più facile raccogliere la coppa fagocitica utilizzando microsfere magnetiche. Così, abbiamo sviluppato un metodo per purificare la coppa fagocitica invece di filopodia dendritica¹⁸. Qui, descriviamo il metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di RIKEN Wako.

1. Cultura dei neuroni ippocampali

1. Preparazione del mezzo culturale
   1. Preparazione del mix di vitamine 200x. Sciogliere 100 mg di sale di emicalcio acido Pantotenico, 100 mg di cloruro di colina, 100 mg di acido folico, 180 mg di i-inositolo, 100 mg di niacinamide, 100 mg di HCl piruridossiale e 100 mg di tiamina HCl in 500 mL di acqua ultrapura. La soluzione non è completamente dissolta. Mescolare con cura, aliquota in tubi da 50 mL e conservare a -20 gradi centigradi.
   2. Preparazione della soluzione Riboflavin. Sciogliere 100 mg di Riboflavin in 500 mL di acqua ultrapura utilizzando un mescolatore magnetico. La soluzione non è completamente dissolta. Mescolare con cura, aliquota in tubi da 50 mL e conservare a -20 gradi centigradi.
   3. Preparazione di 1 M CaCl₂. Sciogliere 7,35 g di CaCl₂x 2H₂O in 50 mL di acqua ultrapura utilizzando un agitatore magnetico.
   4. Preparazione del mezzo essenziale minimo (MEM). Sciogliere 400 mg di KCl, 6800 mg di NaCl, 2.200 mg di NaHCO₃, 158 mg di NaH₂PO₄a 2H₂O, 7000 mg di D-glucosio, e 200 mg di MgSO₄-7H₂O in 950 mL di acqua ultrapura utilizzando uno stirrer magnetico.
   5. Titralata 1,8 mL di 1 M CaCl₂ al MEM in modo gocciolamento utilizzando un pipet da 1 mL con un'agitazione costante su un agitatore magnetico. Regolare il pH del MEM su pH 7.25 con 1 mol/L HCl.
   6. Aggiungere al MEM 5 mL di miscela di vitamina 200x e 200 l di riboflavina. Regolare il volume della soluzione a 1.000 mL con acqua ultrapura. Filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtro da 0,22 m e conservarla a 4 gradi centigradi.
   7. Preparazione di 10x soluzioni stock DNase-I. Sciogliere 100 mg di DNase-I in 12,5 mL di soluzione di sale equilibrato di Hanks ', filtrare attraverso un filtro aliquota 0,22 m, in tubi da 1,5 mL, e conservare i tubi a -20 .
   8. Preparazione della soluzione di stock di citosina a z-D-arabinofuranoside (Ara-C). Sciogliere 25 mg di Ara-C in 8,93 mL di acqua ultrapura (concentrazione finale di 10 mM), filtrare attraverso un filtro da 0,22 m, in tubi da 1,5 mL e conservarlo a -20 gradi centigradi
   9. Preparazione del mezzo di placcatura. Mescolare 1 mL di soluzione aminoacide MEM, 750 -L di 1 M HEPES, 1 mL di B27, 125 L di 200 mM di glutammina, 250 mL di penicillina/streptomicina, 2,5 mL di siero bovino fetale (FBS) e 44,375 mL di MEM in un tubo da 50 mL.
   10. Preparazione del mezzo di arresto. Mescolare 1 mL di soluzione aminoacido MEM, 750 -L di 1 M HEPES, 5 mL di FBS (finale 10%) e 43,25 mL di MEM in un tubo da 50 mL.
2. Preparazione di piatti poli-L-Lysine
   1. Piatto di coltura di cellule plastiche da 35 mm con 0,2 mg/mL di idrobromofo poli-L-lisina per 1 giorno a 25 gradi centigradi.
      NOT: Poly-L-lysina non deve essere utilizzato al posto dell'idrobromofopoli poli-L-lisina.
   2. Lavare i piatti con 2 mL di acqua ultrapura 3 volte. Incubare i piatti con 1,5 mL di stop medio a 25 gradi centigradi fino all'uso.
3. Dissezione dei neuroni ippocampali dall'embrione di topo
   1. Fonte tissutale di neuroni ippocampali. Dissecitare l'ippocampo da topi C57BL6/J carenti di tipo selvaggio e TLCN nei giorni embrionali 16-17 secondo il metodo di Lu et al.¹⁹.
   2. Incubato sezionato ippocampi in 0.25% trypsin e 1x DNaseI in HBSS contenente 15 mHe, pH 7.2 per 15 min a 37 s con agitazione ogni 3 min. Rimuovere la soluzione. Incubare gli ippocampi in 10 mL di STOP medio per inattivare la trypsin a 4 gradi centigradi per 5 minuti.
   3. Spostare gli ippocampi in 10 mL di fresco DI STOP medio e incubare a 4 gradi C per 5 min. Spostare l'ippocampo in 10 mL di fresco di medio STOP fresco e incubare a 4 gradi centigradi per altri 5 min. tubo mL. Dissociare gli ippocampi in neuroni isolati pipettando 20 volte usando un pipet da 1 mL.
      NOT: La punta del tubo da 1 mL tocca leggermente il fondo del tubo da 15 mL durante la dissociazione degli ippocampi.
   4. Aggiungere 9 mL di mezzo di placcatura e filtrare attraverso un colino da 70 m in un tubo da 50 mL. Contare il numero di celle utilizzando un emocitometro e regolare a 3,5 x 10⁴ celle / mL nel mezzo di placcatura.
   5. Mezzo ASpirato STOP da piatti poli-L-lisini. Placcare le cellule su piatti poli-L-Lisini rivestiti a 7 x 10⁴ celle/piatto (2 mL/piatto).
   6. Dopo 60-64 h di incubazione al di sotto del 5% di CO₂ a 37 gradi centigradi, aggiungere 2 -L di soluzione di ara-C ai neuroni e scuotere il piatto lentamente. Conservare i piatti della coltura in una scatola umidizzata senza cambiare il mezzo di coltura sotto il 5% di CO₂ a 37 gradi centigradi.

2. Purificazione della Frazione dendritica ricca di filopodia

1. Dopo 13 giorni in vitro (DIV), aggiungere microsfere magnetiche in polistirolo (3 x 10⁶ particelle/piatto) a 20 piatti contenenti i neuroni coltivati. Dopo 1 giorno, lavare i neuroni in 1 mL di PBS con agitazione 3 volte per rimuovere le microsfere medie e non associate. Dopo aver rimosso PBS, decisi i neuroni con 500 s/piatto di tampone di lisi (PBS contenente 0,01% Triton X-100, cocktail inibitore della proteasi senza EDTA e cocktail inibitore della fosfosi).
2. Raccogliere il lisato con un raschietto cellulare e spostare il lisato a microtubi a basso legame proteico (10 tubi). Impostare i tubi su un separatore magnete e attendere 1 min. Raccogliere il supernatante e usarlo come la frazione non associata per la colorazione d'argento e l'analisi macchia occidentale.
3. Trasferire le perline in un nuovo microtubo a basso legame proteico, impostato su un separatore magnetico e rimuovere completamente il supernatante. Aggiungere 500 l di lisi tampone e lavare le perline utilizzando un mixer vortice per 15 s. Impostare il tubo su un separatore magnete, attendere 1 min, rimuovere il supernatante, e aggiungere 500 L di tampone di lisi. Ripetere il lavaggio delle perline 10 volte e rimuovere il supernatante.
4. Elute proteine legate alle perline (la frazione vincolata) con l'aggiunta di 50 - L di 1x buffer campione SDS (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS, e 10% glicerolo) e far bollire il tubo a 98 gradi centigradi per 5 min. Centrifugare il tubo a 860 x g per 10 s e il tubo impostare il tubo su un separatore magnetico per 1 min. Raccogliere il supernatante e usarlo come frazione legata.
   NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
5. Misurare le concentrazioni proteiche delle frazioni non legate e legate dal saggio della proteina BCA. Visualizza le soluzioni proteiche con il blu bromofenolo e regola la concentrazione a 5 ng/L per SDS-PAGE.

3. Colorazione d'argento e analisi blot occidentale

1. Separare le frazioni associate e non associate (50 ng) da SDS-PAGE utilizzando un gel sfumato 5-20%. Macchia d'argento il gel.
2. Blot occidentale con anti-TLCN-C (1/3,000), vitronectina anti-bovina (1/5,000), anti-actina (1/1,000) e anti-tubulina anti-thapoling (1/5,000) come anticorpi primari e HRP-congioso anti-coniglio IgG (1/5.000) come anticorpo secondario. Visualizza gli antigeni usando il reagente di rilevamento del rilevamento del bloting occidentale chemiluminescente e un imager chemiluminescenza.

Risultati

Nei neuroni ippocampali coltivati, TLCN è stato abbondantemente localizzato alla filopodia dendritica, albero, e soma e colocalizzato con F-actin (Figura 1A, B). Quando le microsfere di polistirolo sono state aggiunte ai neuroni ippocampali coltivati, le perline sono state automaticamente rivestite con vitronectina (VN) derivata dal siero bovino fetale (FBS) nel mezzo di coltura; erano principalmente legati ai dendriti, e indotto la formazio...

Discussione

Abbiamo sviluppato un metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia utilizzando affinità tra la molecola di adesione cellulare TLCN e la proteina matrice extracellulare vitronectina. Rispetto alla frazione PSD, potrebbe essere possibile identificare le proteine sinaptiche che agiscono sulla sinapsi immatura dalla frazione dendritica ricca di filopodia. Così, i costituenti della frazione dendritica ricca di filopodia sono diversi da quelli della frazione PSD del 74%. A differenza della frazione P...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1.7 mLl Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamine	Gibco	2530149
35 mm plastic cell culture dishes	Corning	430165
Anti-actin	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-alpha-Actinin	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-alpha-tubulin	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
BCA protein assay kit	Thermo	23227
Bromophenol blue	Merck	1.08122.0005
Calcium chrolide, hydrous	Wako	038-19735
Cell scraper	Falcon	353085
Cell strainer	Falcon	352350
Choline chloride	Sigma-Aldrich	C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel	ATTO	E-T520L
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads	Sperotech	PM-20-10
MEM amino acid solution	Gibco	11130-051	30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system	ATTO	AE-6530
Niacinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilin / Streptomycin	Gibco	15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail	Roche	4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide	Nacali	28360-14
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit wako	Wako	291-5031
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	1703940JA
Ultra pure water	MilliQ		For production of ultra pure water