樹状フィロポディアリッチ画の精製

要約

このプロトコルでは、樹状性フィロポジア間の特異的かつ強い親和性を利用して、培養海馬ニューロン上の食中毒カップ様突起構造から樹状フィロポジアが豊富な画分を精製する方法を紹介する。接着分子、TLCN、および細胞外マトリックス分子、ビトロネクチン。

要約

樹状フィロポディアは、アクチンフィラメントに基づいて薄く長い突起であり、それらは、ターゲット軸を検索するかのように拡張し、後退します。樹状フィロポディアが標的軸線との接触を確立すると、それらは脊椎に成熟し始め、シナプスの形成につながる。テレンセファリン(TLCN)は樹状フィロポディアに豊富に局在し、徐々に脊椎から除外される。培養海馬ニューロンにおけるTLCNの過剰発現は、樹状性フィロポディア形成を誘導する。我々は、テレスファリンが細胞外マトリックス分子、ビトロネクチンに強く結合することを示した。ビトロネクチンコーティングマイクロビーズは、神経デンドライト上の食器細胞性カップ形成を誘発した。食細胞カップでは、TLCN、リン酸化エズリン/ラジキシン/モエシン(ホスホ-ERM)、F-アクチンなどのTLCN結合タンパク質が蓄積され、食中毒カップの成分が樹状フィロポディアのものと類似していることを示唆している。そこで、樹状フィロポディアの代わりに食細胞性カップを精製する方法を開発した。磁気ポリスチレンビーズは、海馬ニューロンの培養培地に豊富に存在し、神経デンドライト上の食細胞性カップ形成を誘導するビトロネクチンでコーティングされた。インキュベーションの24時間後、ファゴサイトカップを洗剤で軽度に可溶化し、磁石セパレータを用いて回収した。ビーズを洗浄した後、結合タンパク質をタンパク質をタンパク質をタンパク質をタンパク質でタンパク質にして、銀染色およびウェスタンブロッティングにより分析した。結合画分では、TLCNおよびアクチンが豊富に存在していた。さらに、画分から同定された多くのタンパク質は樹状フィロポディアに局在した。したがって、結合分数を樹状フィロポディアリッチ画として命名した。この記事では、樹状フィロポディアリッチ画の精製方法に関する詳細について説明します。

概要

樹状フィロポディアは脊椎の前駆体であると考えられている。樹状フィロポディアのアクチンフィラメントは、その延長と引き込みを^調節する1,^2,3.軸と接触した後、選択された樹状フィロポディアは脊椎に成熟を開始し、シナプスが^{形成され、4、5.}脊椎の成分は、樹状密度画率6、7の包括的な分析から決定されたが、樹状フィロポディアの成分はほとんど知られていない。テレスファリン(TLCN)、ERM、SynGAP、Ras、PI3キナーゼ、Akt、mTOR、ポロ様キナーゼ2、CaMKII、シンデカン-2、パラレミン-1、ARF6、およびEphBBがデンドリックフィロポダイヤ形成5、8、9を調節することが示されている。 ^,10,11, 樹状フィロポディアに存在する分子の包括的な分析のための方法が開発されていない間.

TLCN(ICAM-5)は、最もrostral脳セグメントにおける脊椎ニューロンによって特異的に発現され、テレスファ^ロン12である。TLCNは、その細胞外領域に9つのIg様ドメイン、膜領域、および細胞質^尾13を有する。TLCNは、その細胞外領域におけるビトロネクチン(VN)およびLFA-1インテグリンに結合し、その膜領域におけるプレセニリンに、そして細胞質領域5、8、14、15におけるホスホ-ERMおよびα-アクチニンに結合する。 ^、16.TLCNは、脊椎および樹状シャフト8、16の樹状フィロポディアおよびα-アクチニンの先端にリン-ERMを介してアクチン細胞骨格に結合する。

我々は、TLCNの過剰発現が樹状フィロポディア形成を増強し、フィロポ^ディア10への脊椎の復帰を誘導することを示した。TLCN細胞質領域に結合したエズリンの構成活性形態と高められた樹状フィロポディア形成8.したがって、TLCNは、アクチン結合タンパク質を介して樹状フィロポディア形成を調節する。Esselensらは、マイクロビーズが培養^{ニューロン17}にTLCN蓄積を誘導することを実証した。我々は、TNコーティングされたマイクロビーズの周りの神経デンドライト上に、TLCN依存的な方法15で食細胞性カップ構造が形成されることを示した。樹状フィロポディアの成分は、食中毒カップのものと類似しています。樹状フィロポディアを採取することは困難ですが、磁気マイクロビーズを使用して食中毒カップを収集することは比較的容易です。そこで、樹状フィロポ^ディア18の代わりに食細胞性カップを精製する方法を開発した。ここでは、樹状フィロポディアが豊富な画分の精製方法について説明する。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、理化学研究所和光の施設動物管理・使用委員会によって承認されています。

1. 海馬ニューロンの培養

1. 培養培地の調製
   1. 200倍のビタミンミックスの調製。Dパントテイン酸ヘミカルシウム塩の100mg、塩化コリン100mg、葉酸100mg、イノシトール180mg、ナイアシンアミド100mg、ピリドキサルHCl100mg、500mLのチアミンHClを100mgの磁性を使用して溶解する。溶液が完全に溶解するわけではありません。慎重に混合し、50 mLチューブでアリコートし、-20 °Cで保存します。
   2. リボフラビン溶液の調製。磁気攪拌機を用いて500mLの超純水にリボフラビン100mgを溶解する。溶液が完全に溶解するわけではありません。慎重に混合し、50 mLチューブでアリコートし、-20 °Cで保存します。
   3. 1 M CaCl₂の準備 .磁気攪拌機を用いて50mLの超純水にCaCl2・2H2 Oの7.35gを溶解する。
   4. 最小必須培地(MEM)の調製。KClの400mg、NaClの6800mg、NaHCO₃の2,200mg、NaH2 PO_4~2H2Oの158mg、D-グルコースの7000mg、および950mLの超純水のMgSO4-7H₂Oを950mLの超純水で溶解する。
   5. 磁気撹拌機に一定の攪拌を伴う1mLピペを用いて、1M CaCl2の1.8mLをMEMに滴下方法で滴下する。MEMのpHを1モル/L HClでpH 7.25に調整します。
   6. MEMに200倍のビタミンミックスの5 mLとリボフラビン溶液の200 μLを追加します。溶液の体積を超純水で1,000mLに調整します。0.22 μmフィルターシステムを使用して溶液をろ過し、4°Cに保存します。
   7. 10倍DNase-Iストックソリューションの準備。ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)の12.5 mLでDNase-Iの100mgを溶解し、0.22 μmフィルターを通して濾過し、1.5 mLチューブでアリコートし、-20°Cでチューブを保存します。
   8. シトシンβ-D-アラビノフラノシド(Ara-C)ストック溶液の調製。8.93 mLの超純水(最終濃度10mM)でAra-Cの25mgを溶解し、0.22 μmフィルターを通して濾過し、1.5mLチューブにアリコートを入れ、-20°Cで保存
   9. めっき媒体の調製。MEMアミノ酸溶液の1mL、1M HEPESの750 μL、B27の1mL、200mMグルタミンの125μL、ペニシリン/ストレプトマイシンの250μL、2.5mLの胎児ウシ血清(FBS)、および44.375 mLのMELチューブを混合する。
   10. ストップ培地の調製。MEMアミノ酸溶液1mL、1M HEPESの750 μL、FBSの5mL(最終10%)、および50mLチューブにMEMの43.25 mLを混合します。
2. ポリL-リジンコーティングされた料理の調製
   1. ポリL-リジンヒドロブロマイドの0.2 mg/mLで35mmプラスチック細胞培養皿を25°Cで1日塗ります。
      注:ポリ-L-リジンは、ポリ-L-リジンヒドロブロミドの代わりに使用しないでください。
   2. 2mLの超純水で3回洗います。使用するまで25°Cでストップ媒体の1.5 mLで皿をインキュベートします。
3. マウス胚からの海馬ニューロンの解剖
   1. 海馬ニューロンの組織源。Lu et al.¹⁹の方法に従って、胚性16-17日目に野生型およびTLCN欠損C57BL6/Jマウスから海馬を解剖する。
   2. 15 mM HEPESを含むHBSSで0.25%トリプシンと1x DNaseIで解剖した海馬を3分毎に攪拌して37°Cで15分間pH 7.2を加分し、溶液を取り除きます。10mLのSTOP培地で海馬をインキュベートし、4°Cでトリプシンを5分間不活性化させる。
   3. 海馬を新鮮なSTOP培地の10mLに移動し、4°Cでインキュベートし、新鮮なSTOP培地の10 mLに移動し、さらに5分間4°Cでインキュベートする。mLチューブ。1 mLピペを使用して20回ピペッティングすることにより、海馬を単離ニューロンに解離する。
      注:1 mLピペットの先端は、海馬の解離中に15 mLチューブの底部にわずかに触れます。
   4. めっき媒体の9 mLを追加し、50 mLチューブに70 μmセルストレーナーを通してフィルタリングします。ヘモサイトメーターを使用して細胞数を数え、めっき培地で3.5 x 10⁴セル/mLに調整します。
   5. ポリL-リジンコーティングされた料理からSTOP培地を吸引。ポリL-リジンコーティングされた皿に7 x 10⁴セル/皿(2 mL/皿)でセルをプレートします。
   6. 37°Cで5%CO2以下のインキュベーションを60〜64時間後、ニューロンにAra-Cストック溶液(最終10μM)の2μLを加え、ゆっくりと皿を振ります。培養物は、培養物を5%CO2以下の37°Cで変えずに加湿箱に入れたままにしておきます。

2. 樹状性フィロポディアリッチ画分の精製

1. インビトロ(DIV)で13日後、培養ニューロンを含む20皿に磁気ポリスチレンマイクロビーズ(3 x 10⁶粒子/皿)を添加する。1日後、培地および非結合マイクロビーズを除去するために攪拌3回でPBSの1 mLでニューロンを洗浄する。PBSを除去した後、500 μL/皿のライシスバッファー(0.01%トリトンX-100、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤カクテルを含むPBS)でニューロンをlyseします。
2. 細胞スクレーパーでライサートを収集し、低タンパク質結合マイクロチューブ(10チューブ)にリザートを移動します。磁石セパレータにチューブをセットし、1分間待って上清を収集し、銀染色とウェスタンブロット分析のための非結合分画として使用します。
3. ビーズを新しい低タンパク質結合マイクロチューブに移し、磁気セパレータにセットし、上清を完全に除去する。500 μLのリシスバッファーを追加し、15 s. 磁石セパレータにチューブを設定し、1分間待って、上清を取り除き、500 μLのリシスバッファーを追加します。ビーズの洗浄を10回繰り返し、上清を取り除きます。
4. ビーズに結合した溶質タンパク質(結合分画)を1x SDSサンプルバッファー(62.5 mMトリスHCl、pH 6.8、2.5%SDS、および10%グリセロール)の50 μLを添加し、チューブを98°Cで5分間沸騰させ、チューブを860 x gで10°sに設定し、チューブを860 x gで沸騰させます。1分間の磁気セパレータ上に上清を収集し、結合分数として使用します。
   注:プロトコルはここで一時停止できます。
5. BCAタンパク質アッセイによる非結合分画および結合画分のタンパク質濃度を測定します。ブロモフェノールブルーでタンパク質溶液を可視化し、SDS-PAGEの濃度を5ng/μLに調整します。

3. 銀染色とウェスタンブロット分析

1. 5~20%のグラデーションゲルを使用して、SDS-PAGEでバインド分数と非連結分数(50ng)を分離します。ゲルを銀染色します。
2. 抗TLCN-C(1/3,000)、抗ウシビトロネクチン(1/5,000)、抗アクチン(1/1,000)、抗αチューブリン(1/1,000)を一次抗体として使用し、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG(1/500)を用いたウェスタンブロット。化学発光ウエスタンブロッティング検出試薬と化学発光イメージャーを用いて抗原を可視化する。

結果

培養海馬ニューロンにおいて、TLCNは樹状フィロポディア、シャフト、およびソマに豊富に局在し、F-アクチンと共局所化した(図1A、B)。培養海馬ニューロンにポリスチレンマイクロビーズを添加すると、ビーズは培養培地中の胎児ウシ血清(FBS)由来のビトロネクチン(VN)で自動的に被覆された。彼らは主にデンドライトに結合し、彼ら...

ディスカッション

細胞接着分子TLCNと細胞外マトリックスタンパク質ビトロネクチンとの親和性を用いた樹状フィロポディアリッチ画分の精製方法を開発した。PSD画分と比較して、樹状フィロポディアが豊富な画分から未熟なシナプスに作用するシナプスタンパク質を同定することができる。したがって、樹状フィロポディア富率の構成成分は、74%によってPSD画分のものと異なる。PSD分画とは異なり、培養海馬...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1.7 ml Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamine	Gibco	2530149
35-mm plastic cell culture dishes	Corning	430165
Anti-actin	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-alpha-Actinin	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-alpha-tubulin	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
BCA protein assay kit	Thermo	23227
Bromophenol blue	Merck	1.08122.0005
calcium chrolide, hydrous	Wako	038-19735
Cell scraper	Falcon	353085
Cell strainer	Falcon	352350
Choline chloride	Sigma-Aldrich	C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel	ATTO	E-T520L
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads	Sperotech	PM-20-10
MEM amino acid solution	Gibco	11130-051	30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system	ATTO	AE-6530
Niacinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilin / Streptomycin	Gibco	15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail	Roche	4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide	Nacali	28360-14
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit wako	Wako	291-5031
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	1703940JA
Ultra pure water	MilliQ		For production of ultra pure water