Purification de la Fraction dendritique filopodia-riche

Résumé

Dans ce protocole, nous introduisons une méthode pour purifier la fraction dendritique filopodia-riche de la structure phagocytic de la coupe-comme la saillie sur les neurones hippocampiques cultivés en profitant de l'affinité spécifique et forte entre un filopodial dendritique la molécule d'adhérence, TLCN, et une molécule extracellulaire de matrice, vitronectin.

Résumé

La filodée dendritique sont des saillies minces et longues basées sur le filament d'actine, et elles s'étendent et se rétractent comme si la recherche d'un axone cible. Lorsque la filodée dendritique établir le contact avec un axone cible, ils commencent à mûrir dans les épines, conduisant à la formation d'une synapse. La télencéphale (TLCN) est abondamment localisée dans la filodée dendritique et est progressivement exclue des épines. La surexpression de TLCN dans les neurones hippocampiques cultivés induit la formation de filopodia dendritique. Nous avons montré que la téencéphale se lie fortement à une molécule de matrice extracellulaire, la vitronectin. Les microbilles vitronectin-enduites ont induit la formation phagocytic de tasse sur les dendrites neuronales. Dans la tasse phagocytique, TLCN, les protéines tlcN-contraignantes telles que l'Ezrin/Radixin/Moesin phosphorylé (phospho-ERM), et F-actine sont accumulées, ce qui suggère que les composants de la tasse phagocytique sont semblables à ceux de la filodasie dendritique. Ainsi, nous avons développé une méthode pour purifier la tasse phagocytique au lieu de filopodia dendritique. Des perles magnétiques de polystyrène ont été enduites avec la vitronectin, qui est abondamment présente dans le milieu de culture des neurones hippocampiques et qui induit la formation phagocytic de tasse sur les dendrites neuronales. Après 24 h d'incubation, les tasses phagocytiques ont été légèrement solubilisées avec le détergent et rassemblées utilisant un séparateur d'aimant. Après avoir lavé les perles, les protéines de liaison ont été élucées et analysées par la coloration argentée et le ballonnement occidental. Dans la fraction contraignante, Le TLCN et l'actine étaient très présents. En outre, beaucoup de protéines identifiées de la fraction ont été localisées à la filopodia dendritique ; ainsi, nous avons nommé la fraction de liaison comme la fraction dendritique filopodia-riche. Cet article décrit des détails concernant la méthode de purification pour la fraction dendritique filopodia-riche.

Introduction

La filodée dendritique sont considérées comme des précurseurs des épines. Les filaments d'actine dans la filopodia dendritique règlent leur extension et rétractation^1,2,3. Après contact avec un axone, la filodée dendritique sélectionnée commence leur maturation dans les épines, et une synapse est formée^4,5. Les composants des épines ont été déterminés à partir de l'analyse complète des fractions de densité postsynaptic^6,7, tandis que les composants de la filodée dendritique restent largement inconnus. Il a été démontré que la télencéphaline (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 kinase, Akt, mTOR, polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, et EphB régulent la formation de filopodia dendritique^{5,8,9 ,10,11}, alors qu'une méthode n'a pas été développée pour l'analyse complète des molécules présentes dans la filodée dendritique.

TLCN (ICAM-5) est spécifiquement exprimé par les neurones épineux dans le segment le plus rostral du cerveau, le telencephalon¹². TLCN a 9 domaines Ig-like dans sa région extracellulaire, une région transmembrane, et une queue cytoplasmique¹³. TLCN lie à la vitronectin (VN) et LFA-1 integrin dans sa région extracellulaire, à la présénilin e dans sa région transmembrane, et à la phospho-ERM et à l'actinine dans sa région cytoplasmique^{5,8,14,15 ,16}. TLCN se lie au cytosquelette d'actine par phospho-ERM aux extrémités de la filodée dendritique et de l'actinine dans les épines et les arbres dendritiques^8,16.

Nous avons montré que la surexpression de TLCN a amélioré la formation de filopodia dendritique et a induit le retour des épines à la filopodia¹⁰. La forme active constitutive de l'ezrin lié à la région cytoplasmiquede TLCN et la formation améliorée de filopodia dendritique 8. Ainsi, TLCN régule la formation de filopodia dendritique par des protéines actin-contraignantes. Esselens et coll. ont démontré que les microbilles induisaient l'accumulation de TLCN sur les neurones cultivés¹⁷. Nous avons montré que les structures phagocytiques de tasse ont été formées sur les dendrites neuronales autour des microbilles VN-enduites dans une manière TLCN-dépendante¹⁵. Les constituants de la filodée dendritique sont semblables à ceux de la tasse phagocytique. Il est difficile de recueillir la filodée dendritique, mais il est relativement plus facile de recueillir la tasse phagocytique à l'aide de microbilles magnétiques. Ainsi, nous avons développé une méthode pour purifier la tasse phagocytique au lieu de filopodia dendritique¹⁸. Ici, nous décrivons la méthode de purification pour la fraction dendritique filopodia-riche.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de RIKEN Wako.

1. Culture des neurones hippocampiques

1. Préparation du milieu de culture
   1. Préparation du mélange de vitamine 200x. Dissoudre 100 mg de sel hémicalcium acide D-pantothénique, 100 mg de chlorure de choline, 100 mg d'acide folique, 180 mg d'i-inositol, 100 mg de niiacinamide, 100 mg de HCl pyridoxal et 100 mg de thiamine HCl dans 500 ml d'eau ultrapure à l'aide d'un remuant magnétique. La solution n'est pas complètement dissoute. Mélanger délicatement, l'aliquot dans des tubes de 50 ml et le conserver à -20 oC.
   2. Préparation de la solution Riboflavin. Dissoudre 100 mg de Riboflavine dans 500 ml d'eau ultrapure à l'aide d'un agitateur magnétique. La solution n'est pas complètement dissoute. Mélanger délicatement, l'aliquot dans des tubes de 50 ml et le conserver à -20 oC.
   3. Préparation de 1 M CaCl₂. Dissoudre 7,35 g de CaCl₂x 2H₂O dans 50 ml d'eau ultrapure à l'aide d'un agitateur magnétique.
   4. Préparation du médium essentiel minimum (MEM). Dissoudre 400 mg de KCl, 6800 mg de NaCl, 2 200 mg de NaHCO₃, 158 mg de NaH₂PO₄o 2H₂O, 7000 mg de D-glucose, et 200 mg de MgSO₄-7H₂O dans 950 mL d'eau ultrapure à l'aide d'un agitateur magnétique.
   5. Titrate 1,8 ml de 1 M CaCl₂ au MEM d'une manière goutte à goutte à l'aide d'une tuyauterie de 1 ml avec une agitation constante sur un agitateur magnétique. Ajuster le pH du MEM à pH 7,25 avec 1 mol/L HCl.
   6. Ajouter 5 ml de mélange de vitamine 200x et 200 l de solution Riboflavin au MEM. Ajuster le volume de la solution à 1000 ml avec de l'eau ultrapure. Filtrer la solution à l'aide d'un système de filtre de 0,22 m et la stocker à 4 oC.
   7. Préparation de solutions de stock 10x DNase-I. Dissoudre 100 mg de DNase-I dans 12,5 ml de la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hanks, filtrer à travers un filtre de 0,22 m, aliquot dans des tubes de 1,5 ml, et stocker les tubes à -20 oC.
   8. Préparation de la solution de stock cytosine-D-arabinofuranoside (Ara-C). Dissoudre 25 mg d'Ara-C dans 8,93 ml d'eau ultrapure (concentration finale de 10 mM), filtrer à travers un filtre de 0,22 m, aliquot dans des tubes de 1,5 ml et conserver à -20 oC
   9. Préparation du milieu de placage. Mélanger 1 ml de solution d'acide aminé MEM, 750 l de 1 M HEPES, 1 ml de B27, 125 oL de glutamine de 200 mM, 250 l de pénicilline/streptomycine, 2,5 mL de sérum bovin fœtal (FBS) et 44,375 mL de MEM dans un tube de 50 ml.
   10. Préparation du milieu d'arrêt. Mélanger 1 mL de solution d'acide aminé MEM, 750 l de 1 M HEPES, 5 mL de FBS (finale 10%) et 43,25 ml de MEM dans un tube de 50 ml.
2. Préparation de plats enduits de poly-L-Lysine
   1. Enrober les plats de culture de cellules en plastique de 35 mm de 0,2 mg/ml d'hydrobromure de poly-L-lysine pendant 1 jour à 25 oC.
      REMARQUE: La poly-l-lysine ne doit pas être utilisée au lieu de l'hydrobromure de poly-L-lysine.
   2. Laver la vaisselle avec 2 ml d'eau ultrapure 3 fois. Incuber les plats avec 1,5 ml de milieu d'arrêt à 25 oC jusqu'à utilisation.
3. Dissection des neurones hippocampiques de l'embryon de souris
   1. Source tissulaire des neurones hippocampiques. Disséquer l'hippocampe de type sauvage et TLCN-déficientcc C57BL6/J souris sur les jours embryonnaires 16-17 selon la méthode de Lu et al.¹⁹.
   2. Incubate disséqué hippocampi en trypsine 0,25% et 1x DNaseI en HBSS contenant 15 mM HEPES, pH 7,2 pour 15 min à 37 oC avec agitation toutes les 3 min. Supprimer la solution. Incuber l'hippocampe dans 10 ml de milieu STOP pour inactiver la trypsine à 4 oC pendant 5 min.
   3. Déplacer l'hippocampe dans 10 ml de milieu FRAIS STOP et incuber à 4 oC pendant 5 min. Déplacer l'hippocampe dans 10 ml de milieu STOP frais et incuber à 4 oC pendant 5 min. Déplacez l'hippocampe en 900 oL de milieu STOP et 100 l de 10x DNaseI dans un 15 mL tube. Dissocier les hippocampes en neurones isolés en pipetting 20 fois à l'aide d'un tuyautde de 1 ml.
      REMARQUE: La pointe de la tuyauterie de 1 ml touche légèrement le fond du tube de 15 ml lors de la dissociation de l'hippocampe.
   4. Ajouter 9 ml de milieu de placage et filtrer à travers une passoire cellulaire de 70 m dans un tube de 50 ml. Comptez le nombre de cellules à l'aide d'un hémocytomètre et ajustez-les à 3,5 x 10⁴ cellules/mL dans le milieu de placage.
   5. Aspirez LE milieu STOP des plats enrobés de poly-L-lysine. Déposer les cellules sur des plats enduits de poly-L-Lysine à 7 x 10⁴ cellules/plat (2 ml/plat).
   6. Après 60-64 h d'incubation sous 5% co₂ à 37 oC, ajouter 2 'L de solution de stock Ara-C (finale 10 'M) aux neurones, et secouer le plat lentement. Gardez les plats de culture dans une boîte humidifiée sans changer le milieu de culture en dessous de 5% CO₂ à 37 oC.

2. Purification de La fraction riche en Filopodia dendritique

1. Après 13 jours in vitro (DIV), ajouter des microbilles magnétiques de polystyrène (3 x 10⁶ particules/plat) à 20 plats contenant les neurones cultivés. Après 1 jour, lavez les neurones dans 1 ml de PBS avec l'agitation 3 fois pour enlever les microbilles moyennes et non liées. Après avoir enlevé le PBS, lysez les neurones avec un tampon de lyse de 500 l/l (PBS contenant 0,01 % de Triton X-100, cocktail inhibiteur de la protéase sans EDTA et cocktail inhibiteur de la phosphatase).
2. Recueillir le lysate à l'eau à l'œil d'un grattoir cellulaire et déplacer le lysate vers des microtubes à faible teneur en protéines (10 tubes). Placez les tubes sur un séparateur d'aimant et attendez 1 min. Recueillir le supernatant et l'utiliser comme la fraction non liée pour la coloration d'argent et l'analyse de tache occidentale.
3. Transférer les perles dans un nouveau microtube à faible teneur en protéines, réglé sur un séparateur magnétique, et retirer complètement le supernatant. Ajouter 500 l de tampon de lyse et laver les perles à l'aide d'un mélangeur à vortex pendant 15 s. Mettre le tube sur un séparateur d'aimant, attendre 1 min, retirer le supernatant et ajouter 500 l de tampon de lyse. Répéter le lavage des perles 10 fois et retirer le supernatant.
4. Protéines d'Elute liées aux perles (la fraction liée) par l'ajout de 50 'L de tampon d'échantillon sDS 1x (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS, et 10% glycérol) et faire bouillir le tube à 98 oC pendant 5 min. Centrifugeuse le tube à 860 x g pour 10 s et a mis le tube sur un séparateur magnétique pendant 1 min. Recueillir le supernatant et l'utiliser comme fraction liée.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
5. Mesurer les concentrations protéiques des fractions non liées et liées par l'évaluation des protéines BCA. Visualisez des solutions protéiques avec du bleu bromophénol et ajustez la concentration à 5 ng/L pour SDS-PAGE.

3. Silver Staining et Western Blot Analysis

1. Séparez les fractions liées et non liées (50 ng) par SDS-PAGE à l'aide d'un gel de gradient de 5 à 20 %. Tache d'argent le gel.
2. Western blot utilisant l'anti-TLCN-C (1/3 000), la vitronctine anti-bovine (1/5 000), l'anti-actine (1/1 000) et l'anti-tubulin (1/1 000) comme anticorps primaires et l'anti-lapin de chèvre hrP-conjugué IgG (1/5 000) comme anticorps secondaires. Visualisez les antigènes à l'aide d'un réactif de détection de blotting occidental chemiluminescent et d'un imageur de chemiluminescence.

Résultats

Dans les neurones hippocampiques cultivés, TLCN a été abondamment localisé à la filodée dendritique, l'arbre, et le soma et colocalisé avec F-actin (Figure 1A, B). Lorsque des microbilles de polystyrène ont été ajoutées aux neurones hippocampiques cultivés, les perles ont été automatiquement enduites de vitronectin (VN) dérivée du sérum bovin foetal (FBS) dans le milieu de culture; ils étaient principalement liés à des den...

Discussion

Nous avons développé une méthode de purification pour la fraction dendritique filopodia-riche en utilisant l'affinité entre la molécule d'adhérence cellulaire TLCN et la protéine extracellulaire de protéine vitronectin. Par rapport à la fraction DEP, il pourrait être possible d'identifier les protéines synaptiques agissant sur la synapse immature de la fraction dendritique filopodia-riche. Ainsi, les constituants de la fraction dendritique filopodia-riche sont différents de ceux de la fraction PSD par 74%. Di...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1.7 ml Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamine	Gibco	2530149
35-mm plastic cell culture dishes	Corning	430165
Anti-actin	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-alpha-Actinin	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-alpha-tubulin	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
BCA protein assay kit	Thermo	23227
Bromophenol blue	Merck	1.08122.0005
calcium chrolide, hydrous	Wako	038-19735
Cell scraper	Falcon	353085
Cell strainer	Falcon	352350
Choline chloride	Sigma-Aldrich	C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel	ATTO	E-T520L
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads	Sperotech	PM-20-10
MEM amino acid solution	Gibco	11130-051	30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system	ATTO	AE-6530
Niacinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilin / Streptomycin	Gibco	15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail	Roche	4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide	Nacali	28360-14
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit wako	Wako	291-5031
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	1703940JA
Ultra pure water	MilliQ		For production of ultra pure water