수지상 필로포디아 풍부한 분획의 정화

요약

이 프로토콜에서는 수지상 필로포디알 사이의 특이적이고 강한 친화력을 활용하여 배양된 해마 뉴런상의 식수컵형 돌출 구조로부터 수지상 필로포디아가 풍부한 분획을 정화하는 방법을 소개합니다. 접착 분자, TLCN, 및 세포외 매트릭스 분자, vitronectin.

초록

수지상 필로포디아는 액틴 필라멘트에 기초하여 얇고 긴 돌출부이며, 표적 축색을 찾는 것처럼 확장하고 후퇴합니다. 수지상 필로포디아가 표적 축색과 접촉하면 척추로 성숙하기 시작하여 시냅스의 형성으로 이어집니다. 텔렌세팔린 (TLCN)은 수지상 필로포디아에 풍부하게 국한되어 있으며 점차 척추에서 제외됩니다. 배양된 해마 뉴런에서 TLCN의 과발현은 수지상 우포ODIa 형성을 유도한다. 우리는 텔렌스팔린이 세포외 매트릭스 분자인 비트로네틴에 강하게 결합한다는 것을 보여주었습니다. Vitronectin 코팅된 마이크로비드는 신경 모수석에 식세포 컵 형성을 유도했습니다. 식세포 컵, TLCN, 인산화 된 에즈린 / 라디신 / 모에신 (포스포 - ERM) 및 F-액틴과 같은 TLCN 결합 단백질이 축적되어 식세포 컵의 성분이 수지상 필로포디아와 유사하다는 것을 시사합니다. 따라서 수지상 필로포디아 대신 식세포 컵을 정화하는 방법을 개발했습니다. 마그네틱 폴리스티렌 구슬은 비트론틴으로 코팅되었고, 이는 해마 뉴런의 배양 배지에 풍부하게 존재하며 뉴런 모수석에 식세포 컵 형성을 유도합니다. 24시간 배양 후, 식세포 컵을 세제로 경미하게 용해시키고 자석 분리기를 사용하여 수집했습니다. 구슬을 세척한 후, 결합 단백질을 용출하고 은 염색 및 웨스턴 블로팅에 의해 분석시켰다. 결합 분획에서, TLCN 및 액틴은 풍부하게 존재했다. 또한, 분획으로부터 확인된 많은 단백질은 수지상 필로포디아로 국소화되었다; 따라서, 우리는 수지상 filopodia 풍부한 분획으로 결합 분획을 명명했다. 이 기사에서는 수지상 필로포디아 가풍부한 분획에 대한 정제 방법에 관한 세부 사항을 설명합니다.

서문

수지상 필로포디아는 척추의 전구체로 생각됩니다. 수지상 필로포디아의 액틴 필라멘트는 확장 및^철회를조절1,^2,3. 축축액과 접촉 한 후 선택된 수지상 필로포디아가 척추로 성숙을 시작하고 시냅스가^4,5로형성됩니다. 척추의 성분은 후진성 밀도 분획^6,7의포괄적 인 분석에서 결정되었으며 수지상 필로포디아의 구성 요소는 크게 알려지지 않았습니다. 텔렌스팔린(TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 키나아제, Akt, mTOR, 폴로유사 키나아제 2, CaMKII, 신데칸-2, 파라레민-1, ARF6 및 EphB가 수지상 필로포디아 형성 5,^8,9를 조절하는 것으로 나타났습니다. ^{,10,도 11,}수지상 필로포디아에 존재하는 분자의 포괄적인 분석을 위한 방법이 개발되지 않은 반면.

TLCN(ICAM-5)은 특히 가장 로스트랄 뇌 세그먼트에서 가시 뉴런에 의해발현되며, 텔렌세판론(12). TLCN은 세포외 영역, 막막 영역 및 세포질 꼬리^13에9 개의 Ig 유사 도메인을 가지고 있습니다. TLCN은 세포외 영역에서 비트로넥틴(VN) 및 LFA-1 인테그린에 결합하고, 세포막 영역에서 프레세닐린을, 세포질 영역에서 인광-ERM 및 α-액티닌에 결합합니다 5,^{8,14,15 ,16}. TLCN은 수지상 필로포디아 및 α-액티닌의 끝에서 인광-ERM을 통해 세포골격에 결합하고 척추 및 수지상샤프트 8,^16.

우리는 TLCN의 과발현이 수지상 필로포디아 형성을 강화하고 가시가 필로포디아(10)로 복귀하도록 유도하는 것을 보여주었다. TLCN 세포질 영역에 결합된 에즈린의 구성활성 형태및 강화된 수지상 필로포디아형성 8. 따라서 TLCN은 액틴 결합 단백질을 통해 수지상 필로포디아 형성을 조절합니다. Esselens 외. 마이크로비드가 배양된 뉴런에 TLCN 축적을 유도한다는 것을 입증했다^17. 우리는 식세포 컵 구조가 TLCN 의존적인 방식으로 VN 코팅 된 마이크로 비드 주위의 신경 모수석에 형성되었다는 것을 보여주었다^15. 수지상 필로포디아의 성분은 식세포 컵과 유사합니다. 수지상 필로포디아를 수집하는 것은 어렵지만 자기 마이크로 비드를 사용하여 식세포 컵을 수집하는 것이 상대적으로 쉽습니다. 따라서 수지상 필로포디아(18) 대신 식수구컵을 정화하는 방법을개발하였다. 여기서, 수지상 필로포디아 풍부 분획에 대한 정제 방법을 설명한다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 RIKEN Wako의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 해마 뉴런의 문화

1. 배양 배지의 준비
   1. 200x 비타민 믹스의 준비. D-판토텐산 헤미칼슘 염 100 mg, 콜린 염화물 100 mg, 엽산 100 mg, 이노시톨 180 mg, 나이아신아미드 100 mg, 피리독살 HCl 100 mg, 그리고 500 mL의 초순수 수분 으로 티아민 HCl 100 mg을 용해하십시오. 용액이 완전히 용해되지 는 않습니다. 조심스럽게 혼합, 50 mL 튜브에 aliquot및 -20 °C에서 저장.
   2. 리보플라빈 용액의 준비. 자기 교반기로 500 mL의 초순수에 리보플라빈 100 mg을 녹입니다. 용액이 완전히 용해되지 는 않습니다. 조심스럽게 혼합, 50 mL 튜브에 aliquot및 -20 °C에서 저장.
   3. 1 M CaCl2의 준비 . 자기 교반기로 50 mL의 초순수에 CaCl₂·2H_2O7.35 g을 용해시.
   4. 최소 필수 배지 (MEM)의 준비. 자기 교반기950mL에서 KCl 400 mg, NaCl 6800 mg, NaHCO_3,NaH2 PO 158 mg, 4·2H_2O,7000 mg의 D-글루코스, 200 mg의 MgSO4-7H₂O를 용해한다.
   5. 자기 교반기상 일정한 교반을 가진 1 mL 파이펫을 사용하여 MEM에 1.8 mL의 적정 1.8 mL을 드롭 바이 드롭 방식으로. MEM의 pH를 1 몰/L HCl로 pH 7.25로 조정합니다.
   6. MEM에 5 mL의 200x 비타민 믹스와 200 μL의 리보플라빈 용액을 첨가하십시오. 초순수로 용액의 부피를 1,000mL로 조정합니다. 0.22 μm 필터 시스템을 사용하여 용액을 걸과 4°C에 보관하십시오.
   7. 10x DNase-I 재고 솔루션 준비. 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)의 12.5 mL에 DNase-I 100 mg을 용해하고 0.22 μm 필터를 통해 필터, 1.5 mL 튜브의 aliquot를 통해 튜브를 -20 °C에 보관하십시오.
   8. 시토신 β-D-아라비노노사이드(Ara-C) 스톡 용액의 제조. 8.93 mL의 초순수(최종 농도 10mM)에 25mg의 아라-C를 용해하고, 0.22 μm 필터를 통해 필터를 적용하고, 1.5mL 튜브에 aliquot를 적용하고 -20°C에서 보관하십시오.
   9. 도금 매체의 준비. MEM 아미노산 용액 1 mL, 750 μL 의 1 M HEPES, B27의 1 mL, 200 mM 글루타민의 125 μL, 페니실린/스트렙토마이신 250 μL, 태아 소 혈청 2.5 mL(FBS), MEM 의 44.375 mL을 혼합합니다.
   10. 중지 매체의 준비. MEM 아미노산 용액 1 mL, 1 M HEPES 750 μL, FBS 5 mL (최종 10%), 그리고 50 mL 튜브에 MEM 43.25 mL을 혼합합니다.
2. 폴리-L-리신 코팅 요리 준비
   1. 25 °C에서 1 일 동안 폴리 L-리신 하이드로 브로마이드0.2 mg / mL로 35mm 플라스틱 세포 배양 접시를 코팅하십시오.
      참고: 폴리-L-리신 대신 폴리-L-리신 하이드로마이드를 사용해서는 안 됩니다.
   2. 2 mL의 초순수로 3 회 설거지하십시오. 1.5 mL의 스톱 배지를 25°C에서 사용 후 배양합니다.
3. 마우스 배아에서 해마 뉴런의 해부
   1. 해마 뉴런의 조직 소스. 루 외^19의방법에 따라 16-17일 동안 야생형 및 TLCN 결핍 C57BL6/J 마우스로부터 해마를 해부한다.
   2. 배양해 해마를 0.25% 트립신과 1x DNaseI에서 15 mM HEPES를 함유하고, pH 7.2를 37°C에서 37°C에서 교반하여 3분마다 용액을 제거한다. 해마를 10 mL의 STOP 배지에서 배양하여 4°C에서 트립신을 5분 동안 비활성화한다.
   3. 해마를 신선한 STOP 배지 의 10 mL로 이동하고 5 분 동안 4 °C에서 4 °C로 배양하고 4 °C에서 4 °C로 배양하십시오. mL 튜브. 1 mL 파이펫을 사용하여 20 회 파이펫팅하여 해마를 고립 된 뉴런으로 해리하십시오.
      참고: 1 mL 파이펫의 끝은 해마의 해리 동안 15 mL 튜브의 바닥에 약간 닿습니다.
   4. 도금 매체의 9 mL를 추가하고, 50 mL 튜브에 70 μm 세포 스트레이너를 통해 필터링합니다. 혈세포계를 사용하여 셀 수를 계산하고 도금 매체에서 3.5 x 10⁴ 셀 /mL로 조정합니다.
   5. 폴리-L-리신 코팅 접시에서 STOP 매체를 흡인합니다. 7 x 10^{4 세포} / 접시 (2 mL / 접시)에서 폴리 L-리신 코팅 접시에 세포를 접시.
   6. 37°C에서 5% CO2 미만의 배양 60-64시간 후, 2 μL의 아라-C 스톡 용액(최종 10 μM)을 뉴런에 넣고 천천히 접시를 흔들어 줍니다. 배양접시를 37°C에서 5% CO2 미만의 배양배지를 변경하지 않고 가습상자에 보관한다.

2. 수지상 필로포디아 풍부한 분획의 정화

1. 13일 간 시험관 내(DIV)를 마친 후, 배양된 뉴런을 함유한 20가지 접시에 마그네틱 폴리스티렌 마이크로비드(3 x 10⁶ 입자/접시)를 추가합니다. 1일 후, PBS의 1 mL에서 뉴런을 교반으로 3회 세척하여 배지 및 언바운드 마이크로비드를 제거하였다. PBS를 제거 한 후, 용해 완충액의 500 μL / 접시로 뉴런을 용해시 (0.01 % 트리톤 X-100, EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일 및 인산염 억제제 칵테일를 함유한 PBS).
2. 세포 스크레이퍼로 용해액을 수집하고 용해액을 저단백 결합 마이크로튜브(10튜브)로 이동시다. 자석 분리기에 튜브를 설정하고 1 분 동안 기다립니다. 상류를 수집하고 은 염색 및 웨스턴 블롯 분석을위한 언 바운드 분수로 사용합니다.
3. 비드를 새로운 저단백 결합 마이크로튜브로 옮기고, 자기 분리기 상에 설정하고, 상층체를 완전히 제거한다. 용해 완충액 500 μL을 추가하고 15 s. 자석 분리기에 튜브를 설정하고, 1 분 동안 기다렸다가 상구를 제거하고, 용해 완충액 500 μL을 추가하십시오. 구슬의 세척을 10 번 반복하고 상한을 제거합니다.
4. 1x SDS 샘플 버퍼(62.5mTris HCl, pH 6.8, 2.5% SDS 및 10% 글리세롤)의 50 μL을 첨가하여 비드(경계 분수)에 결합된 용황 단백질을 5분 동안 98°C에서 끓이고, 10s에 대해 860 x gg의 튜브를 원심분리하고 10s튜브를 설정합니다. 1 분 동안 자기 분리기에서 상한체를 수집하고 바운드 분수로 사용합니다.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
5. BCA 단백질 분석방법으로 결합되지 않은 분획의 단백질 농도를 측정합니다. 브로모페놀 블루로 단백질 용액을 시각화하고 SDS-PAGE의 농도를 5 ng/μL로 조정합니다.

3. 은 염색 및 웨스턴 블롯 분석

1. 5-20% 그라데이션 겔을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 바운드 및 언바운드 분획(50 ng)을 분리한다. 젤을 은색으로 얼룩.
2. 항 TLCN-C (1/3,000), 항소 비트론틴 (1/5,000), 항 액틴 (1/1,000), 및 항 α-tubulin (1/1,000)을 1 차 항체및 HRP-접포 염소 항 토끼 IgG (1/5,000)를 사용하여 서쪽 얼룩. 화학 발광 웨스턴 블로팅 검출 시약 및 화학 발광 이미저를 사용하여 항원을 시각화합니다.

결과

배양된 해마 뉴런에서, TLCN은 수지상 필로포디아, 샤프트 및 소마에 풍부하게 국소화되었고 F-액틴(도1A,B)으로 국소화되었다. 폴리스티렌 마이크로비드가 배양된 해마 뉴런에 첨가되었을 때, 구슬은 배양 배지에서 태아 소 혈청(FBS)으로부터 유래된 비트로넥틴(VN)으로 자동 코팅되었다; 그들은 주로 수상돌기와 결합되었고, 식세포 컵의 ?...

토론

우리는 세포 부착 분자 TLCN과 세포 외 매트릭스 단백질 비트로넥틴 사이의 친화성을 사용하여 수지상 필로포디아가 풍부한 분획에 대한 정제 방법을 개발했습니다. PSD 분획에 비해, 수지상 필로포디아 가 풍부한 분획으로부터 미성숙 시냅스상에 작용하는 시냅스 단백질을 식별할 수 있었다. 따라서, 수지상 필로포디아-풍부한 분획의 성분은 74%에 의해 PSD 분획의 성분과 상이하다. PSD 분획과는 달?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1.7 ml Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamine	Gibco	2530149
35-mm plastic cell culture dishes	Corning	430165
Anti-actin	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-alpha-Actinin	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-alpha-tubulin	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
BCA protein assay kit	Thermo	23227
Bromophenol blue	Merck	1.08122.0005
calcium chrolide, hydrous	Wako	038-19735
Cell scraper	Falcon	353085
Cell strainer	Falcon	352350
Choline chloride	Sigma-Aldrich	C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel	ATTO	E-T520L
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads	Sperotech	PM-20-10
MEM amino acid solution	Gibco	11130-051	30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system	ATTO	AE-6530
Niacinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilin / Streptomycin	Gibco	15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail	Roche	4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide	Nacali	28360-14
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit wako	Wako	291-5031
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	1703940JA
Ultra pure water	MilliQ		For production of ultra pure water