Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion

Zusammenfassung

In diesem Protokoll führen wir eine Methode zur Reinigung der dendritischen filopodiareichen Fraktion aus der phagozytischen Cup-ähnlichen Vorsprungstruktur auf kultivierten Hippocampus-Neuronen ein, indem wir die spezifische und starke Affinität zwischen einem dendritischen Filopodialen Adhäsionsmolekül, TLCN, und ein extrazelluläres Matrixmolekül, vitronectin.

Zusammenfassung

Dendritische Filopodia sind dünne und lange Vorsprünge, die auf dem Actin-Filament basieren, und sie dehnen sich aus und ziehen sich zurück, als ob sie nach einem Zielaxon suchen. Wenn die dendritischen Filopodia Kontakt mit einem Zielaxon herstellen, beginnen sie, zu Stacheln zu reifen, was zur Bildung einer Synapse führt. Telencephalin (TLCN) ist reichlich in dendritischen Filopodien lokalisiert und wird nach und nach von Stacheln ausgeschlossen. Die Überexpression von TLCN in kultivierten Hippocampus-Neuronen induziert die dendritische Filopodia-Bildung. Wir zeigten, dass Telencephalin stark an ein extrazelluläres Matrixmolekül, vitronectin, bindet. Vitronectin-beschichtete Mikroperlen induzierten phagozytische Tasse Bildung auf neuronalen Dendriten. In der phagozytischen Tasse, TLCN, TLCN-bindende Proteine wie phosphorylierte Sezrin/Radixin/Moesin (Phospho-ERM), und F-Actin sind angesammelt, was darauf hindeutet, dass Komponenten der phagozytischen Tasse denen der dendritischen Filopodia ähneln. So entwickelten wir eine Methode zur Reinigung der phagozytischen Tasse anstelle der dendritischen Filopodia. Magnetische Polystyrolperlen wurden mit Vitronectin beschichtet, das im Kulturmedium der Hippocampus-Neuronen reichlich vorhanden ist und phagozytische Becherbildung bei neuronalen Dendriten induziert. Nach 24 h Inkubation wurden die phagozytischen Becher leicht mit Waschmittel verwoben und mit einem Magnetabscheider gesammelt. Nach dem Waschen der Perlen wurden die Bindungsproteine eluiert und durch Silberfärbung und Western-Blotting analysiert. In der Bindungsfraktion waren TLCN und Actin reichlich vorhanden. Darüber hinaus wurden viele Proteine, die aus der Fraktion identifiziert wurden, auf die dendritische Filopodia lokalisiert; Daher nannten wir die Bindungsfraktion die dendritische filopodiareiche Fraktion. Dieser Artikel beschreibt Details über die Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion.

Einleitung

Dendritische Filopodia werden als Vorläufer von Stacheln angenommen. Actin Filamente in der dendritischen Filopodia regulieren ihre Ausdehnung und Rückzug^1,2,3. Nach Kontakt mit einem Axon beginnen ausgewählte dendritische Filopodien ihre Reifung in Stacheln, und eine Synapse wird^{gebildet 4,5}. Komponenten der Stacheln wurden aus einer umfassenden Analyse der postsynaptischen Dichtefraktionen^6,7bestimmt, während Komponenten der dendritischen Filopodia weitgehend unbekannt bleiben. Es hat sich gezeigt, dass Telencephalin (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 Kinase, Akt, mTOR, Polo-ähnliche Kinase 2, CaMKII, Syndecan-2, Paralemin-1, ARF6 und EphB die dendritische Filopodiabildung regulieren^{5,8,9 ,10,11}, während eine Methode für die umfassende Analyse von Molekülen in der dendritischen Filopodia nicht entwickelt wurde.

TLCN (ICAM-5) wird speziell durch stachelige Neuronen im rostralsten Hirnsegment, dem Telencephalon^12,exprimiert. TLCN hat 9 Ig-ähnliche Domänen in seiner extrazellulären Region, eine Transmembranregion und einen zytoplasmatischen Schwanz¹³. TLCN bindet in seiner extrazellulären Region an Vitronectin (VN) und LFA-1-Integrin, an Presenilin in seiner Transmembranregion und an Phospho-ERM und -Actinin in seiner zytoplasmatischen Region^{5,8,14,15 ,16}. TLCN bindet an das Aktin-Zytoskelett durch Phospho-ERM an den Spitzen der dendritischen Filopodia und des Actinins in Stacheln und dendritischen Wellen^8,16.

Wir zeigten, dass die Überexpression der TLCN-verstärkten dendritischen Filopodia-Bildung und die Umkehrung der Wirbelsäule zu Filopodia¹⁰induzierte. Die konstitutive aktive Form von Ezrin, die an die tLCN-Zytoplasma-Region gebunden ist, und verbesserte dendritische Filopodia-Bildung⁸. So reguliert TLCN die dendritische Filopodiabildung durch aktinbindende Proteine. Esselens et al. zeigten, dass Mikroperlen die TLCN-Akkumulation an kultivierten Neuronen¹⁷induzierten. Wir zeigten, dass phagozytische Becherstrukturen auf neuronalen Dendriten um VN-beschichtete Mikroperlen in einer TLCN-abhängigen Weise gebildet wurden¹⁵. Bestandteile der dendritischen Filopodia ähneln denen der phagozytischen Tasse. Es ist schwierig, dendritische Filopodia zu sammeln, aber es ist relativ einfacher, die phagozytische Tasse mit magnetischen Mikroperlen zu sammeln. So haben wir eine Methode entwickelt, um den phagozytischen Becher anstelle der dendritischen Filopodia¹⁸zu reinigen. Hier beschreiben wir die Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von RIKEN Wako genehmigt.

1. Kultur der Hippocampus-Neuronen

1. Vorbereitung des Kulturmediums
   1. Zubereitung von 200x Vitaminmischung. Lösen Sie 100 mg D-Pantothensäure-Hemicalciumsalz, 100 mg Cholinchlorid, 100 mg Folsäure, 180 mg I-Inositol, 100 mg Niacinamid, 100 mg Pyridoxal HCl und 100 mg Thiamin HCl in 500 ml Reinstwasser mit einem magnetischen Rührer. Die Lösung ist nicht vollständig aufgelöst. Sorgfältig mischen, in 50 ml-Rohren aliquotieren und bei -20 °C lagern.
   2. Vorbereitung der Riboflavin-Lösung. 100 mg Riboflavin in 500 ml Reinstwasser mit einem Magnetrührer auflösen. Die Lösung ist nicht vollständig aufgelöst. Sorgfältig mischen, in 50 ml-Rohren aliquotieren und bei -20 °C lagern.
   3. Zubereitung von 1 M CaCl₂. 7,35 g CaCl₂2H2 O in 50 ml Reinstwasser mit einem Magnetrührer auflösen.
   4. Vorbereitung des minimalen grundnotwendigen Mediums (MEM). 400 mg KCl, 6800 mg NaCl, 2.200 mg NaHCO₃, 158 mg NaH₂PO₄2 H₂O, 7000 mg D-Glucose und 200 mg MgSO₄-7H₂O in 950 ml reinem Wasser mit einem magnetischen Rührer auflösen.
   5. 1,8 ml von 1 M CaCl₂ tropfenweise mit einer 1 ml Pipette mit konstanter Rührung an einem Magnetrührer zum MEM titerieren. Stellen Sie den pH-Wert des MEM auf pH 7,25 mit 1 mol/L HCl ein.
   6. Fügen Sie dem MEM 5 ml 200x Vitaminmischung und 200 l Riboflavin-Lösung hinzu. Stellen Sie das Volumen der Lösung mit Reinstwasser auf 1.000 ml ein. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 m Filtersystem und lagern Sie sie bei 4 °C.
   7. Vorbereitung von 10x DNase-I Lagerlösungen. 100 mg DNase-I in 12,5 ml von Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) auflösen, durch einen 0,22 m Filter filtern, in 1,5 ml-Rohren aliquoten, und die Rohre bei -20 °C lagern.
   8. Herstellung der Cytosin-Lagerlösung -D-Arabinofuranosid (Ara-C). 25 mg Ara-C in 8,93 ml Reinstwasser (Endkonzentration von 10 mM) auflösen, durch einen 0,22 m Filter filtern, in 1,5 ml-Rohren aliquotenfrei machen und bei -20 °C lagern
   9. Vorbereitung des Platting-Mediums. Mischen Sie 1 ml MEM-Aminosäurelösung, 750 l von 1 M HEPES, 1 ml B27, 125 l von 200 ml Glutamin, 250 l Penicillin/Streptomycin, 2,5 ml fetales Rinderserum (FBS) und 44,375 ml MEM in einem 50 ml-Rohr.
   10. Vorbereitung des Stop-Mediums. Mischen Sie 1 ml MEM-Aminosäurelösung, 750 l 1 M HEPES, 5 ml FBS (endend 10%) und 43,25 ml MEM in einem 50 ml-Rohr.
2. Zubereitung von poly-L-Lysin-beschichteten Gerichten
   1. 35 mm Kunststoffzellkulturschalen mit 0,2 mg/ml Poly-L-Lysinhydrobromid für 1 Tag bei 25 °C anschichten.
      HINWEIS: Poly-L-Lysin sollte nicht anstelle von Poly-L-Lysin-Hydrobromid verwendet werden.
   2. Waschen Sie das Geschirr mit 2 ml Reinstwasser 3 mal. Inkubieren Sie die Gerichte mit 1,5 ml Stop Medium bei 25 °C bis zum Gebrauch.
3. Zerlegung von Hippocampus-Neuronen aus Maus-Embryon
   1. Gewebequelle von Hippocampus-Neuronen. Sezieren Sie den Hippocampus von Wildtyp- und TLCN-defizienten C57BL6/J-Mäusen an den embryonalen Tagen 16-17 nach der Methode von Lu et al.¹⁹.
   2. Inkubieren Sie seziertes Hippocampi in 0,25% Trypsin und 1x DNaseI in HBSS mit 15 mM HEPES, pH 7,2 für 15 min bei 37 °C mit Rührung alle 3 min. Entfernen Sie die Lösung. Inkubieren Sie das Hippocampi in 10 ml STOP-Medium, um Trypsin bei 4 °C für 5 min zu inaktivieren.
   3. Das Hippocampi in 10 ml frisches STOP-Medium bewegen und bei 4 °C 5 min inkubieren. Das Hippocampi in 10 ml frisches STOP-Medium bewegen und bei 4 °C weitere 5 min inkubieren. mL-Rohr. Dissoziieren Sie die Hippocampi in isolierte Neuronen durch Pipettieren 20 Mal mit einer 1 ml Pipette.
      HINWEIS: Die Spitze der 1 ml Pipette berührt leicht den Boden des 15 ml Rohres während der Dissoziation des Hippocampi.
   4. Fügen Sie 9 ml Beschichtungsmedium hinzu und filtern Sie durch ein 70 m Zellsieb in ein 50 ml Rohr. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und passen Sie sich in einem Beschichtungsmedium auf 3,5 x 10⁴ Zellen/ml an.
   5. Aspirieren STOP Medium aus Poly-L-Lysin-beschichteten Gerichten. Die Zellen auf poly-L-Lysin-beschichteten Schalen mit 7 x 10⁴ Zellen/Schale (2 ml/Schale) aufteilen.
   6. Nach 60-64 h Inkubation unter 5% CO2 bei 37 °C 2 L Ara-C-Stammlösung (endgültige 10 M) in die Neuronen geben und die Schale langsam schütteln. Bewahren Sie die Kulturgerichte in einer befeuchteten Box auf, ohne das Kulturmedium bei 37 °C unter 5% CO2 zu senken.

2. Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion

1. Nach 13 Tagen in vitro (DIV) fügen Sie magnetische Polystyrol-Mikroperlen (3 x 10⁶ Partikel/Schale) zu 20 Gerichten hinzu, die die kultivierten Neuronen enthalten. Nach 1 Tag, waschen Sie die Neuronen in 1 ml PBS mit Agitation 3 mal, um die mittelgroßen und ungebundenen Mikroperlen zu entfernen. Nach dem Entfernen von PBS lysieren Sie die Neuronen mit 500 L/Schale Lysepuffer (PBS mit 0,01% Triton X-100, EDTA-freier Protease-Hemmer-Cocktail und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail).
2. Das Lysat mit einem Zellschaber sammeln und das Lysat in eiweißbindende Mikroröhren (10 Tuben) bewegen. Stellen Sie die Rohre auf einen Magnetabscheider und warten Sie 1 min. Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn als ungebundenen Bruch für Silberfärbung und Western Blot-Analyse.
3. Übertragen Sie die Perlen auf ein neues proteinarmes Mikrorohr, das auf einen magnetischen Separator gesetzt ist, und entfernen Sie den Überstand vollständig. Fügen Sie 500 l Lysepuffer hinzu und waschen Sie die Perlen mit einem Wirbelmischer für 15 s. Stellen Sie das Rohr auf einen Magnetabscheider, warten Sie 1 min, entfernen Sie den Überstand, und fügen Sie 500 L Lysepuffer hinzu. Wiederholen Sie das Waschen der Perlen 10 Mal und entfernen Sie den Überstand.
4. Elute-Proteine, die durch Zugabe von 50 l 1x SDS-Probenpuffer (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS und 10% Glycerin) an die Perlen gebunden sind, und das Rohr bei 98 °C für 5 min kochen. Zentrieren Sie das Rohr bei 860 x g für 10 s und stellen Sie das Rohr auf auf einem magnetischen Separator für 1 min. Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn als gebundenen Bruch.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
5. Messen Sie die Proteinkonzentrationen der ungebundenen und gebundenen Fraktionen durch den BCA-Proteintest. Visualisieren Sie Proteinlösungen mit Bromphenolblau und passen Sie die Konzentration für SDS-PAGE auf 5 ng/L an.

3. Silberfärbung und Western Blot Analyse

1. Trennen Sie die gebundenen und ungebundenen Brüche (50 ng) durch SDS-PAGE mit einem 5-20% Gradientengel. Silber-Färbung das Gel.
2. Westlicher Blot mit Anti-TLCN-C (1/3.000), Anti-Rinder-vitronectin (1/5.000), Anti-Actin (1/1.000) und Anti-A-Tubulin (1/1.000) als primäre Antikörper und HRP-konjugiertes Ziegenanti-Kaninchen-IgG (1/5.000) als sekundärer Antikörper. Visualisieren Sie die Antigene mit chemiluminescent Western Blotting Detection Reagenz und einem Chemilumineszenz-Imager.

Ergebnisse

In kultivierten Hippocampus-Neuronen wurde TLCN reichlich auf die dendritische Filopodia, Welle und Soma lokalisiert und mit F-Actin kolokalisiert (Abbildung 1A, B). Wenn Polystyrol-Mikroperlen kultivierten Hippocampus-Neuronen zugesetzt wurden, wurden die Perlen automatisch mit Vitronectin (VN) beschichtet, das aus fetalem Rinderserum (FBS) im Kulturmedium gewonnen wurde; sie waren hauptsächlich an Dendriten gebunden, und sie induzierten di...

Diskussion

Wir entwickelten eine Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion unter Verwendung einer Affinität zwischen dem Zelladhäsionsmolekül TLCN und dem extrazellulären Matrixprotein vitronectin. Im Vergleich zur PSD-Fraktion könnte es möglich sein, die synaptischen Proteine, die auf die unreife Synapse wirken, aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion zu identifizieren. So unterscheiden sich die Bestandteile der dendritischen filopodiareichen Fraktion um 74% von denen der PSD-Fraktion. Anders a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1.7 ml Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamine	Gibco	2530149
35-mm plastic cell culture dishes	Corning	430165
Anti-actin	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-alpha-Actinin	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-alpha-tubulin	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
BCA protein assay kit	Thermo	23227
Bromophenol blue	Merck	1.08122.0005
calcium chrolide, hydrous	Wako	038-19735
Cell scraper	Falcon	353085
Cell strainer	Falcon	352350
Choline chloride	Sigma-Aldrich	C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel	ATTO	E-T520L
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads	Sperotech	PM-20-10
MEM amino acid solution	Gibco	11130-051	30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system	ATTO	AE-6530
Niacinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilin / Streptomycin	Gibco	15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail	Roche	4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide	Nacali	28360-14
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit wako	Wako	291-5031
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	1703940JA
Ultra pure water	MilliQ		For production of ultra pure water