Dendritic Filopodia-zengin kesir arıtma

Özet

Bu protokolde, dendritik filopodial arasında belirli ve güçlü bir yakınlık yararlanarak kültürlü hipokampal nöronlar üzerinde fagositik fincan benzeri protrüzyon yapısı dendritik filopodia zengin fraksiyonu arındırmak için bir yöntem tanıtmak yapışma molekül, TLCN, ve bir ekstrasellüler matris molekül, vitronektin.

Özet

Dendritik filopodia akinin filament dayalı ince ve uzun çıkıntılar, ve onlar uzatmak ve bir hedef Axon ararken gibi geri çekin. Dendritik filopodia bir hedef Akon ile temas kurduğunda, bir sinaps oluşumuna yol açan, spines içine olgunlaşmak başlar. Telencephalin (TLCN) oldukça dendritik filopodia lokalize ve yavaş yavaşça spines hariç tutulur. Kültürlü hipokampal nöronlar içinde TLCN aşırı ifade dendritik filopodia oluşumu indükler. Biz telencephalin güçlü bir hücre içi matris molekül, vitronektin bağlar gösterdi. Vitronectin kaplı mikrobilyeleri nöronal dendrites üzerinde fagositik fincan oluşumu kaynaklı. Phagositik kupada, TLCN, fosforilated ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM) ve F-actin gibi TLCN-bağlayıcı proteinler birikir, bu da fagositik kupanın bileşenlerinin dendritik filopodia 'ya benzer olduğunu göstermektedir. Böylece, dendritik filopodia yerine fagositik kupayı arındırmak için bir yöntem geliştirdik. Manyetik polistiren boncuklar, hipokampal nöronların kültür ortamında bulunan ve nöronal dendrites üzerinde fagositik bardak oluşumunu tetikleyen vitronektin ile kaplanmıştır. 24 saat inkübasyon yapıldıktan sonra, fagositik bardak deterjan ile hafif bir şekilde çözünmeli ve mıknatıs ayırıcı kullanılarak toplanır. Boncukları yıkadıktan sonra, bağlayıcı proteinler gümüş boyama ve Batı bloplama ile incelenmiş ve analiz edilmiştir. Bağlayıcı fraksiyonda, tlcn ve aktin bol miktarda mevcut. Buna ek olarak, kesir tespit birçok protein dendritik filopodia lokalize edildi; Bu nedenle, biz dendritik filopodia-zengin fraksiyonu olarak bağlayıcı fraksiyonu adı. Bu makalede, dendritik filopodia zengin kesir için arıtma yöntemi ile ilgili ayrıntıları açıklar.

Giriş

Dendritik filopodia, spines öncüleri olduğu düşünülmektedir. Dendritik filopodia içinde actin filamin uzatma ve retraksiyon^1,2,3düzenler. Bir Axon ile temas ettikten sonra, seçilmiş dendritik filopodia, olgunlaşmasını spines içine başlar ve bir sinaps^4,5oluşur. Dikenler bileşenleri postsinaptik yoğunluk kesirler^6,7kapsamlı analizinden belirlendi, dendritik filopodia bileşenleri büyük ölçüde bilinmeyen kalır süre. Bu, telencephalin (tlcn), erm, syngap, RAS, pıkinaz, AKT, mTOR, Polo benzeri kinaz 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6 ve ephb, dendritik filopodia oluşumu^{5,8,9 düzenleyen gösterildi ,10},¹¹, bir yöntem ise dendritik filopodia mevcut moleküllerin kapsamlı analizi için geliştirilmiştir değil.

Tlcn (ICAM-5) özellikle en rostral beyin segmentinde dikenli nöronlar tarafından ifade edilir, telencephalon¹². TLCN, hücre dışı bölgesinde 9 IG benzeri etki alanı, bir transmembran bölgesi ve sitoplazmik kuyruk¹³' ü vardır. Tlcn, hücre dışı bölgesinde vitronektin (VN) ve LFA-1 integrine, transmembran bölgesinde presenilin 'e, sitoplazmik bölgesinde fosho-ERM ve α-actinin 'e bağlar^{5,8,14,15 ,16}. Tlcn, dikenler ve dendritik şaftlar içinde dendritik filopodia ve α-actinin iplerinde phospho-ERM yoluyla akin sitoiskelet bağlar^8,16.

Biz tlcn gelişmiş dendritik filopodia oluşumu ekspresyonu gösterdi ve filopodia¹⁰için dikenler reversion indüklenmiş. Teknikerleriniz 'in kurucu aktif formu tlcn sitoplazmik bölgeye bağlı ve gelişmiş dendritik filopodia oluşumu⁸. Böylece TLCN, akin bağlayıcı proteinlerle dendritik filopodia oluşumunu düzenler. Esselens ve ark. mikroboncuklar kültürsüz nöronlar üzerinde TLCN birikimi kaynaklı gösterdi¹⁷. Fagositik fincan yapısının, VN kaplı mikroboncuk etrafında nöronal dendritler üzerinde, TLCN-bağımlı bir biçimde¹⁵' te oluştuğunu gösterdik. Dendritik filopodia bileşenleri fagositik kupalar benzer. Dendritik filopodia toplamak zordur, ama manyetik mikroboncuk kullanarak fagositik fincan toplamak nispeten daha kolaydır. Böylece, dendritik filopodia¹⁸yerine fagositik kupayı arındırmak için bir yöntem geliştirdik. Burada, dendritik filopodia zengin fraksiyonu için arıtma yöntemi açıklanmaktadır.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler RıKEN Wako kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. hipokampal nöronların kültürü

1. Kültür ortamının hazırlanması
   1. 200x Vitamin karışımı hazırlanması. Çözülür 100 mg D-pantothenic asit hemicalcium tuz, 100 Kolin klorür mg, 100 mg folik asit, 180 mg i-inositol, 100 mg Niacinamide, 100 mg piridoksal HCL, ve 100 mg Thiamin HCL içinde 500 ml Ultra saf su manyetik karıştırıcı kullanarak. Çözüm tamamen çözülür değil. 50 ml tüplerde dikkatle karıştırın, kısım ve-20 °c ' de saklayın.
   2. Riboflavin çözeltisi hazırlanması. Çözünür 100 manyetik karıştırıcı kullanarak 500 ml Ultra saf su içinde riboflavin mg. Çözüm tamamen çözülür değil. 50 ml tüplerde dikkatle karıştırın, kısım ve-20 °c ' de saklayın.
   3. 1 M CaCl₂hazırlanması. Çözünür 7,35 g CAcl₂· 2H₂O 50 ml 'de manyetik karıştırıcı kullanarak ultra saf su.
   4. Minimum temel Orta (MEM) hazırlanması. Çözülür 400 mg KCL, 6800 mg NaCl, 2.200 mg NaHCO₃, 158 mg Nah₂Po₄· 2H₂O, 7000 mg D-glikoz ve 200 mg MgSO₄-7h₂o içinde 950 ml Ultra saf su manyetik karıştırıcı kullanarak.
   5. Titrat 1,8 mL 1 M CaCl₂ ' ye bir damla-by-Drop şekilde bir manyetik karıştırıcı üzerinde sabit bir ajitasyon Ile 1 ml pipet kullanarak. 1 mol/L HCl ile MEM için pH 7,25 pH değerini ayarlayın.
   6. Ekle 5 mL 200x Vitamin karışımı ve 200 Me riboflavin solüsyonu μL. Çözümün hacmini Ultra Saf suyla 1.000 ml 'ye ayarlayın. Solüsyonu 0,22 μm filtre sistemi kullanarak filtreleyin ve 4 °C ' de saklayın.
   7. 10X DNase-ı stok çözümlerinin hazırlanması. 100 mg DNase-ı, Hanks ' dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 12,5 ml 'de çözülür, 0,22 μm filtre ile filtre, 1,5 ml tüplerde kısım ve tüpleri-20 °c ' de saklayın.
   8. Sitozin β-D-arabinofuranoside (ara-C) stok çözeltisi hazırlanması. 8,93 ml Ultra saf su (10 mm son konsantrasyonu), 0,22 μm filtre aracılığıyla filtre, 1,5 ml tüpler ve mağaza-20 °c ' de 25 mg ara-C çözülür.
   9. Kaplama orta hazırlanması. Mix 1 mL MEM amino asit çözeltisi, 750 μL 1 M HEPES, 1 mL B27, 125 μL 200 mM glutamin, 250 μL penisilin/streptomisin, 2,5 ml fetal sığır serumu (FBS), ve 44,375 ml, bir 50 mL tüpte MEM.
   10. Stop orta hazırlama. Mix 1 mL MEM amino asit çözeltisi, 750 μL 1 M HEPES, 5 mL FBS (son 10%), ve 43,25 mL MEM bir 50 mL tüp.
2. Poly-L-Lysine kaplı yemeklerin hazırlanması
   1. Coat 35 mm plastik hücre kültürü yemekleri 0,2 mg/mL Poly-L-lizin hidrobromür ile 1 gün 25 °C ' de.
      Not: Poly-l-lizin, poli-L-lizin hidrobromür yerine kullanılmamalıdır.
   2. 2 ml Ultra Saf suyla 3 kez yıkayın. Kullanım süresi 25 °C ' de 1,5 mL stop medyası ile yemekleri kulbe etme.
3. Fare embriyo hipokampal nöronların diseksiyon
   1. Hipokampal nöronların doku kaynağı. Hippocampus vahşi tipi ve TLCN-eksikliği C57BL6/J fareler embriyonik günlerde 16-17 lu ve al.¹⁹yöntemine göre incelemek.
   2. 15 mm HEPES içeren HBSS 'de% 0,25 tripsin ve 1x dnasei 'de disseke hipokampi, 37 °c ' de 15 dk, her 3 dakikada bir ajitasyon ile pH 7,2. çözümü çıkarın. 5 dakika boyunca 4 °C ' de tripsin inaktive etmek için 10 mL STOP medyası içinde hipokampi 'yi kulbe etmek.
   3. Hippocampi 'yi 10 mL taze STOP ortamına taşıyın ve 5 dakika boyunca 4 °C ' de Inküye yapın. hipokampi 'yi 10 mL taze STOP ortamına taşıyın ve 5 dakika daha 4 °C ' de Inküye yapın. hipokampi 'yi 900 μL STOP orta ve 100 μL 'lik 10X DNaseI 'ye 15 mL tüp. 1 mL pipet kullanarak 20 kez pipetleme yaparak Hippocampi 'yi izole nöronlar haline yerleştirin.
      Not: 1 mL pipet ucu, Hippocampi 'nin dağılma sırasında 15 mL tüpün altına hafifçe dokunur.
   4. 9 mL kaplama orta ekleyin ve 70 μm hücre süzgeci ile 50 mL 'Lik bir tüpün içine filtre uygulayın. Bir hemokytometer kullanarak hücre sayısını saymak ve 3,5 x 10⁴ hücreler/ml kaplama orta ayarlayın.
   5. Poly-L-Lysine kaplı yemeklerden aspirate STOP orta. Poly-L-Lysine kaplı yemeklerle ilgili hücreleri 7 x 10⁴ hücreli/çanak (2 ml/çanak) olarak plakaya atın.
   6. 37 °C ' de% 5 CO₂ altında inkübasyon 60-64 h sonra, nöronlara 2 μL ara-C stok solüsyonu (son 10 μM) ekleyin ve yemeği yavaşça sallayın. 37 °C ' de% 5 CO₂ ' nin altında kültür ortamını değiştirmeden, kültür yemeklerini nemlendirilmiş bir kutuda tutun.

2. Dendritic Filopodia arıtma-zengin kesir

1. 13 gün içinde vitro (DıV) sonra, kültür nöronları içeren 20 yemeklere manyetik polistiren mikroboncuk (3 x 10⁶ parçacıklar/çanak) ekleyin. 1 gün sonra, orta ve ilişkisiz mikroboncuk kaldırmak için 3 kez ajitasyon ile PBS 1 mL nöronlar yıkayın. PBS 'yi kaldırdıktan sonra 500 μL/Dish liziz tamponu (0,01% Triton X-100, EDTA-ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyli ve fosfataz inhibitörü kokteyli) içeren nöronlar ile Lyse.
2. Bir hücre kazıyıcı ile lysate toplamak ve düşük protein bağlayıcı mikrotüpler (10 tüpler) için lysate taşıyın. Bir mıknatıs ayırıcı üzerinde tüpler ayarlayın ve 1 dakika bekleyin. süpernatant toplamak ve gümüş boyama ve Batı leke analizi için ilişkisiz fraksiyonu olarak kullanın.
3. Yeni bir düşük protein bağlayıcı mikrotüp için boncuklar aktarmak, bir manyetik ayırıcı ayarlamak, ve tamamen supernatant kaldırmak. 500 μL liziz tampon ekleyin ve 15 s için bir Vortex karıştırıcı kullanarak boncuklar yıkayın. bir mıknatıs ayırıcı üzerinde tüp ayarlayın, 1 dakika bekleyin, supernatant kaldırmak ve 500 μL liziz tampon ekleyin. Boncuklar 10 kez yıkamak ve supernatant kaldırmak tekrarlayın.
4. 50 μL 1x SDS örnek tampon (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8,% 2,5 SDS ve% 10 gliserol) ilavesi ile boncuklar (bağlı fraksiyonu) bağlı elute proteinleri ve 5 dakika için 98 °C ' de tüp kaynatın. 10 s için 860 x g boru santrifüj ve tüp ayarlamak 1 dakika için bir manyetik ayırıcı üzerinde süpernatant toplamak ve bağlı fraksiyonu olarak kullanın.
   Not: Protokol burada duraklatılmış olabilir.
5. BCA protein tahlil tarafından ilişkisiz ve bağlı fraksiyonları protein konsantrasyonları ölçmek. Protein çözümlerini bromophenol mavisi ile görselleştirin ve konsantrasyonu SDS-PAGE için 5 NG/μL olarak ayarlayın.

3. gümüş boyama ve Batı Blot Analizi

1. Bağlı ve ilişkisiz kesirleri (50 ng) SDS-PAGE tarafından% 5-20 gradyan jeli kullanarak ayırın. Jel gümüş leke.
2. Batı leke Anti-tlcn-C (1/3000) kullanarak, Anti-sığır vitronektin (1/5000), Anti-aksin (1/1000), ve anti-α-tubulin (1/1000) Primer antikorlar ve HRP-konjuze keçi Anti-tavşan IgG (1/5000) ikincil antikor olarak. Antijenleri chemiluminesans Batı blotting algılama Reakajına ve bir kemiluminesans görüntüleyiciler kullanarak görselleştirin.

Sonuçlar

Kültürlü hipokampal nöronlar, TLCN oldukça dendritik filopodia, şaft lokalize ve Soma ve F-actin ile kolokalize (Şekil 1a, B). Kültürlü hipokampal nöronlara polistiren mikroboncuk eklendiğinde, boncuklar otomatik olarak kültür ortamında fetal sığır serumu (FBS) elde edilen vitronektin (VN) ile kaplanmıştır; temelde dendrites bağlı ve onlar fagositik bardak oluşumu indüklenen (Şekil 1B

Tartışmalar

Biz, hücre yapışma molekül TLCN ve ekstrasellüler matris protein vitronektin arasında benzeşimi kullanarak dendritik filopodia zengin fraksiyonu için bir arıtma yöntemi geliştirdi. PSD kesir ile karşılaştırıldığında, dendritik filopodia zengin fraksiyondan olgunlaşmamış sinaps üzerinde hareket sinaptik proteinlerin tanımlamak mümkün olabilir. Böylece, dendritik filopodia zengin fraksiyonu bileşenleri% 74 tarafından PSD kesir olandan farklıdır. PSD kesir farklı, biz aktif fagositik bardak o...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1.7 ml Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamine	Gibco	2530149
35-mm plastic cell culture dishes	Corning	430165
Anti-actin	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-alpha-Actinin	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-alpha-tubulin	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
BCA protein assay kit	Thermo	23227
Bromophenol blue	Merck	1.08122.0005
calcium chrolide, hydrous	Wako	038-19735
Cell scraper	Falcon	353085
Cell strainer	Falcon	352350
Choline chloride	Sigma-Aldrich	C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel	ATTO	E-T520L
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads	Sperotech	PM-20-10
MEM amino acid solution	Gibco	11130-051	30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system	ATTO	AE-6530
Niacinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilin / Streptomycin	Gibco	15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail	Roche	4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide	Nacali	28360-14
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit wako	Wako	291-5031
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	1703940JA
Ultra pure water	MilliQ		For production of ultra pure water