Purificación de la fracción defípoda dendrítica

Resumen

En este protocolo, introducimos un método para purificar la fracción dendrítica rica en filopodia a partir de la estructura de protrusión phagocítica similar a la copa en las neuronas del hipocampo cultivadas aprovechando la afinidad específica y fuerte entre un filopodial dendrítico molécula de adhesión, TLCN, y una molécula de matriz extracelular, vitroctina.

Resumen

La filopodia dendrítica son protuberancias delgadas y largas basadas en el filamento de actina, y se extienden y se retraen como si buscaran un axón objetivo. Cuando la filopodia dendrítica establece contacto con un axón objetivo, comienzan a madurar en espinas, lo que conduce a la formación de una sinapsis. La telencefalina (TLCN) se localiza abundantemente en filopodia dendrítica y se excluye gradualmente de las espinas. La sobreexpresión de TLCN en neuronas hipocampales cultivadas induce la formación de filopodia dendrítica. Mostramos que la telencefalia se une fuertemente a una molécula de matriz extracelular, vitronectina. Microperlas de Vitronectina inducida por la formación de copas fagocíticas en dendritas neuronales. En la copa fagocítica, se acumulan TLCN, proteínas de unión a TLCN como Ezrin/Radixin/Moesin(phospho-ERM) foso-ERM, y F-actina, lo que sugiere que los componentes de la copa fagocítica son similares a los de la filopodia dendrítica. Por lo tanto, desarrollamos un método para purificar la copa fagocítica en lugar de filopodia dendrítica. Las perlas de poliestireno magnético fueron recubiertas con vitronectina, que está abundantemente presente en el medio de cultivo de las neuronas del hipocampo y que induce la formación de copas fagocíticas en dendritas neuronales. Después de 24 horas de incubación, las copas fagocíticas fueron ligeramente solubilizadas con detergente y recogidas con un separador de imán. Después de lavar las cuentas, las proteínas de unión fueron eluidas y analizadas por la tinción de plata y la hincha occidental. En la fracción de unión, TLCN y actina estaban abundantemente presentes. Además, muchas proteínas identificadas a partir de la fracción fueron localizadas a la filopodia dendrítica; por lo tanto, nombramos la fracción de unión como la fracción dendrítica rica en filopodia. Este artículo describe los detalles sobre el método de purificación para la fracción dendrítica rica en filopodia.

Introducción

Filopodia dendrítica se cree que son precursores de las espinas. Los filamentos de actina en la filopodia dendrítica regulan su extensión y retracción^1,2,3. Después de entrar en contacto con un axón, la filopodia dendrítica seleccionada comienza su maduración en espinas, y se forma una sinapsis^4,5. Los componentes de las espinas se han determinado a partir de un análisis exhaustivo de las fracciones de densidad postsináptica^6,7, mientras que los componentes de la filopodia dendrítica siguen siendo en gran medida desconocidos. Se ha demostrado que la telencefalina (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 quinasa, Akt, mTOR, polo-como quinasa 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, y EphB regulan la formación de filopodia dendrítica^{5,8,9 ,10,11}, mientras que no se ha desarrollado un método para el análisis integral de moléculas presentes en la filopodia dendrítica.

TLCN (ICAM-5) se expresa específicamente por las neuronas espinosas en el segmento cerebral más rostral, el telencéfalo^12. TLCN tiene 9 dominios similares a Ig en su región extracelular, una región transmembrana y una cola citoplasmática^13. EL TLCN se une a vitronectina (VN) y a la integrina LFA-1 en su región extracelular, a la presenilinicina ensu región transmembrana, y a la fosfo-ERM y a la actina en su región citoplasmática 5,^{8,14,15 ,16}. El TLCN se une al citoesqueleto de actina a través de fosfo-ERM en las puntas de filopodia dendrítica y de actinina en espinas y ejes dendríticos^8,16.

Mostramos que la sobreexpresión de TLCN mejoró la formación de filopodia dendrítica e indujo la reversión de las espinas a la filopodia^10. La forma activa constitutiva de ezrin ligada a la región citoplasmática TLCN y la formación de filopodia dendrítica mejorada⁸. Por lo tanto, TLCN regula la formación de filopodia dendrítica a través de proteínas de unión a la actina. Esselens y otros demostraron que las microperlas indujeron la acumulación de TLCN en las neuronas cultivadas¹⁷. Mostramos que las estructuras de copa shagocíticas se formaron sobre dendritas neuronales alrededor de microperlas recubiertas de VN de una manera dependiente del TLCN^15. Los componentes de la filopodia dendrítica son similares a los de la copa fagocítica. Es difícil recoger filopodia dendrítica, pero es relativamente más fácil recoger la copa fagocítica usando microperlas magnéticas. Así, desarrollamos un método para purificar la copa fagocítica en lugar de la filopodia dendrítica^18. Aquí, describimos el método de purificación para la fracción dendrítica rica en filopodia.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de RIKEN Wako.

1. Cultura de las neuronas del hipocampo

1. Preparación del medio de cultivo
   1. Preparación de la mezcla de vitamina 200x. Disolver 100 mg de sal hemicalcio ácido D-pantoténico, 100 mg de cloruro de colina, 100 mg de ácido fólico, 180 mg de i-inositol, 100 mg de niacinamida, 100 mg de pyridoxal HCl, y 100 mg de tiamina HCl en 500 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético. La solución no está completamente disuelta. Mezclar cuidadosamente, alícuota en tubos de 50 ml y almacenar a -20 oC.
   2. Preparación de la solución de Riboflavina. Disolver 100 mg de Riboflavina en 500 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético. La solución no está completamente disuelta. Mezclar cuidadosamente, alícuota en tubos de 50 ml y almacenar a -20 oC.
   3. Preparación de 1 M CaCl₂. Disolver 7,35 g de CaCl₂x 2H_en50 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético.
   4. Preparación del medio esencial mínimo (MEM). Disolver 400 mg de KCl, 6800 mg de NaCl, 2.200 mg de NaHCO₃, 158 mg de NaH₂PO₄x 2H₂O, 7000 mg de D-glucosa y 200 mg de MgSO₄-7H₂O en 950 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético.
   5. Valorar 1,8 ml de 1 M CaCl₂ al MEM de una manera gota a gota utilizando un pipeta de 1 ml con una agitación constante en un agitador magnético. Ajuste el pH del MEM a pH 7,25 con 1 mol/L HCl.
   6. Añadir 5 ml de 200x de mezcla de vitaminas y 200 ml de solución de riboflavina al MEM. Ajuste el volumen de la solución a 1.000 ml con agua ultrapura. Filtrar la solución utilizando un sistema de filtro de 0,22 m y almacenarla a 4 oC.
   7. Preparación de 10 soluciones de stock DNase-I. Disolver 100 mg de DNase-I en 12,5 ml de la solución salequilibrada de Hanks (HBSS), filtrar a través de un filtro de 0,22 m, alícuota en tubos de 1,5 ml y almacenar los tubos a -20 oC.
   8. Preparación de la solución de stock de citosina-D-arabinofuranoside (Ara-C). Disolver 25 mg de Ara-C en 8,93 ml de agua ultrapura (concentración final de 10 mM), filtrar a través de un filtro de 0,22 m, alícuota en tubos de 1,5 ml y almacenar a -20 oC
   9. Preparación del medio de chapado. Mezclar 1 ml de solución de aminoácidoME, 750 ml de 1 M HEPES, 1 mL de B27, 125 ml de glutamina de 200 ml, 250 ml de penicilina/estreptomicina, 2,5 ml de suero bovino fetal (FBS) y 44,375 ml de MEM en un tubo de 50 ml.
   10. Preparación del medio Stop. Mezclar 1 ml de solución de aminoácidos MEM, 750 ml de 1 M HEPES, 5 mL de FBS (final 10%), y 43,25 ml de MEM en un tubo de 50 ml.
2. Preparación de platos recubiertos de poli-L-lisina
   1. Recubrir platos de cultivo de células de plástico de 35 mm con 0,2 mg/ml de hidrobromuro de polillisina durante 1 día a 25 oC.
      NOTA: Poli-L-lisina no debe utilizarse en lugar de poli-L-lisina hidrobromida.
   2. Lavar los platos con 2 ml de agua ultrapura 3 veces. Incubar los platos con 1,5 ml de medio Stop a 25oC hasta su uso.
3. Disección de neuronas hipocampales a partir de embrión de ratón
   1. Fuente de tejido de las neuronas del hipocampo. Diseccionar el hipocampo de ratones C57BL6/J de tipo salvaje y deficiente en TLCN en los días embrionarios 16-17 según el método de Lu et al.¹⁹.
   2. Incubar hipocampo diseccionado en 0.25% trypsin y 1x DNaseI en HBSS que contiene 15 mM HEPES, pH 7.2 para 15 min a 37 oC con agitación cada 3 min. Retire la solución. Incubar el hipopótamo en 10 mL de medio STOP para inactivar la trippsina a 4oC durante 5 min.
   3. Mover el hipocampo a 10 mL de medio STOP fresco e incubar a 4 oC durante 5 min. Mover el hipocampo en 10 mL de medio STOP fresco e incubar a 4 oC durante otros 5 min. Mover el hipocampo en 900 éL de medio STOP y 100 oL de 10x DNaseI en un 15 min. tubo mL. Disociar el hipocampo en neuronas aisladas pipeteando 20 veces usando una pipeta de 1 ml.
      NOTA: La punta del pipeteo de 1 ml toca ligeramente la parte inferior del tubo de 15 ml durante la disociación del hipocampo.
   4. Agregue 9 ml de medio de chapado y filtre a través de un colador de células de 70 m en un tubo de 50 ml. Cuente el número de células usando un hemocitómetro y ajuste a 3.5 x 10⁴ células/ml en el medio de chapado.
   5. Aspirar STOP medio de platos recubiertos de poli-L-lisina. Placar las células en platos recubiertos de poli-L-lisina a 7 x 10⁴ células / plato (2 mL / plato).
   6. Después de 60-64 h de incubación por debajo del 5% de CO2 a 37 oC, añadir 2 seres de ara-C (final 10 m) a las neuronas, y agitar el plato lentamente. Mantener los platos de cultivo en una caja humidificada sin cambiar el medio de cultivo por debajo del 5% de_CO2 a 37oC.

2. Purificación de la fracción defípoda dendrítica rica en filopodia

1. Después de 13 días in vitro (DIV), añadir microperlas de poliestireno magnético (3 x 10⁶ partículas / plato) a 20 platos que contienen las neuronas cultivadas. Después de 1 día, lavar las neuronas en 1 ml de PBS con agitación 3 veces para eliminar los microperlas medianas y no unidas. Después de eliminar el PBS, lise las neuronas con 500 l /plato de tampón de lisis (PBS que contiene 0.01% Triton X-100, cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA, y cóctel inhibidor de fosfatasa).
2. Recoger el lisado con un rascador celular y mover el lisado a microtubos de baja unión a proteínas (10 tubos). Ajuste los tubos en un separador de imán y espere 1 min. Recoger el sobrenadante y utilizarlo como la fracción sin ataduras para la tinción de plata y el análisis de manchas occidentales.
3. Transfiera las perlas a un nuevo microtubo de unión a proteínas, se ajuste a un separador magnético y retire por completo el sobrenadante. Añadir 500 l de tampón de lisis y lavar las perlas con un mezclador de vórtice durante 15 s. Ajuste el tubo en un separador de imán, espere 1 min, retire el sobrenadante y agregue 500 ml de tampón de lisis. Repita el lavado de las perlas 10 veces y retire el sobrenadante.
4. Elute las proteínas unidas a las perlas (la fracción enlazada) por la adición de 50 l de 1 tampón de muestra de SDS (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS y 10% de glicerol) y hervir el tubo a 98 oC durante 5 min. Centrifugar el tubo a 860 x g durante 10 s y establecer el tubo de tubo en un separador magnético durante 1 min. Recoger el sobrenadante y utilizarlo como fracción enlazada.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
5. Mida las concentraciones proteicas de las fracciones no consolidadas y enlazadas por el ensayo de proteína BCA. Visualice las soluciones proteicas con azul bromofenol y ajuste la concentración a 5 ng/L para SDS-PAGE.

3. Tinción de Plata y Análisis de Manchas Occidentales

1. Separe las fracciones enlazadas y no enlazadas (50 ng) por SDS-PAGE utilizando un gel degradado de 5-20%. Mancha de plata el gel.
2. Blot occidental usando anti-TLCN-C (1/3,000), vitronectina antibovina (1/5,000), anti-actina (1/1,000) y anti-a-tubulina (1/1.000) como anticuerpos primarios y IgG de cabra conjugado en HRP (1/5,000) como anticuerpo secundario. Visualice los antígenos utilizando el reactivo de detección de manchas occidentales quimioluminiscentes y un imager de quimioluminiscencia.

Resultados

En las neuronas del hipocampo cultivadas, el TLCN fue localizado abundantemente a la filopodia dendrítica, el eje y el soma y colocalizó con F-actina (Figura1A,B). Cuando se añadieron microperlas de poliestireno a las neuronas del hipocampo cultivadas, las cuentas fueron recubiertas automáticamente con vitronectina (VN) derivada del suero bovino fetal (FBS) en el medio de cultivo; estaban destinados principalmente a dendritas, e indujeron...

Discusión

Desarrollamos un método de purificación para la fracción dendrítica rica en filopodia utilizando la afinidad entre la molécula de adhesión celular TLCN y la matriz extracelular profisitecina. En comparación con la fracción de PSD, podría ser posible identificar las proteínas sinápticas que actúan sobre la sinapsis inmadura de la fracción dendritica rica en filopodia. Por lo tanto, los componentes de la fracción dendrítica rica en filopodia son diferentes de los de la fracción PSD por 74%. A diferencia de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1.7 ml Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamine	Gibco	2530149
35-mm plastic cell culture dishes	Corning	430165
Anti-actin	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-alpha-Actinin	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-alpha-tubulin	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
BCA protein assay kit	Thermo	23227
Bromophenol blue	Merck	1.08122.0005
calcium chrolide, hydrous	Wako	038-19735
Cell scraper	Falcon	353085
Cell strainer	Falcon	352350
Choline chloride	Sigma-Aldrich	C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel	ATTO	E-T520L
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads	Sperotech	PM-20-10
MEM amino acid solution	Gibco	11130-051	30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system	ATTO	AE-6530
Niacinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilin / Streptomycin	Gibco	15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail	Roche	4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide	Nacali	28360-14
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit wako	Wako	291-5031
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	1703940JA
Ultra pure water	MilliQ		For production of ultra pure water