Purificação da fração rica de Filopodia dendrítica

Resumo

Neste protocolo, nós introduzimos um método para purificante a fração filopodia-rica dendríticas do fagocitária copo-como a estrutura do protrusão em neurônios hippocampal cultivados aproveitando-se da afinidade específica e forte entre um filopodial dendríticas molécula de adesão, TLCN, e uma molécula de matriz extracelular, vitronectina.

Resumo

Os filopódios dendríticos são protrusões finas e longas com base no filamento de actina, e eles se estendem e se retraem como se estivessem buscando um AXON alvo. Quando o filopódia dendrítico estabelecer contato com um AXON alvo, eles começam a amadurecer em espinhos, levando à formação de uma sinapse. A telencífica (tlcn) está abundantemente localizada em filopódia dendrítico e é gradualmente excluída de espinhas. O overexpression de tlcn em neurônios hippocampal cultivados induz a formação dendríticas do filopódia. Nós mostramos que o Telencephalin liga fortemente a uma molécula extracelular da matriz, Vitronectin. Microesferas Vitronectin-revestidos induziu a formação fagocitária do copo em dendrites neuronal. No copo fagocitítico, TLCN, proteínas de ligação TLCN tais como Ezrin fosforilado/Radixina/Moesina (fosho-ERM), e F-Actina são acumuladas, o que sugere que os componentes do copo fagocítico são semelhantes aos de filopodia dendrítico. Assim, desenvolvemos um método para purificação do copo fagocítico em vez de filopópodes dendrítico. Os grânulos magnéticos do poliestireno foram revestidos com o Vitronectin, que é abundantemente atual no meio de cultura de neurônios hippocampal e que induz a formação fagocitária do copo em dendrites neuronal. Após 24 h de incubação, os copos fagocíticos foram levemente solubilizados com detergente e coletados por meio de um separador magnético. Após a lavagem dos grânulos, as proteínas de ligação foram eluidas e analisadas por coloração de prata e western blotting. Na fração de ligação, TLCN e actina estavam abundantemente presentes. Além, muitas proteínas identificadas da fração foram localizadas ao filopodia dendríticas; assim, denominamos a fração de ligação como a fração rica em filopóticos dendrítico. Este artigo descreve detalhes a respeito do método da purificação para a fração filopodia-rica dendríticas.

Introdução

O filopódia dendrítico é pensado para ser precursores dos espinhas. Os filamentos de actina no filopódia dendrítico regulam sua extensão e retração^1,2,3. Depois de entrar em contato com um axão, o filopódia dendrítico selecionado começa sua maturação em espinhos, e uma sinapse é formada em^4,5. Componentes de espinhos foram determinados a partir da análise abrangente das frações de densidade pós-sináptica^6,7, enquanto os componentes de filopódia dendrítico permanecem em grande parte desconhecidos. Demonstrou-se que a telencérola (tlcn), erm, syngap, Ras, ARF6 quinase, Akt, mTOR, Polo-como a quinase 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, e ephb regulam a formação dendrítica defilopódia^5,8,9 ^,10,11, enquanto um método não foi desenvolvido para a análise abrangente de moléculas presentes no filopódio dendrítico.

Tlcn (ICAM-5) é expressado especificamente por neurônios spiny no segmento o mais rostral do cérebro, o telencéfalo¹². Tlcn tem 9 domínios do IG-like em sua região extracelular, uma região do transmembrana, e uma cauda cytoplasmic¹³. A tlcn liga-se à vitronectina (vn) e à integrina LFA-1 em sua região extracelular, à presenilina em sua região transmembranar e ao fosho-ERM e α-actinina em sua região citoplasmática^{5,8,14,15 ,16}. Tlcn liga-se ao citoesqueleto de actina através de fosho-ERM nas pontas de filopódia dendrítico e α-actinina em espinhos e eixos dendríticos^8,16.

Nós mostramos que o superexpressão de tlcn aumentou a formação dendríticas do filopódia e induziu a reversão dos espinhos ao filopódia¹⁰. A forma ativa constitutiva de Ezrin ligada à região citoplasmática do TLCN e a formação de filopótico dendrítica reforçada⁸. Assim, a TLCN regula a formação de filopódios dendríticos através de proteínas de ligação actina. Esselens et al. demonstraram que microgrânulos induziu acúmulo de TLCN em neurônios cultivados¹⁷. Nós mostramos que as estruturas fagocitária do copo foram dadas forma em dendritos neuronal em torno dos microesferas vn-revestidos em uma maneira tlcn-dependente¹⁵. Constituintes de filopódios dendríticos são semelhantes aos do copo fagocitítico. É difícil coletar filopódios dendríticos, mas é relativamente mais fácil coletar o copo fagocitítico usando microgrânulos magnéticos. Assim, desenvolvemos um método para purificar o copo fagocitítico em vez de filopódia dendrítico¹⁸. Aqui, nós descrevemos o método da purificação para a fração filopodia-rica dendríticas.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da RIKEN Wako.

1. cultura dos neurônios hipocampais

1. Preparação do meio de cultura
   1. Preparação da mistura da vitamina 200x. Dissolver 100 mg de D-ácido pantotênico hemicalcium sal, 100 mg de cloreto de colina, 100 mg de ácido fólico, 180 mg de i-inositol, 100 mg de niacinamida, 100 mg de HCl piridoxal, e 100 mg de tiamina HCl em 500 mL de água ultrapura usando um agitador magnético. A solução não está completamente dissolvida. Misture cuidadosamente, alíquota em 50 tubos de ml e armazene a-20 ° c.
   2. Preparação da solução de riboflavina. Dissolver 100 mg de riboflavina em 500 mL de água ultrapura utilizando um agitador magnético. A solução não está completamente dissolvida. Misture cuidadosamente, alíquota em 50 tubos de ml e armazene a-20 ° c.
   3. Preparação de 1 M CaCl₂. Dissolver 7,35 g de CaCl₂· 2h₂o em 50 ml de água ultrapura utilizando um agitador magnético.
   4. Preparação do meio mínimo essencial (MEM). Dissolver 400 mg de KCl, 6800 mg de NaCl, 2.200 mg de NaHCO₃, 158 mg de NaH₂po₄· 2h₂O, 7000 mg de D-glucose e 200 mg de MgSO₄-7h₂o em 950 ml de água ultrapura utilizando um agitador magnético.
   5. Titrate 1,8 mL de 1 M de CaCl₂ ao mem em uma maneira gota-a-gota usando um 1 ml de Pipet com uma agitação constante em um agitador magnético. Ajuste o pH do MEM para pH 7,25 com 1 mol/L HCl.
   6. Adicionar 5 mL de mistura de vitamina 200x e 200 μL de solução de riboflavina ao MEM. Ajuste o volume da solução para 1.000 mL com água ultrapura. Filtre a solução utilizando um sistema de filtro de 0,22 μm e guarde-o a 4 ° c.
   7. Preparação de soluções de estoque de 10x DNase-I. Dissolva 100 mg de DNase-I em 12,5 mL de solução de sal balanceada de Hanks (HBSS), filtre por um filtro de 0,22 μm, alíquota em tubos de 1,5 mL e armazene os tubos a-20 ° c.
   8. Preparação da solução em estoque de citosina β-D-arabinofuranoside (ARA-C). Dissolver 25 mg de Ara-C em 8,93 mL de água ultrapura (concentração final de 10 mM), filtrar através de um filtro de 0,22 μm, alíquota em tubos de 1,5 mL e armazenar a-20 ° c
   9. Preparação do meio de chapeamento. Misture 1 mL de solução de aminoácidos MEM, 750 μL de 1 M de HEPES, 1 mL de B27, 125 μL de glutamina de 200 mM, 250 μL de penicilina/estreptomicina, 2,5 mL de soro bovino fetal (FBS) e 44,375 mL de MEM num tubo de 50 mL.
   10. Preparação do meio de batente. Misture 1 mL de solução de aminoácido MEM, 750 μL de 1 M de HEPES, 5 mL de FBS (final 10%) e 43,25 mL de MEM num tubo de 50 mL.
2. Preparação de pratos revestidos de poli-L-lisina
   1. Cubra 35 mm pratos de cultura de células plásticas com 0,2 mg/mL de brometo de poli-L-lisina por 1 dia a 25 ° c.
      Nota: A poli-L-lisina não deve ser usada em vez do brometo de poli-L-lisina.
   2. Lave os pratos com 2 mL de água ultrapura 3 vezes. Incubar os pratos com 1,5 mL de meio de batente a 25 ° c até o uso.
3. Dissecção de neurônios hipocampais do embrião do rato
   1. Fonte de tecido de neurônios hipocampais. Dissecar o hipocampo de camundongos C57BL6/J de tipo selvagem e com deficiência de TLCN nos dias embrionários 16-17 de acordo com o método de Lu et al.¹⁹.
   2. Incubar hipocampo dissecado em 0,25% de tripsina e 1x DNaseI em HBSS contendo 15 mM de HEPES, pH 7,2 por 15 min a 37 ° c com agitação a cada 3 min. Retire a solução. Incubar os hipocampi em 10 mL de meio STOP para inativar a tripsina a 4 ° c por 5 min.
   3. Mova os hipocampos em 10 mL de meio de STOP fresco e incubar a 4 ° c durante 5 min. Mova os hipocampi em 10 mL de meio de STOP fresco e incubar a 4 ° c por mais 5 min. Mova os hipocampi em 900 μL de meio STOP e 100 μL de 10x DNaseI em 15 tubo de mL. Dissociar os hipocampi em neurônios isolados por pipetagem 20 vezes usando um 1 mL Pipet.
      Nota: A ponta do Pipet de 1 mL toca levemente a parte inferior do tubo de 15 mL durante a dissociação dos hipocampi.
   4. Adicione 9 mL do meio do chapeamento, e filtre através de um filtro da pilha de 70 μm em um tubo de 50 mL. Conte o número de células usando um hemociômetro e ajuste para 3,5 x 10⁴ células/ml em meio de chapeamento.
   5. Aspirar o meio de STOP de pratos revestidos de poli-L-lisina. Placa as células em poli-L-lisina-revestido pratos em 7 x 10⁴ células/prato (2 ml/prato).
   6. Após 60-64 h de incubação 5% CO₂ a 37 ° c, adicionar 2 μL de solução de ações ara-C (final 10 μm) para os neurônios, e agitar o prato lentamente. Mantenha os pratos da cultura em uma caixa humidificada sem mudar o meio de cultura 5% CO₂ em 37 ° c.

2. purificação da fração Filopodia-rica dendrítica

1. Após 13 dias in vitro (DIV), adicione microesferas de poliestireno magnético (3 x 10⁶ partículas/prato) a 20 pratos contendo os neurônios cultivados. Após 1 dia, lave os neurônios em 1 mL de PBS com agitação 3 vezes para remover os microgrânulos médios e não acoplados. Após a remoção de PBS, lyse os neurônios com 500 μL/prato de tampão de lise (PBS contendo 0, 1% Triton X-100, coquetel inibidor de protease livre de EDTA e coquetel inibidor da fosfatase).
2. Colete o lisado com um raspador de células e mova o lisado para microtubos de ligação de proteínas baixas (10 tubos). Ajuste os tubos em um separador magnético e aguarde 1 min. colete o sobrenadante e use-o como a fração não acoplada para coloração de prata e análise Western Blot.
3. Transfira as contas para um novo microtubo de ligação de baixa proteína, situado em um separador magnético, e remova completamente o sobrenadante. Adicionar 500 μL de tampão de Lise e lavar os grânulos utilizando um misturador Vortex durante 15 s. Ajuste o tubo em um separador magnético, Aguarde 1 min, retire o sobrenadante e adicione 500 μL de tampão de Lise. Repita a lavagem das contas 10 vezes e retire o sobrenadante.
4. Proteínas elute ligadas aos grânulos (a fração acoplada) pela adição de 50 μL de tampão de amostra de 1x SDS (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS e 10% glicerol) e ferver o tubo a 98 ° c por 5 min. centrifugar o tubo a 860 x g por 10 s e definir o tubo em um separador magnético por 1 min. colete o sobrenadante e use-o como a fração acoplada.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
5. Meça as concentrações proteicas das frações não acopladas e ligadas pelo ensaio da proteína BCA. Visualize soluções proteicas com azul de bromofenol e ajuste a concentração para 5 ng/μL para SDS-PAGE.

3. mancha de prata e Western blot análise

1. Separe as frações acopladas e não ligadas (50 ng) por SDS-PAGE usando um gel de gradiente de 5-20%. Prata-mancha o gel.
2. Western blot usando anti-TLCN-C (1/3000), antibovino vitronectina (1/5000), anti-actina (1/1000), e anti-α-tubulin (1/1000) como anticorpos primários e HRP-conjugado de cabra IgG anti-coelho (1/5000) como o anticorpo secundário. Visualize os antígenos usando o reagente de detecção de blotting ocidental quimioluminescente e um Imager de quimiluminescência.

Resultados

Nos neurônios hipocampais cultivados, a TLCN foi localizada abundantemente ao filopótico dendrítica, ao eixo e ao soma e colocalizada com F-Actina (Figura 1a, B). Quando os microgrânulos de poliestireno foram adicionados aos neurônios do hipocampal cultivado, os grânulos foram revestidos automaticamente com o vitronectina (vn) derivado do soro bovino fetal (FBS) no meio de cultura; Eles foram principalmente vinculados a dendritos, e ind...

Discussão

Nós desenvolvemos um método da purificação para a fração filopodia-rica dendríticas usando a afinidade entre a molécula tlcn da adesão da pilha e a vitronectina extracelular da proteína da matriz. Comparado à fração PSD, pode ser possível identificar as proteínas sinápticas atuando na sinapse imatura da fração dendrítica rica em filopodia. Assim, os constituintes da fração dendrítica filopodia-rica são diferentes dos da fração PSD em 74%. Diferente da fração PSD, usamos neurônios hipocampais c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES	Gibco	15630-080
1.7 ml Low Binding MCT	Sorenson BioScience	39640T
200 mM L-Glutamine	Gibco	2530149
35-mm plastic cell culture dishes	Corning	430165
Anti-actin	Sigma-Aldrich	A-5060
Anti-alpha-Actinin	Sigma-Aldrich	A-5044
Anti-alpha-tubulin	Sigma-Aldrich	T-9026
Anti-Ezrin	Sigma-Aldrich	clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq	Santacruz	sc-393
Anti-MAP2	Chemicon	clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin	Sigma-Aldrich	clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1	Santacuz	sc-5291
Anti-PSD95	MA2	ABR
Anti-Spectrin beta	Chemicon	MAB1622
B27	Gibco	0080085SA
BCA protein assay kit	Thermo	23227
Bromophenol blue	Merck	1.08122.0005
calcium chrolide, hydrous	Wako	038-19735
Cell scraper	Falcon	353085
Cell strainer	Falcon	352350
Choline chloride	Sigma-Aldrich	C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C-6645
DNase-I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich	P5155
DynaMag-2 Magnet	Thermo	12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE	RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel	ATTO	E-T520L
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
HBSS	Gibco	14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-035-144
i-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508
LAS-1000 mini	Fuji Film	LAS-1000 mini	For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads	Sperotech	PM-20-10
MEM amino acid solution	Gibco	11130-051	30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system	ATTO	AE-6530
Niacinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Penicilin / Streptomycin	Gibco	15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail	Roche	4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide	Nacali	28360-14
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P6155
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R9504
Silver Stain 2 Kit wako	Wako	291-5031
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	1703940JA
Ultra pure water	MilliQ		For production of ultra pure water