تحليل توطين snRNA Spliceosomal في خلايا الهيلا البشرية باستخدام الحقن المجهري

Summary

التكوين الحيوي للsnRNAs snRNAs spliceosomal هي عملية معقدة تنطوي على مختلف المقصورات الخلوية. هنا، وظفنا الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت من أجل رصد نقلها داخل الخلية.

Abstract

التكوين الحيوي للsnRNAs snRNAs snrnas هي عملية معقدة تنطوي على كل من المراحل النووية والسيتوبلازمية والخطوة الأخيرة تحدث في مقصورة نووية تسمى هيئة كاجال. ومع ذلك، فإن التسلسلات التي توجه توطين snRNA إلى هذا الهيكل دون النووي لم تكن معروفة حتى وقت قريب. لتحديد تسلسل مهم لتراكم snRNAs في أجسام Cajal، وظفنا الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت تليها توطينها داخل الخلايا. أولا، قمنا بإعداد snRNA حذف المسوخ، توليفها قوالب الحمض النووي للنسخ في المختبر وsnRNAs مسجلة في وجود UTP إلى جانب Alexa488. تم خلط snRNAs وصفت مع 70 kDa-Dextran مترافقة مع TRITC، وحقنها بميكروين في النواة أو السيتوبلازم من خلايا HeLa البشرية. تم احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة وثابتة، وكان تصور اللفائف علامة الجسم Cajal من قبل الفلورة المناعية غير المباشرة، في حين snRNAs وdextran، الذي يعمل كعلامة على الحقن النووي أو السيتوبلازم، لوحظ مباشرة باستخدام المجهر الفلورية. يسمح هذا الأسلوب لاختبار فعال وسريع لكيفية تأثير تسلسلات مختلفة على توطين RNA داخل الخلايا. هنا، نبين أهمية تسلسل SM ملزمة لتوطين كفاءة snRNAs في الجسم Cajal.

Introduction

ربط الحمض النووي الريبي هو واحد من الخطوات الحاسمة في التعبير الجيني، الذي يحفزه مجمع ريبونوكليوبروتين كبير يسمى spliceosome. في المجموع، يتم دمج أكثر من 150 بروتين و 5 RNAs النووية الصغيرة (snRNAs) في spliceosome في مراحل مختلفة من مسار الربط. U1، U2، U4، U5 و U6 snRNAs تشارك في الربط من الإنترونات GU-AG الرئيسية. هذه snRNAs الانضمام إلى spliceosome كما شكلت مسبقا جزيئات ريبونوكليوبروتين النووية الصغيرة (snRNPs) التي تحتوي على snRNA, سبعة البروتينات SM المرتبطة snRNA (أو البروتينات مثل SM, التي ترتبط مع SnRNA U6) و 1-12 البروتينات المحددة لكل snRNP.

تجميع snRNPs ينطوي على مراحل السيتوبلازمية والنووية. يتم تصدير snRNA المكتوبة حديثا إلى السيتوبلازم حيث يكتسب حلقة تجميعها من سبعة بروتينات SM. حلقة SM في وقت لاحق بمثابة إشارة لإعادة استيراد snRNA مرة أخرى إلى النواة. يتم الاحتفاظ snRNAs المعيبة التي تفشل في الارتباط مع البروتينات SM في السيتوبلازم¹. تظهر الـ snRNPs المستوردة حديثًا لأول مرة في جسم Cajal حيث تلتقي بالبروتينات الخاصة بالsnRNP وتنهي نضجها (تم استعراضها في المرجع²و3). أظهرنا مؤخرا أن تثبيط خطوات النضج النهائي يؤدي إلى عزل snRNPs غير ناضجة في الهيئات Cajal^4،5. اقترحنا نموذجا حيث النضج snRNP النهائي هو تحت مراقبة الجودة التي تراقب إضافة البروتينات الخاصة snRNP وتشكيل snRNPs النشطة. ومع ذلك، فإن التفاصيل الجزيئية لكيفية تمييز الخلايا بين الجسيمات الناضجة والشاذة غير الناضجة التي تم تجميعها بشكل صحيح لا تزال بعيدة المنال.

لتحديد تسلسل snRNA التي هي ضرورية لاستهداف وتراكم snRNAs في الهيئات كاجال النووية، قررنا استخدام الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت. وكان الحقن المجهري طريقة للاختيار لأنه: 1) أنها لا تتطلب علامة تسلسل إضافية للتمييز snRNAs الاصطناعية تشكل نظرائهم الذاتية وهو أمر مهم بشكل خاص لRNAs قصيرة مع مساحة صغيرة لإدراج تسلسل علامة إضافية; 2) فإنه يسمح بتحليل التسلسلات التي هي مهمة للتكوين الحيوي. على سبيل المثال، تسلسل SM ضروري لتجميع حلقة SM وإعادة الاستيراد إلى النواة⁶. عندما يتم التعبير عن snRNAs في الخلية ، يتم تدهور snRNAs تفتقر إلى تسلسل SM في السيتوبلازم ولا تصل إلى النواة والهيئات Cajal⁷. مهما, [سنّن] دون ال [سم] تسلسل يستطيع كنت مباشرة [ميكرونّد] داخل النواة ولذلك دور ممكنة من ال [سم] تسلسل في [كجل] جسم توطين يُسَرَّب.

هنا، ونحن نصف بالتفصيل طريقة الحقن المجهري التي طبقناها لتحديد تسلسل snRNA اللازمة لاستهداف snRNAs في الجسم Cajal⁵. أظهرنا أن SM وSMN مواقع ملزمة ضرورية وكافية لتوطين ليس فقط snRNAs ولكن مختلف قصيرة غير الترميز RNAs في الجسم Cajal. استنادا ً إلى الحقن المجهري بالإضافة إلى أدلة أخرى، اقترحنا أن حلقة SM تجميعها على موقع الربط SM هو إشارة توطين الجسم Cajal.

Protocol

1. إعداد snRNAs للحقن الدقيق

1. إعداد قالب الحمض النووي الذي يحتوي على إصدار كامل الطول أو مقتطع/متحول من snRNA بواسطة PCR باستخدام إعداد PCR التالي: 98 درجة مئوية لـ 60 درجة مئوية، 98 درجة مئوية لمدة 15 ق، 68 درجة مئوية لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 98 درجة مئوية لمدة 15 درجة مئوية لمدة 35 درجة مئوية لمدة 35 درجة مئوية ، و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
2. يجب أن يحتوي التمهيدي إلى الأمام على تسلسل المروج للنسخ في المختبر فقط المنبع من النيوكليوتيد اتّبع أول. تضخيم تسلسل SnRNA U2 باستخدام التمهيدي إلى الأمام التي تحتوي على المروج T7 والتمهيدي العكسي، الذي ينتهي مع النيوكليوتيد المكتوب الأخير (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).
3. توليف snRNA باستخدام مجموعة لتوليف RNA قصيرة (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) التي تحتوي على T7 RNA بولميراز. إضافة 1 M ATP، 1 M CTP، 1 m م GTP، 0.8 mM UTP، 0.2 m UTP-Alexa488، 1.8 mtrimethylguanosine كاب التناظرية (m3^2،2،7G (5')ppp(5')G)، 1 مل من الحمض النووي الريبي المانع و 500-700 نانوغرام من قالب الحمض النووي لخليط التفاعل والحضانة في 37 درجة مئوية.
4. إضافة 1 μL (2U) من DNase في رد الفعل والحضانة لمدة 15 دقيقة إضافية عند 37 درجة مئوية.
5. عزل snRNA عن طريق استخراج الفينول الحمضية / الكلوروفورم. إزالة مرحلة المياه العليا وإضافة 1/10 من الحجم الأصلي من خلات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة = 5.2)، 3 ميكرولتر من الجليكوجين لتحسين التصور بيليه و 2.5 كميات من الإيثانول 100٪. حضانة لمدة 1 ساعة في -80 درجة مئوية، الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 14،000 × ز و 4 درجة مئوية.
6. غسل بيليه مع الإيثانول 70٪ وتذوب في 12 درجة مئوية من المياه الخالية من النوكل. وكان العائد المعتاد لالحمض النووي الريبي حوالي 600 نانوغرام/مل. تخزين في -80 درجة مئوية.
7. رصد سلامة snRNAs في المختبر من قبل الكهربائي هلام أغاروز.
8. قبل الحقن المجهري، تخفيف الحمض النووي الريبي إلى التركيز النهائي 200 نانوغرام / مل في الماء الذي يحتوي على 10 ميكروغرام / ميكرولتر dextran-TRITC 70 كيلودا.

2. الخلايا

1. قبل الاستخدام، علاج الأغطية مع 1 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 1 ساعة، وغسل جيدا في الماء المقطر وتخزينها في الإيثانول 100٪. العلاج الحمضي يعزز تصاق الخلايا لمنع تقشير الخلايا أثناء أو بعد الحقن. لتسهيل التعرف على الخلايا المحقونة، استخدم غطاء مع شبكة.
2. بذور HeLa أو غيرها من الخلايا الملتصقة 1 يوم قبل الحقن المجهري على الأغطية 12 ملم (رقم 1 أو رقم 1.5) للوصول إلى 50٪ الملاءمة في وقت الحقن المجهري.

3. حقن

ملاحظة: تم حقن خلايا HeLa الدقيقة في وسيط النسر المعدل في دولبيكو (D-MEM، 4.5 غرام / لتر D-الجلوكوز التي تحتوي على الفينول الأحمر والمضادات الحيوية). تم الحقن باستخدام حاقن وميكرومنبولاتور مجهزة بإبرة معقمة (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). تم تسخين نظام المتلاعب المجهري/المجهري بأكمله إلى 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة على الأقل لمنع تقلب الأجزاء الفردية من المجهر والحقن الدقيق.

1. وضع طبق بيتري (30 ملم) التي تحتوي على 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة مع غطاء في الوسط في حامل المجهر. تحميل 3 ميكرولتر من خليط snRNA في الإبرة باستخدام محمل صغير. تثبيت الإبرة في حامل الحاقن الصغير في 45 درجة فيما يتعلق بسطح طبق بيتري.
2. للعثور على الإبرة، استخدم هدف المسافة الطويلة 10x. أولا، تعيين سرعة الخشنة على حاقن وخفض الإبرة حتى يمس وسط الثقافة. باستخدام مناظير المجهر، والعثور على بقعة مشرقة، وهو المكان الذي تلمس الإبرة وسط الثقافة.
3. تغيير السرعة إلى FINE ومزيد من خفض الإبرة أثناء النظر في المجهر حتى يتم ملاحظة غيض من الإبرة. نقل الإبرة في منتصف المجال البصري والتبديل إلى هدف مسافة طويلة 40X.
4. بعد تغيير الهدف، حدد الخلية ونقل الإبرة فوق هذه الخلية. تعيين الضغوط والوقت لجهة اتصال الخلية (راجع تلميحات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في المناقشة).
5. نقل الإبرة إلى أسفل في الخلية ومن ثم تعيين الحد الأدنى على micromanipulator. يجب الحرص على عدم تحريك الإبرة تحت الخلية.
6. بعد تعيين الحد الأدنى، حرك الإبرة مرة أخرى فوق الخلية واضغط على زر الحقن على عصا التحكم في حاقن. الإبرة تتحرك تلقائيا داخل الخلية إلى المكان حيث يتم تعيين الحد وحقن خليط RNA.
7. لإنهاء، اضغط على زر MENU على حاقن وإزالة الإبرة من حامل. ثم قطع الأنبوب عن حاقن قبل إيقاف عن طريق الحقن وmicromanipulator.

4. تثبيت الخلية وتلطيخ

1. بعد الحقن المجهري، والعودة الخلايا في حاضنة CO₂ وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
2. بعد الحضانة، شطف الخلايا ثلاث مرات مع الفوسفات المخزنة محلول ملحي (PBS) في درجة حرارة الغرفة، وإصلاح لمدة 20 دقيقة مع 4٪ paraformaldehyde في 0.1 M الأنابيب درجة الحموضة 6.9، وغسل ثلاث مرات مع درجة حرارة الغرفة PBS. إذا تم تحليل توطين snRNA فقط، شطف الخلايا لفترة وجيزة في الماء وجبل في وسط تصاعد مع DAPI.
3. في حالة توطين البروتين إضافية، نفاذية الخلايا مع 0.5٪ تريتون-X100 في PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاثة شطف مع PBS، حضانة الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية وبعد الغسل النهائي في PBS وشطف قصيرة في الماء، جبل في وسط تصاعد مع DAPI.

5. الفحص المجهري

1. إذا لم يتم تصويرها مباشرة بعد التركيب، قم بتخزين الشرائح عند درجة حرارة 4 درجة مئوية حتى التصوير.
2. الحصول على الصور باستخدام نظام مجهري الفلورة الراقية مجهزة بهدف الغمر (60X أو 100x/1.4NA).
3. مرة واحدة يتم تحديد الخلايا الدقيقة، وجمع كومة من 20 z-المقاطع مع 200 نانومتر ز الخطوات لكل عينة وتخضع للdeconvolution الرياضية. ثم قُدمت إسقاطات قصوى أو أكوام z فردية.
4. لتحديد إشارة الفلورسنت، ارسم منطقة الاهتمام حول جسم كاجال الذي تم تحديده بواسطة تلطيخ المناعة من اللفائفي. قياس شدة إشارة snRNA في عائد الاستثمار تعريف اللفائف. بعد ذلك تحديد شدة الفلورة snRNA في ROI وضعت عشوائيا في النيوكليوبلازما وحساب نسبة إشارة الحمض النووي الريبي في الجسم Cajal والنيوكليوبلاسما.

النتائج

لمراقبة توطين snRNA ودور موقع الربط SM في استهداف الجسم Cajal، قمنا بإعداد قالب الحمض النووي الذي يحتوي على المروج T7 وإما كامل طول U2 snRNA أو U2 snRNA تفتقر إلى النيوكليوتيدات السبعة (AUUUUUG) تشكيل موقع الربط SM. [سنّرنا] كان في مختبرة منقولة, يعزل ويمزج مع [تريستك]-يضمّ [دإكسترن-70كد]. قمنا بحقن الخليط الذي يح...

Discussion

لقد استخدمنا الحقن الدقيق للسنRNAs التي تحمل علامة الفلورسنت لتحديد التسلسلات الهامة لتوطين الرنا في أجسام كاجال النووية. نظرًا لإعداد RNAs المسمى بسرعة وبساطة (إعداد قالب الحمض النووي من قبل PCR متبوعاً بالنسخ في المختبر) تقدم الطريقة تحليلاً فعالاً لكيفية مساهمة التسلسلات المختلفة في توطين...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%