ניתוח של לוקליזציה של הספולקסיזומאואליזציה של האדם בתאי הלה באמצעות מיקרו הזרקה

Summary

ביוגנזה של snRNAs של הספנסאוסיס הוא תהליך מורכב הכולל תאים סלולריים שונים. כאן, אנחנו המועסקים מיקרוהזרקה של מתויג באמצעות שוכרים snRNAs כדי לפקח על ההובלה שלהם בתוך התא.

Abstract

ביוגנזה של snRNAs התחתית הוא תהליך מורכב הכרוך הן בשלבים גרעינית, cytoplasmic והשלב האחרון מתרחש בתוך תא גרעיני בשם הגוף Cajal. עם זאת, רצפים הישירים לוקליזציה snRNA למבנה זה תת גרעיני לא ידוע עד לאחרונה. כדי לקבוע רצפים חשובים עבור הצטברות של snRNAs בגופים Cajal, אנו המועסקים מיקרוהזרקה של מתויג באמצעות שלהם snRNAs ואחריו הלוקליזציה שלהם בתוך תאים. ראשית, הכנו snRNA מוטנטים מוטציות, מסונתז תבניות דנ א עבור תמלול ושעתוק והעתק snRNAs בנוכחות של UTP ביחד עם Alexa488. מתויג snRNAs היו מעורבים עם 70 kDa-Dextran מצועם TRITC, ו מיקרווזרק לגרעין או ציטופלסמה של תאי הלה האדם. תאים היו מודבטים עבור 1 h ו קבוע את הסמן הגוף Cajal לאסוף היה דמיינו על ידי immunofluorescence עקיף, בעוד snRNAs ו dextran, אשר משמש כסמן של הזרקה גרעינית או cytoplasmic, נצפו ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית. שיטה זו מאפשרת בדיקה יעילה ומהירה של איך רצפים שונים להשפיע לוקליזציה RNA בתוך תאים. כאן, אנו מראים את החשיבות של רצף מחייב-Sm ללוקליזציה יעיל של snRNAs לתוך הגוף Cajal.

Introduction

שחבור ה-RNA הוא אחד השלבים הקריטיים בביטוי הגנים, אשר מזרז על ידי מתחם ribonucleoprotein גדול הנקרא מתחת לתחתית. בסך הכל, יותר מ 150 חלבונים ו-5 RNAs גרעיני קטן (snRNAs) משולבים לתוך מתחת שלבים בשלבים שונים של המסלול השחבור. U1, U2, U4, U5 ו U6 snRNAs משתתפים בהשתתפות של introns הגדולות גו-AG. SnRNAs אלה להצטרף המאחדים כמו טרום בנוי חלקיקים גרעיניים גרעינית קטנה (Snrnas) המכילים snRNA, שבעה חלבונים Sm הקשורים snRNA (או כמו-Sm חלבונים, אשר מקשרים עם U6 snRNA) ו 1-12 חלבונים ספציפיים עבור כל Snrnas.

הרכבת של snRNPs כוללת cytoplasmic ושלבים גרעיניים. שופץ לאחרונה snRNA מיוצא אל הציטופלסמה שבו הוא רוכש טבעת שנאספו מתוך שבעה חלבונים Sm. הטבעת Sm משמש לאחר מכן כאות לייבא snRNA מחדש חזרה לגרעין. SnRNAs פגומים שאינם משייכים עם חלבונים Sm נשמרים בציטופלסמה¹. מיובא snrnps החדש להופיע לראשונה בגוף cajal שבו הם פוגשים snrnps-ספציפיים חלבונים ולסיים את ההבשלה שלהם (נבדקו בהתייחסות^2,3). לאחרונה הראינו כי עיכוב של שלבי ההבשלה הסופי תוצאות בקיבוע על של snrnps בוגר בגוף cajal^4,5. הצעת מודל שבו ההבשלה snRNP הסופי הוא תחת שליטה איכותית כי מפקחת תוספת של חלבונים ספציפיים snRNP והיווצרות Snrnp פעיל. עם זאת, פרטים מולקולריים של האופן שבו תאים מבחינים בין חלקיקים בוגרים שאינם מפותחים בצורה נכונה, נותרים חמקמקים.

כדי לקבוע רצפים snRNA כי הם חיוניים עבור המיקוד והצטברות של snRNAs בגופים הגרעין Cajal, החלטנו להעסיק מיקרוהזרקה של הסימון מתויג של snRNAs. מיקרוהזרקה היתה שיטה של בחירה כי: 1) זה לא דורש תג רצף נוסף כדי להבחין snRNAs סינתטי טופס עמיתיהם האנדוגניים שהוא חשוב במיוחד עבור RNAs קצר עם מעט מקום להוספה של רצף תג נוסף; 2) הוא מאפשר ניתוח רצפים החשובים עבור biogenesis. לדוגמה, רצף Sm חיוני להרכבת הטבעת Sm ולייבא מחדש לתוך הגרעין⁶. כאשר snRNAs מבוטא בתא, snRNAs חסר הרצף Sm מושפל בציטופלסמה ולא להגיע הגרעין הגופים Cajal⁷. עם זאת, snRNAs ללא רצף Sm יכול להיות ישירות מיקרו לתוך הגרעין ולכן תפקיד פוטנציאלי של רצף Sm ב Cajal לוקליזציה של הגוף.

כאן, אנו מתארים בפירוט שיטת מיקרו הזרקה שאנו מיושמים כדי לקבוע רצפים snRNA הנחוצים למקד snRNAs לתוך הגוף Cajal⁵. הראנו כי האתרים מחייב Sm ו SMN הם ביחד הכרחי ומספיק כדי להתאים לא רק snRNAs, אך שונים RNAs ללא קידוד קצר לתוך הגוף Cajal. מבוסס על הזרקת מיקרו כמו גם ראיות אחרות, הציעו כי טבעת Sm התאספו על האתר מחייב Sm הוא אות הגוף Cajal לוקליזציה.

Protocol

1. הכנת מיקרונס למיקרו-מזרקה

1. הכנת תבנית DNA המכילה את הגירסה באורך מלא או מעוגל/מוטציה של snRNA על ידי ה-PCR באמצעות ההתקנה הבאה PCR: 98 ° c עבור 60 s, 98 ° צ' עבור 15 s, 68 ° c עבור 30, 72 ° c עבור 1 דקות, 98 ° צ' עבור 15 s עבור 35x , ו 72 ° c עבור 5 דקות.
2. התחל הקדמי חייב להכיל רצף מיזם עבור שעתוק מבחנה בדיוק במעלה הזרם של הנוקלאוטיד הראשון ששועתק. החזק U2 ברצף snRNA באמצעות פריימר קדימה המכיל את היזם T7 ואת פריימר הפוכה, אשר מסתיים עם נוקלאוטיד האחרון העתק (ראה טבלת חומרים לפרטים).
3. סינתזה snRNA באמצעות ערכה עבור סינתזה RNA קצר (ראה טבלת חומרים לפרטים) המכיל T7 RNA פולימראז. להוסיף 1 מ"מ ATP, 1 מ"מ CTP, 1 מ"מ GTP, 0.8 mM UTP, 0.2 mM UTP-Alexa488, 1.8 mM trimethylguanosine כובע אנלוגי (m3^{2, 2, 7}G) ppp (5 ') G), 1 מ ל של מעכב RNA ו 500-700 של תבנית ה-DNA לתערובת התגובה והדגירה ב 37 ° c לילה.
4. הוסף 1 μL (2U) של DNase לתוך התגובה ואת הדגירה עבור 15 דקות נוספות ב 37 ° c.
5. בודד snRNA על ידי מיצוי פנול חומצי/כלורופורם. להסיר את שלב המים העליון ולהוסיף 1/10 של הנפח המקורי של 3 מז נתרן אצטט (pH = 5.2), 3 μL של גליקוגן עבור הדמיית גלולה טובה יותר ו 2.5 כרכים של 100% אתנול. דגירה עבור 1 h ב-80 ° צ', צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 14,000 x g ו 4 ° c.
6. לשטוף את הגלולה עם 70% אתנול ולפזר 12 μL של מים חינם של nuclease. התשואה הרגילה של RNA הייתה סביב 600 ng/mL. חנות ב-80 ° c.
7. עקוב אחר היושרה של העתק מחוץ למבחנה באמצעות מוצרי החשמל של agarose.
8. לפני microinjection, לדלל RNA לריכוז הסופי 200 ng/mL במים המכילים 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa.

2. תאים

1. לפני השימוש, לטפל coverslips עם הHCl 1 M עבור 1 h, לשטוף ביסודיות מים מזוקקים ולאחסן ב 100% אתנול. טיפול חומצי מקדמת תאים הדבקה כדי למנוע פילינג תא במהלך או לאחר ההזרקה. לזיהוי קל יותר של תאים מוזרק, להשתמש coverslip עם רשת.
2. זרע חלה או תאים חסיד אחרים 1 יום לפני מיקרוהזרקה על 12 מ"מ coverslips (מס ' 1 או no. 1.5) כדי להגיע 50% השטף בזמן מיקרוהזרקה.

3. הזרקה

הערה: תאי הלה הוזרקו במדיום הנשר השונה של Dulbecco (D-הגברת, 4.5 g/L D-גלוקוז הכולל אדום פנול ואנטיביוטיקה). הזריקה בוצעה באמצעות מזרק ומיקרומניפולציה מצויד במחט סטרילית (ראה טבלת חומרים לפרטים). מערכת מיקרוסקופית/מיקרומניפולציה שלמה הייתה מחוממת מראש עד 37 ° c לפחות 4 שעות כדי למנוע תנודות של חלקים בודדים של המיקרוסקופ והמיקרו-מזרק.

1. שים את צלחת פטרי (30 מ"מ) המכיל 2 מ ל של מדיית תרבות עם שמיכות באמצע למחזיק של המיקרוסקופ. טען 3 μL של תערובת snRNA לתוך המחט באמצעות microloader. התקינו את המחט למחזיק המיקרו מזרק ב 45 ° ביחס למשטח של צלחת פטרי.
2. כדי למצוא את המחט, להשתמש ביעד 10x במרחק רב. ראשית, להגדיר את מהירות גסה על מזרק ולהוריד את המחט עד שהוא נוגע במדיום התרבות. באמצעות משקפת המיקרוסקופ, למצוא את הנקודה הבהירה, אשר הוא המקום שבו המחט נוגעת במדיום התרבות.
3. לשנות את המהירות לקנס ועוד להנמיך את המחט תוך כדי להסתכל לתוך המיקרוסקופ עד קצה המחט הוא נצפתה. להעביר את המחט באמצע השדה החזותי ולעבור ליעד 40x במרחק רב.
4. לאחר שינוי המטרה, בחר את התא והזז את המחט מעל תא זה. הגדר את הלחצים והזמן עבור איש הקשר של התא (ראה עצות ופתרון בעיות בדיון).
5. הזז את המחט אל התא ולאחר מכן הגדר את המגבלה הנמוכה על המיקרומניפולציה. להיזהר לא להזיז את המחט מתחת לתא.
6. לאחר הגדרת הגבול התחתון, להזיז את המחט בחזרה מעל התא ולחץ על כפתור ההזרקה על מוט ההיגוי של מזרק. המחט נעה באופן אוטומטי בתוך התא למקום שבו המגבלה מוגדר מזריק את תערובת RNA.
7. כדי לסיים, ללחוץ על תפריט הלחצן על מזרק ולהסיר את המחט מן המחזיק. ואז לנתק את הצינורית מן הזרק לפני החלפת מזרק ומיקרומניפולציה.

4. קיבוע תא וצביעת

1. לאחר המיקרו הזרקה, להחזיר את התאים לתוך CO₂ אינקובטור ו-דגירה ב 37 ° c עבור 1 h.
2. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם התמיסה מלוחים באגירה פוספט (PBS) בטמפרטורת החדר, לתקן עבור 20 דקות עם 4% פאראמפורמלדהיד ב 0.1 M צינורות pH 6.9, ולשטוף שלוש פעמים עם טמפרטורת החדר PBS. אם רק snRNA לוקליזציה מנותח, בקצרה לשטוף את התאים במים להר במדיום הרכבה עם DAPI.
3. במקרה של לוקליזציה נוספת של חלבון, החדיר את התאים עם 0.5% טריטון-X100 ב-PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלושה טיפות עם PBS, מודיית את התאים עם נוגדנים הראשי והמשני לאחר שוטף הסופי ב-PBS ושטיפה קצרה במים, הר במדיום גובר עם dapi.

5. מיקרוסקופיה

1. אם לא מתמונה מייד לאחר הטעינה, אחסן את השקופיות ב-4 ° צ' עד להדמיה.
2. לרכוש תמונות באמצעות מערכת מיקרוסקופיים פלואורסצנטית high-end מצויד מטרה טבילה (60X או 100x/1.4 NA).
3. לאחר תאים מיקרו מוזרק מזוהים, לאסוף ערימה של 20 z-סעיפים עם 200 ננומטר z שלבים לכל מדגם ובכפוף לפירוק מתמטי. הוצגו לאחר מכן בתחזיות מכסימלי או בערימות בודדות של z.
4. כדי לכמת את האות פלורסנט, לצייר את אזור הריבית (ROI) סביב גוף Cajal המזוהה על ידי הצווארון החיסוני. למדוד את עוצמת האות snRNA ב-ROI מוגדר האוסף. הבא לקבוע את עוצמת הזריחה snRNA ב ROI באופן אקראי ממוקם בתוך הנואופלזמה ולחשב את היחס של האות RNA של הגוף Cajal ו נוקלאואופלזיה.

תוצאות

כדי לנטר snRNA לוקליזציה ואת התפקיד של האתר מחייב Sm מיקוד הגוף Cajal, הכנו תבנית DNA המכילה את היזם T7 או באורך מלא U2 snRNA או U2 snRNA חסר שבעת נוקלאוטידים (AUUUUUG) להרכיב את האתר מחייב Sm. , מבודדים ומעורבבים בעזרת טריTC. עם דקטרן-70kDa אנו מזריקים את התערובת המכילה בתוך מבחנה מתורבת snRNA לתוך הגרעין או ציטופלסמה ...

Discussion

אנו המועסקים מיקרוהזרקה של המסומנת מתויג snRNAs כדי לקבוע רצפים חשובים עבור snRNA לוקליזציה לתוך הגופים הגרעיניים Cajal. בשל הכנה מהירה ופשוטה למדי של RNAs מתויג (הכנת תבנית ה-DNA על ידי PCR ואחריו שעתוק מבחנה) השיטה מציעה ניתוח אפקטיבי של איך רצפים שונים תורמים ללוקליזציה של RNA. בזמן קצר יחסית, הצלחנו ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%