Analyse de la localisation spliceosomale snRNA dans les cellules humaines d'Hela utilisant la microinjection

Résumé

La biogenèse des snRNAr spliceosomal est un processus complexe impliquant divers compartiments cellulaires. Ici, nous avons utilisé la microinjection de snRNAs fluorescents afin de surveiller leur transport à l'intérieur de la cellule.

Résumé

La biogenèse des snRNAr spliceosomal est un processus complexe impliquant des phases nucléaires et cytoplasmiques et la dernière étape se produit dans un compartiment nucléaire appelé le corps de Cajal. Cependant, les séquences qui dirigent la localisation de l'ARNs dans cette structure sous-nucléaire n'ont pas été connues jusqu'à récemment. Pour déterminer des séquences importantes pour l'accumulation des snRNAs dans les corps de Cajal, nous avons employé la microinjection des snRNAs fluorescents étiquetés suivis de leur localisation à l'intérieur des cellules. Tout d'abord, nous avons préparé des mutants de suppression de snRNA, synthétisé des modèles d'ADN pour la transcription in vitro et snRNAs transcrits en présence de l'UTP couplé avec Alexa488. Les snARN étiquetés ont été mélangés avec 70 kDa-Dextran conjugués avec TRITC, et microinjectés au noyau ou au cytoplasme des cellules humaines de HeLa. Les cellules ont été incubées pendant 1 h et fixes et la coiline de marqueur de corps de Cajal a été visualisée par immunofluorescence indirecte, alors que les snARN et le dextran, qui sert de marqueur de l'injection nucléaire ou cytoplasmique, ont été observés directement utilisant une microscope fluorescence. Cette méthode permet des tests efficaces et rapides de la façon dont diverses séquences influencent la localisation de l'ARN à l'intérieur des cellules. Ici, nous montrons l'importance de la séquence Sm-contraignante pour une localisation efficace des arnaques dans le corps cajal.

Introduction

L'épissage de l'ARN est l'une des étapes cruciales dans l'expression des gènes, qui est catalysée par un grand complexe de ribonucléoprotéines appelé l'épiscédsome. Au total, plus de 150 protéines et 5 petits ARN nucléaires (ARNN) sont intégrés dans l'épisséoce à différents stades de la voie d'épissage. Les snRNAS U1, U2, U4, U5 et U6 participent à l'épissage des principaux introns GU-AG. Ces snRNAs se joignent à l'épiscédsome comme petites particules de ribonucléoprotéines nucléaires préformées (snRNPs) qui contiennent de l'ARNs, sept protéines Sm associées à l'ARSS (ou protéines Like-Sm, qui s'associent à l'ARNT U6) et 1-12 protéines spécifiques pour chaque snRNP.

L'assemblage des snRNPs implique des étapes cytoplasmiques et nucléaires. L'ARS nouvellement transcrit est exporté vers le cytoplasme où il acquiert un anneau assemblé à partir de sept protéines Sm. L'anneau Sm sert par la suite de signal pour la réimportation de l'ARNds vers le noyau. Les snARN défectueux qui ne s'associent pas aux protéines Sm sont conservés dans le cytoplasme¹. Les snRNP nouvellement importés apparaissent pour la première fois dans le corps de Cajal où ils rencontrent des protéines spécifiques au snRNP et terminent leur maturation (revue en référence^2,3). Nous avons récemment montré que l'inhibition des étapes finales de maturation entraîne la séquestration des snRNPs immatures dans les corps de Cajal^4,5. Nous avons proposé un modèle où la maturation finale de snRNP est sous contrôle de qualité qui surveille l'addition des protéines snRNP-spécifiques et la formation des snRNPs actifs. Cependant, les détails moléculaires de la façon dont les cellules font la distinction entre les particules matures et immatures aberrantes correctement assemblées restent insaisissables.

Pour déterminer les séquences d'ARNs qui sont essentielles pour le ciblage et l'accumulation des ARNs dans les corps nucléaires de Cajal, nous avons décidé d'utiliser la microinjection de snRNAs fluorescents. La microinjection était une méthode de choix parce que : 1) il ne faut pas une étiquette de séquence supplémentaire pour distinguer les snRNAs synthétiques forment leurs homologues endogènes qui est particulièrement important pour les ARN courts avec peu d'espace pour l'insertion de séquence supplémentaire d'étiquette ; 2) il permet l'analyse des séquences qui sont importantes pour la biogenèse. Par exemple, la séquence Sm est essentielle pour l'assemblage de l'anneau Sm et la réimportation dans le noyau⁶. Lorsque les snRNAS sont exprimés dans la cellule, les snRNAs dépourvus de la séquence Sm sont dégradés dans le cytoplasme et n'atteignent pas le noyau et les corps cajal⁷. Cependant, les snRNAs sans la séquence Sm peuvent être directement microinjectés dans le noyau et donc un rôle potentiel de la séquence Sm dans la localisation du corps Cajal a été mis en compte.

Ici, nous décrivons en détail une méthode de microinjection que nous avons appliquée pour déterminer les séquences snRNA nécessaires pour cibler les ARNs dans le corps cajal⁵. Nous avons montré que les sites de liaison Sm et SMN sont ensemble nécessaires et suffisants pour localiser non seulement les ARN, mais aussi divers ARN courts non codants dans le corps de Cajal. Sur la base de la microinjection ainsi que d'autres preuves, nous avons proposé que l'anneau Sm assemblé sur le site de liaison Sm est le signal de localisation du corps Cajal.

Protocole

1. Préparation des snARN pour la microinjection

1. Préparer un modèle d'ADN contenant la version intégrale ou tronquée/mutée de l'ARNs par PCR à l'aide d'une configuration PCR suivante : 98 oC pour 60 s, 98 oC pour 15 s, 68 oC pour 30 s, 72 oC pour 1 min, 98 oC pour 15 s pour 35x , et 72 oC pendant 5 min.
2. L'apprêt avant doit contenir une séquence de promoteur pour la transcription in vitro juste en amont du premier nucléotide transcrit. Amplifiez la séquence snRNA de U2 à l'aide de l'amorce avant contenant le promoteur T7 et l'amorce inverse, qui se termine par le dernier nucléotide transcrit (voir tableau des matériaux pour plus de détails).
3. Synthétiser l'ARS à l'aide d'un kit pour la synthèse à court ARN (voir tableau des matériaux pour plus de détails) contenant la polymérase d'ARN T7. Ajouter 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine cap analogue (m3^2,2,7G(5')ppp(5')G), 1 mL d'un inhibiteur d'ARN et 500-700 ng du modèle d'ADN au mélange de réaction et d'incubation à 37 oC pendant la nuit.
4. Ajouter 1 l (2U) de DNase dans la réaction et couver pendant 15 min supplémentaires à 37 oC.
5. Isoler le snRNA par extraction acide de phénol/chloroforme. Retirez la phase supérieure de l'eau et ajoutez 1/10 du volume initial de 3 M d'acétate de sodium (pH à 5,2), 3 l de glycogène pour une meilleure visualisation des granulés et 2,5 volumes d'éthanol à 100 %. Incuber pendant 1 h à -80 oC, centrifugeuse pendant 10 min à 14 000 x g et 4 oC.
6. Laver la pastille avec 70 % d'éthanol et dissoudre dans 12 L d'eau exempte de nucléane. Le rendement habituel d'ARN était d'environ 600 ng/mL. Conserver à -80 oC.
7. Surveiller l'intégrité des snARN transcrits in vitro par électrophores de gel d'agarose.
8. Avant la microinjection, diluer l'ARN jusqu'à la concentration finale de 200 ng/mL dans de l'eau contenant 10 g/L dextran-TRITC 70 kDa.

2. Cellules

1. Avant l'utilisation, traiter les rémaquilles avec 1 M HCl pendant 1 h, laver soigneusement dans de l'eau distillée et les conserver dans 100 % d'éthanol. Le traitement acide favorise l'adhérence des cellules pour empêcher l'épluchage cellulaire pendant ou après l'injection. Pour une identification plus facile des cellules injectées, utilisez un bordereau avec une grille.
2. HeLa de graine ou d'autres cellules adhérentes 1 jour avant la microinjection sur des couvertures de 12 mm (no 1 ou no. 1.5) pour atteindre 50% de confluency au moment de la microinjection.

3. Injection

REMARQUE: Les cellules HeLa ont été microinjectées dans le médium d'aigle modifié du Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-glucose contenant du rouge phénol et des antibiotiques). L'injection a été effectuée à l'aide d'un injecteur et d'un micromanipulateur équipé de l'aiguille stérile (voir tableau des matériaux pour plus de détails). L'ensemble du système microscopique/micromanipulateur a été préchauffé à 37 oC pendant au moins 4 h afin d'éviter la fluctuation des différentes parties du microscope et du micro-injecteur.

1. Mettre le plat Petri (30 mm) contenant 2 ml de milieu de culture avec la couverture au milieu dans le support du microscope. Chargez 3 ll de mélange de snRNA dans l'aiguille à l'aide d'un microchargeur. Installez l'aiguille dans le support du micro-injecteur à 45 degrés par rapport à la surface du plat Petri.
2. Pour trouver l'aiguille, utilisez un objectif 10x longue distance. Tout d'abord, définir la vitesse COARSE sur l'injecteur et abaisser l'aiguille jusqu'à ce qu'il touche le milieu de culture. À l'aide des jumelles au microscope, trouver la tache lumineuse, qui est l'endroit où l'aiguille touche le milieu de culture.
3. Changez la vitesse à FINE et abaissez davantage l'aiguille tout en regardant dans le microscope jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille soit observée. Déplacez l'aiguille au milieu du champ visuel et passez à un objectif 40x longue distance.
4. Après avoir changé l'objectif, sélectionnez la cellule et déplacez l'aiguille au-dessus de cette cellule. Définir les pressions et le temps pour le contact cellulaire (voir Conseils et dépannage en discussion).
5. Déplacez l'aiguille vers le bas dans la cellule, puis définir la limite inférieure sur le micromanipulateur. Veillez à ne pas déplacer l'aiguille sous la cellule.
6. Après avoir fixé la limite inférieure, déplacez l'aiguille au-dessus de la cellule et appuyez sur le bouton d'injection sur le joystick de l'injecteur. L'aiguille se déplace automatiquement à l'intérieur de la cellule à l'endroit où la limite est fixée et injecte le mélange d'ARN.
7. Pour finir, appuyez sur le bouton MENU sur l'injecteur et retirez l'aiguille du support. Débranchez ensuite le tube de l'injecteur avant d'éteindre l'injecteur et le micromanipulateur.

4. Fixation cellulaire et coloration

1. Après la microinjection, retourner les cellules dans un incubateur de CO₂ et incuber à 37 oC pendant 1 h.
2. Après l'incubation, rincer les cellules trois fois avec la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à température ambiante, fixer pendant 20 min avec 4% de paraformaldéhyde dans 0.1 M PIPES pH 6.9, et laver trois fois avec la température ambiante PBS. Si seulement la localisation de snRNA est analysée, rincez brièvement les cellules dans l'eau et montez dans un milieu de montage avec DAPI.
3. En cas de localisation supplémentaire des protéines, perméabiliser les cellules avec 0,5% Triton-X100 en PBS pendant 5 min à température ambiante. Après trois rinçaments avec PBS, incuber les cellules avec des anticorps primaires et secondaires et après les lavages finaux en PBS et le rinçament bref dans l'eau, monter dans un milieu de montage avec DAPI.

5. Microscopie

1. S'il n'est pas photographié immédiatement après le montage, rangez les diapositives à 4 oC jusqu'à l'imagerie.
2. Acquérir des images à l'aide d'un système microscopique à fluorescence haut de gamme équipé d'un objectif d'immersion (60X ou 100x/1.4NA).
3. Une fois les cellules microinjectées identifiées, collectez une pile de 20 z-sections avec 200 nm z par échantillon et soumises à une déconvolution mathématique. Des projections maximales ou des piles z individuelles ont ensuite été présentées.
4. Pour quantifier le signal fluorescent, dessinez Région d'intérêt (ROI) autour d'un corps cajal identifié par l'immunostaining de coilin. Mesurez l'intensité du signal snRNA dans le retour sur investissement défini par la bobine. Déterminer ensuite l'intensité de la fluorescence de l'ARNde dans le retour sur investissement placé au hasard dans le nucléoplasme et calculer le rapport de signal d'ARN dans le corps cajal et le nucléoplasme.

Résultats

Pour surveiller la localisation de snRNA et le rôle du site de liaison de Sm dans le ciblage de corps de Cajal, nous avons préparé un modèle d'ADN contenant le promoteur de T7 et l'ARNs de S2 pleine longueur ou le snRNA de U2 manquant les sept nucléotides (AUUUUUG) formant le site de liaison de Sm. les snRNAs ont été transcrits in vitro, isolés et mélangés avec le dextran-70kDa TRITC-coupled. Nous avons microinjecté le mélange contenant l'ARNs transcrit in vitro dans le noyau ou le cytoplasme des cellules de ...

Discussion

Nous avons employé la microinjection des snRNAs fluorescents pour déterminer des séquences importantes pour la localisation de snRNA dans les corps nucléaires de Cajal. En raison de la préparation rapide et assez simple des ARN étiquetés (préparation du modèle d'ADN par PCR suivi de la transcription in vitro), la méthode offre une analyse efficace de la façon dont les différentes séquences contribuent à la localisation de l'ARN. En relativement peu de temps, nous avons pu analyser dix suppressions ou substi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%