Анализ Spliceosomal snRNA Локализация в клетках гели человека с использованием микроинъекции

Резюме

Биогенез spliceosomal snRNAs является сложным процессом с участием различных клеточных отсеков. Здесь мы использовали микроинъекцию флуоресцентно маркированных snRNAs для того, чтобы контролировать их транспортировку внутри клетки.

Аннотация

Биогенез spliceosomal snRNAs представляет собой сложный процесс, включающий как ядерные, так и цитоплазмические фазы, и последний шаг происходит в ядерном отсеке под названием тело Каджала. Однако последовательности, которые направляют локализацию snRNA в эту субнуклеарную структуру, не были известны до недавнего времени. Для определения последовательностей, важных для накопления snRNA в телах Cajal, мы использовали микроинъекции флуоресцентно помечены snRNAs следуют их локализации внутри клеток. Во-первых, мы подготовили snRNA удаления мутантов, синтезированные шаблоны ДНК для транскрипции в пробирке и транскрибированные snRNAs в присутствии UTP в сочетании с Alexa488. Маркированные snRNAs были смешаны с 70 kDa-Dextran спрягались с TRITC, и микровводили к ядру или цитоплазме клеток человека HeLa. Клетки были инкубированы в течение 1 ч и фиксированной и cajal маркер каулин был визуализирован косвенным иммунофлуоресценции, в то время как snRNAs и dextran, который служит маркером ядерной или цитоплазматической инъекции, наблюдались непосредственно с помощью флуоресценционного микроскопа. Этот метод позволяет эффективно и быстро проверить, как различные последовательности влияют на локализацию РНК внутри клеток. Здесь мы показываем важность Последовательности Sm-связывания для эффективной локализации snRNAs в тело Cajal.

Введение

РНК сращивания является одним из важнейших шагов в экспрессии генов, который катализируются большой рибонуклеопротеин комплекс называется spliceosome. В общей сложности, более 150 белков и 5 небольших ядерных РНК (SnRNAs) интегрированы в spliceosome на различных стадиях сплайсинга пути. U1, U2, U4, U5 и U6 snRNA участвуют в сращивании крупных интронов GU-AG. Эти snRNAs присоединиться к spliceosome как предварительно сформированные небольшие частицы ядерного рибонуклеопротеина (snRNPs), которые содержат snRNA, семь Sm белков, связанных с snRNA (или Like-Sm белков, которые ассоциируются с U6 snRNA) и 1-12 белков, специфичных для каждого snRNP.

Сборка snRNPs включает цитоплазмамические и ядерные этапы. Недавно транскрибируемая snRNA экспортируется в цитоплазму, где она приобретает кольцо, собранное из семи белков Sm. Кольцо Sm впоследствии служит сигналом для повторного импорта snRNA обратно в ядро. Дефектные snRNAs, которые не связаны с белками Sm сохраняются в цитоплазме¹. Недавно импортированные snRNPs впервые появляются в организме Cajal, где они отвечают snRNP-специфических белков и закончить их созревания (рассмотрено в ссылке^2,3). Недавно мы показали, что ингибирование окончательных шагов созревания приводит к секвестрации незрелых snRNPs в телах Cajal^4,5. Мы предложили модель, в которой окончательное созревание snRNP находится под контролем качества, который отслеживает добавление белков, специфических snRNP, и формирование активных snRNPs. Однако молекулярные детали того, как клетки различают правильно собранные зрелые и аномальные незрелые частицы, остаются неуловимыми.

Для определения последовательностей snRNA, которые необходимы для ориентации и накопления snRNAs в ядерных телах Cajal, мы решили использовать микроинъекцию флуоресцентно маркированных snRNAs. Микроинъекция была методом выбора, потому что: 1) она не требует дополнительной последовательности тега, чтобы различать синтетические snRNAs форме их эндогенных аналогов, что особенно важно для коротких РНК с небольшим пространством для включения дополнительных последовательность тегов; 2) он позволяет анализе последовательностей, которые важны для биогенеза. Например, последовательность Sm имеет важное значение для сборки кольца Sm и реимпорта в ядро⁶. Когда snRNAs выражены в клетке, snRNAs не хватает Sm последовательность деградируют в цитоплазме и не достигают ядра и Cajal органов⁷. Тем не менее, snRNAs без последовательности Sm может быть непосредственно микровисван в ядро и, таким образом, потенциальную роль последовательности Sm в локализации тела Cajal анализ.

Здесь мы подробно описываем метод микроинъекций, который мы применили для определения последовательностей snRNA, необходимых для целевой snRNAs в тело Cajal⁵. Мы показали, что Sm и SMN связывания сайты вместе необходимы и достаточны для локализации не только snRNAs, но различные короткие некодирования РНК в тело Cajal. Основываясь на микроинъекциях, а также других доказательствах, мы предположили, что кольцо Sm, собранное на месте связывания Sm, является сигналом локализации тела Cajal.

протокол

1. Подготовка срнНА для микроинъекций

1. Подготовьте шаблон ДНК, содержащий полнометражную или усеченную/мутировавую версию snRNA по PcR, используя следующую установку ПЦР: 98 градусов по Цельсию для 60 с, 98 градусов по Цельсию для 15 с, 68 градусов по Цельсию на 30 с, 72 кс на 1 мин, 98 градусов по Цельсию для 15 s для 35x , и 72 кк в течение 5 мин.
2. Передняя грунтовка должна содержать последовательность промоутера для транскрипции in vitro только вверх по течению первого транскрибированного нуклеотида. Усиль u2 snRNA последовательности с помощью переднего грунтовки, содержащей промоутер T7 и обратный грунтовка, которая заканчивается с последней транскрибированной нуклеотидов (см. Таблица материалов для деталей).
3. Синтезировать snRNA с помощью комплекта для короткого синтеза РНК (см. Таблица материалов для деталей), содержащих T7 РНК-полимераза. Добавить 1 мМ АТП, 1 мМ CTP, 1 мМ GTP, 0,8 мМ UTP, 0,2 мМ UTP-Alexa488, 1,8 мм триметилгуанозин колпачок аналог (m3^2,2,7G (5')ppp (5')G), 1 мл ингибитора РНК и 500-700 нг шаблона ДНК в реакционную смесь и в ночь на 3.
4. Добавьте 1 кЛ (2U) DNase в реакцию и инкубировать в течение дополнительных 15 минут при 37 градусах Цельсия.
5. Изолировать snRNA путем экстракта кислой фенола/хлороформа. Удалите верхнюю фазу воды и добавьте 1/10 исходного объема 3 М ацетата натрия (рН 5,2), 3 Л гликогена для лучшей визуализации гранул и 2,5 тома 100% этанола. Инкубировать в течение 1 ч при -80 градусах По цельсии, центрифуге в течение 10 мин при 14 000 х г и 4 градусах Цельсия.
6. Вымойте гранулы с 70% этанола и растворить в 12 зл и без нуклеазы воды. Обычный выход РНК был около 600 нг/мл. Хранить при -80 градусах по Цельсию.
7. Мониторинг целостности in vitro транскрибированных snRNAs агарозным гелем электрофорезами.
8. Перед микроинъекцией разбавить РНК до конечной концентрации 200 нг/мл в воде, содержащей 10 мкг/л dextran-TRITC 70 кДА.

2. Клетки

1. Перед использованием, лечить крышки с 1 M HCl в течение 1 ч, тщательно промыть в дистиллированной воде и хранить в 100% этанола. Кислотное лечение способствует спарению клеток, чтобы предотвратить клеточный пилинг во время или после инъекции. Для облегчения идентификации инъекционных клеток используйте крышку с сеткой.
2. Семена HeLa или других клеток адептов за 1 день до микроинъекции на 12 мм крышки (No 1 или No 1.5) достигают 50% стопроцентности во время микроинъекции.

3. Инъекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HeLa были микровводились в модифицированный eagle Medium Dulbecco (D-MEM, 4.5 г/L D-глюкозы, содержащей фенол красный и антибиотики). Инъекция проводилась с помощью инжектора и микроманипулятора, оснащенного стерильной иглой (подробнее см. Таблицу Материалов). Вся микроскопическая/микроманипуляторная система была предварительно нагрета до 37 градусов по Цельсию в течение по крайней мере 4 ч для предотвращения колебаний отдельных частей микроскопа и микроинжектора.

1. Положите чашку Петри (30 мм), содержащую 2 мл культурных носителей с обложкой в середине в держатель микроскопа. Загрузите 3 злимых срнРН смеси в иглу с помощью микрозагрузчика. Установите иглу в держатель микроинжектора в 45 "по отношению к поверхности чашки Петри.
2. Чтобы найти иглу, используйте 10-раз дальний объектив. Во-первых, установите скорость COARSE на инжектор и опустите иглу, пока она не коснется среды культуры. Используя бинокули микроскопа, найдите яркое пятно, которое является местом, где игла касается культуры среды.
3. Изменение скорости на FINE и дальнейшего снижения иглы при взгляде в микроскоп, пока кончик иглы наблюдается. Переместите иглу в середине поля зрения и переключитесь на 40-ю цель на большие расстояния.
4. После изменения цели, выберите ячейку и переместить иглу над этой клеткой. Установите давление и время для контакта клетки (см. Советы и устранение неполадок в обсуждении).
5. Переместите иглу вниз в ячейку, а затем установите нижний предел на микроманипуляторе. Будьте осторожны, чтобы не переместить иглу ниже клетки.
6. После установки нижнего предела, переместить иглу обратно выше клетки и нажмите кнопку инъекции на джойстик инжектор. Игла автоматически перемещается внутри клетки к месту, где установлен предел, и вводит РНК-смесь.
7. Чтобы закончить, нажмите кнопку MENU на инжектор и удалить иглу из держателя. Затем отключите трубку от инжектора, прежде чем выключить инжектор и микроманипулятор.

4. Фиксация и окрашивание клеток

1. После микроинъекции верните клетки в инкубатор CO₂ и инкубируют при 37 градусах по Цельсию в течение 1 ч.
2. После инкубации, промыть клетки три раза с фосфатом буферного солей (PBS) при комнатной температуре, исправить в течение 20 мин с 4% параформальдегида в 0,1 м PIPES pH 6,9, и мыть три раза с комнатной температурой PBS. Если анализировать только локализацию snRNA, ненадолго промойте клетки в воде и установите в монтажной среде с помощью DAPI.
3. В случае дополнительной локализации белка, permeabilize клетки с 0,5% Triton-X100 в PBS в течение 5 минут при комнатной температуре. После трех полосканий с PBS, инкубировать клетки с первичными и вторичными антителами и после окончательного мойка в PBS и краткопромыть в воде, монтировать в монтажной среде с DAPI.

5. Микроскопия

1. Если не изображен сразу после монтажа, хранить слайды на 4 градусов по Цельсию до изображения.
2. Приобретайте изображения с помощью высококлассной микроскопической системы флуоресценции, оснащенной целью погружения (60X или 100x/1.4NA).
3. После того, как микроинъекционные клетки определены, собрать стек из 20 z-секций с 200 нм z шаги на образец и при условии математического деконволуции. Затем были представлены максимальные прогнозы или отдельные стеки z.
4. Чтобы количественно флуоресцентный сигнал, нарисуйте Регион интереса (ROI) вокруг тела Cajal, идентифицированного путем иммуностоинга катушки. Измерьте интенсивность сигнала snRNA в определяемой катушки рентабельности инвестиций. Далее определите интенсивность флуоресценции snRNA в рентабельности инвестиций случайным образом помещается в нуклеоплазму и вычисляйте соотношение РНК-сигнала в теле Каджаля и нуклеоплазме.

Результаты

Для мониторинга локализации snRNA и роли сайта связывания Sm в таргетинге тела Cajal, мы подготовили шаблон ДНК, содержащий промоутер T7 и либо полнометражный U2 snRNA или U2 snRNA, не хватает семи нуклеотидов (AUUUUG), образующих сайт связывания Sm. snRNAs были в пробирке транскрибированы, изолированы и смеш...

Обсуждение

Мы использовали микроинъекцию флуоресцентно маркированных snRNAs для определения последовательностей, важных для локализации snRNA в ядерные тела Cajal. Благодаря быстрой и довольно простой подготовке маркированных РНК (подготовка шаблона ДНК ПЦР с последующим транскрипцией in vitro) метод пре...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%