미세 주입을 사용하여 인간 헬라 세포에서 스플리세오소말 snRNA 국소화 분석

요약

스플리케오소말 snRNA의 생물 발생은 다양한 세포 구획을 포함하는 복잡한 과정입니다. 여기에서, 우리는 세포 안쪽에 그들의 수송을 감시하기 위하여 형광으로 표지된 snRNAs의 마이크로 주입을 이용했습니다.

초록

스플리케오소말 snRNA의 생물 발생은 핵 및 세포질 상과 마지막 단계가 카잘 바디에게 불린 핵 구획에서 생기는 둘 다 관련시키는 복잡한 프로세스입니다. 그러나, 이 비핵화 구조로 snRNA 국소화를 지시하는 서열은 최근까지 알려지지 않았다. Cajal 바디에 있는 snRNAs의 축적을 위해 중요한 순서를 결정하기 위하여는, 우리는 형광으로 표지된 snRNAs의 미세 주입을 세포 안쪽에 그들의 현지화에 선행했습니다. 첫째, 우리는 snRNA 결실 돌연변이를 준비, 생체 외 전사에 대한 DNA 템플릿을 합성하고 Alexa488와 결합 된 UTP의 존재에 snRNAs를 전사. 표지된 스노르나스를 TRITC와 결합한 70 kDa-Dextran과 혼합하고, 인간 HeLa 세포의 핵 또는 세포질에 미세주입하였다. 세포는 1시간 동안 배양하고 고정하고 카잘 체 마커 코일린을 간접 면역형광에 의해 가시화하였고, 핵 또는 세포질 주입의 마커 역할을 하는 snRNA 및 dextran은 형광 현미경을 사용하여 직접 관찰되었다. 이 방법은 다양한 서열이 세포 내부의 RNA 국소화에 미치는 영향을 효율적이고 신속하게 테스트 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 Cajal 바디로 snRNA의 능률적인 현지화를 위한 Sm 결합 순서의 중요성을 보여줍니다.

서문

RNA 접합은 스플리세오좀이라고 불리는 큰 리보뉴클레오단백질 복합체에 의해 촉매되는 유전자 발현의 중요한 단계 중 하나입니다. 총 150개 이상의 단백질과 5개의 작은 핵 RNA(snRNAs)가 접합 경로의 다른 단계에서 스플리세오좀에 통합됩니다. U1, U2, U4, U5 및 U6 snRNAs는 주요 GU-AG 인트론의 접합에 참여하고 있습니다. 이러한 snRNAs는 snRNA, snRNA(또는 U6 snRNA와 연관된 유사 Sm 단백질)와 연관된 7개의 Sm 단백질을 포함하는 미리 형성된 작은 핵 리보핵단백질 입자(snRNPs)와 각 snRNP에 특이적인 1-12개의 단백질로 스플리세오좀을 결합한다.

snRNPs의 집합은 세포질과 핵 단계를 관련시킵니다. 새로 전사된 snRNA는 세포질로 수출되어 7개의 Sm 단백질로부터 조립된 고리를 획득합니다. Sm 링은 이후에 핵으로 다시 수입되는 snRNA에 대한 신호로서 작용한다. Sm 단백질과 연관시키지 못하는 결함이 있는 snRNAs는 세포질1에서 유지됩니다. 새로 수입된 snRNPs는 먼저 snRNP 특이적 단백질을 만나고 그들의 성숙을 완료하는 Cajal바디에서 나타납니다 (참조 2,^3에서검토). 우리는 최근에 최종 성숙 단계의 억제가 카잘 바디4,^5에있는 미성숙한 snRNPs의 격리 귀착된다는 것을 보여주었습니다 . 우리는 최종 snRNP 성숙이 snRNP 특이적 단백질의 추가 및 활성 snRNPs의 형성을 감시하는 품질 관리의 밑에 있는 모형을 제안했습니다. 그러나, 세포가 정확하게 조립된 성숙한 미성숙한 입자를 구별하는 방법의 분자 세부사항은 애매한 남아 있습니다.

핵 카잘 바디에 있는 snRNA의 표적으로 하고 축적을 위해 필수적인 snRNA 순서를 결정하기 위하여는, 우리는 형광으로 표지된 snRNA의 미세 주입을 채택하기로 결정했습니다. 미세 주주사는 선택의 방법이었다: 1) 합성 snRNAs를 구별하기 위해 추가 서열 태그를 필요로하지 않는 것은 여분의 태그 서열의 삽입을위한 작은 공간과 짧은 RNA에 특히 중요하다 자신의 내인성 대응을 형성; 2) 생물 발생에 중요한 서열을 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, Sm 서열은 SM 링 어셈블리및핵6으로 재가져오기에 필수적이다. snRNAs가 세포에서 발현될 때, Sm 서열이 결여된 snRNAs는 세포질에서 분해되고 핵및 카잘 바디 7에 도달하지 않는다. 그러나, Sm 서열이 없는 snRNAs는 핵 내로 직접 미세주입될 수 있고 따라서 Cajal 체국화에서 Sm 서열의 잠재적인 역할은 분석되었다.

여기서, 우리는 카잘 바디 5로 snRNA를 표적으로 하는 데 필요한 snRNA 서열을결정하기 위하여 적용한 미세 주입 방법을 상세히 기술합니다. Sm및 SMN 바인딩 사이트가 함께 필요하고 snRNA뿐만 아니라 다양한 짧은 비 코딩 RNA를 Cajal 본문에 지역화하기에 충분하다는 것을 보여주었습니다. 미세 주입뿐만 아니라 다른 증거에 기초하여, 우리는 SM 결합 부위에 조립 된 SM 링이 Cajal 몸 국소화 신호라고 제안했다.

프로토콜

1. 미세 주입을위한 snRNAs의 준비

1. 다음 PCR 설정을 사용하여 PCR에 의한 snRNA의 전체 길이 또는 잘린/돌연변이 버전을 포함하는 DNA 템플릿을 준비합니다: 60s의 경우 98°C, 15초의 경우 98°C, 30초동안 68°C, 1분동안 72°C, 15초용 98°C35x , 5 분 동안 72 °C.
2. 순방향 프라이머는 제1 전사 뉴클레오티드의 상류에 대한 시험관내 전사에 대한 프로모터 서열을 포함해야 한다. T7 프로모터 및 역프라이머를 함유하는 순방향 프라이머를 사용하여 U2 snRNA 서열을 증폭시키고, 이는 마지막 전사된 뉴클레오티드로 끝난다(자세한 내용은 재료표 참조).
3. T7 RNA 폴리머라제 함유 짧은 RNA 합성을 위한 키트를 사용하여 snRNA를 합성합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0.8 mM UTP, 0.2 mM UTP-Alexa488, 1.8 mM 트리메틸과노신 캡 아날로그(m3^2,2,7G(5')ppp(5')G), RNA 억제제의 1 mL 및 500-700 ng의 DNA 템플릿을 혼합물및 인큐베큐라에 밤새 혼합하여 300-700 ng의 반응및 인큐베이트에.
4. 반응에 DNase 1 μL (2U)를 넣고 37 °C에서 추가로 15 분 동안 배양하십시오.
5. 산성 페놀 /클로로폼 추출에 의해 snRNA를 분리하십시오. 상부 수상을 제거하고 3M 나트륨 아세테이트 (pH = 5.2), 더 나은 펠릿 시각화를위한 글리코겐 3 μL, 100 % 에탄올 2.5 부피의 원래 부피의 1/10을 추가하십시오. -80 °C에서 1 시간 동안 배양하고, 10 분 동안 14,000 x g 및 4 °C에서 원심 분리기를 배양합니다.
6. 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 12 μL의 뉴클레아제 없는 물에 용해시다. 일반적인 RNA 수율은 약 600 ng/mL이었다. -80 °C에서 보관하십시오.
7. 아가로즈 겔 전기 영동에 의한 시험관 내 전사 snRNAs의 무결성을 모니터링합니다.
8. 미세 주입 전에 RNA를 10 μg/μl dextran-TRITC 70 kDa를 함유하는 물에 최종 농도 200 ng/mL로 희석합니다.

2. 세포

1. 사용하기 전에 커버슬립을 1 HCl으로 1 시간 동안 다루고 증류수로 철저히 씻고 100 % 에탄올로 보관하십시오. 산성 처리는 주입 도중 또는 후에 세포 박리를 방지하기 위하여 세포 접착을 승진시냅니다. 주입 된 세포를 쉽게 식별할 수 있도록 그리드가있는 덮개 슬립을 사용하십시오.
2. 종자 HeLa 또는 다른 부착 세포는 미세 주입 시 50 % 동률에 도달하기 위해 12 mm 커버 슬립 (1 번 또는 1.5 호)에 미세 주입 1 일 전에.

3. 주입

참고: HeLa 세포는 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (D-MEM, 4.5 g / L D-포도당 페놀 적색 및 항생제를 함유함)에서 미세 주입되었다. 분사는 멸균 바늘을 장착한 인젝터 및 마이크로조작자를 사용하여 수행하였다(자세한 내용은 재료표 참조). 전체 현미경/미세 조작기 시스템은 현미경 및 마이크로 인젝터의 개별 부분의 변동을 방지하기 위해 적어도 4 시간 동안 37 °C로 예열되었습니다.

1. 2 mL의 배양 배지를 포함하는 페트리 접시(30 mm)를 중간에 커버슬립을 현미경홀더에 넣는다. 마이크로 로더를 사용하여 바늘에 snRNA 혼합물 3 μL을 로드합니다. 페트리 접시의 표면에 대하여 45°의 마이크로 인젝터 홀더에 바늘을 설치합니다.
2. 바늘을 찾으려면 10배 의 장거리 목표를 사용하십시오. 먼저, 인젝터에 속도를 COARSE로 설정하고 배양 배지에 닿을 때까지 바늘을 낮춥시킵니다. 현미경 쌍안경을 사용하여 바늘이 배양 매체에 닿는 곳인 밝은 반점을 찾습니다.
3. 속도를 FINE로 변경하고 바늘 끝이 관찰 될 때까지 현미경을 보면서 바늘을 더 낮춥니다. 시야 중간에 바늘을 이동하고 40 배 장거리 목표로 전환합니다.
4. 목표를 변경한 후 셀을 선택하고 바늘을 이 세포 위로 이동합니다. 셀 접촉에 대한 압력과 시간을 설정합니다(토론의 팁 및 문제 해결 참조).
5. 바늘을 셀로 이동한 다음 미세 조작기의 하한을 설정합니다. 바늘을 세포 아래로 움직이지 않도록 주의하십시오.
6. 하한을 설정한 후 바늘을 셀 위로 뒤로 이동하고 인젝터의 조이스틱에서 주입 버튼을 누릅니다. 바늘은 한계가 설정된 장소로 세포 안쪽으로 자동이동하고 RNA 혼합물을 주입합니다.
7. 완료하려면 인젝터의 버튼 MENU를 누르고 홀더에서 바늘을 제거합니다. 그런 다음 인젝터와 마이크로 매니더를 끄기 전에 인젝터에서 튜브를 분리합니다.

4. 세포 고정 및 염색

1. 미세 주입 후, 세포를 CO2 인큐베이터로 되돌리고 1시간 동안 37°C에서 배양한다.
2. 배양 후, 실온에서 인산완식염액(PBS)으로 세포를 3회 헹구고, 0.1 M PIPES pH 6.9에 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고치고, 실온 PBS로 3회 세척한다. snRNA 국소화만 분석되면, 잠시 물에 세포를 헹구고 DAPI를 가진 마운팅 매체에 장착하십시오.
3. 추가적인 단백질 국소화의 경우, 실온에서 5분 동안 PBS에서 0.5% 트리톤-X100으로 세포를 투과시한다. PBS로 3 번 헹구고 나서, 1 차 및 이차 항체로 세포를 배양하고 PBS에서 최종 헹구고 물에 짧은 헹구고 DAPI를 장착 매체에 장착하십시오.

5. 현미경 검사법

1. 장착 직후에 이미지화되지 않은 경우, 이미징이 될 때까지 슬라이드를 4°C로 보관하십시오.
2. 침수 목표(60X 또는 100x/1.4NA)가 장착된 고급 형광 현미경 시스템을 사용하여 이미지를 수집합니다.
3. 일단 미세 주입된 세포가 확인되면, 견본 당 200 nm z 단계와 20 z 단면도의 스택을 수집하고 수학 적인 deconvolution의 대상이 됩니다. 그런 다음 최대 투영 또는 개별 z 스택을 제시했습니다.
4. 형광 신호를 정량화하려면 코일 면역 염색으로 확인된 카잘 몸 주위의 관심 영역(ROI)을 그립니다. 코일린 정의 ROI에서 snRNA 신호의 강도를 측정합니다. 다음으로 핵소동에 무작위로 배치된 ROI에서 의 snRNA 형광의 강도를 결정하고 카잘 체및 핵소플라즘에서 RNA 신호의 비율을 계산한다.

결과

snRNA 국소화 및 Cajal 바디 표적화에서 Sm 결합 부위의 역할을 모니터링하기 위해, 우리는 Sm 결합 부위를 형성하는 7개의 뉴클레오티드(AUUUUUG)가 결여된 T7 프로모터 및 전신 U2 snRNA 또는 U2 snRNA를 포함하는 DNA 템플릿을 준비하였다. snRNAs는 시험관 내 전사, 고립 및 TRITC 결합 된 덱스트란-70kDa와 혼합되었다. 우리는 체외에서 전사된 snRNA를 HeLa 세포의 핵 또는 세포질로 포함하는 혼합물을 미세주입했습?...

토론

우리는 핵 카잘 바디로 snRNA 현지화를 위해 중요한 순서를 결정하기 위하여 형광표지된 snRNAs의 미세 주입을 이용했습니다. 라벨이 붙은 RNA의 신속하고 다소 간단한 제제로 인해 (PCR에 의한 DNA 템플릿의 준비와 시험관 내 전사) 이 방법은 다양한 서열이 RNA 국소화에 어떻게 기여하는지에 대한 효과적인 분석을 제공합니다. 비교적 짧은 시간에, 우리는 U2 snRNA의 10개의 상이한 삭제 또는 치환을 분석?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%