Analyse der Spliceosomalen snRNA-Lokalisierung in menschlichen Hela-Zellen mit Mikroinjektion

Zusammenfassung

Biogenese von spliceosomals snRNAs ist ein komplexer Prozess mit verschiedenen Zellkompartimenten. Hier haben wir Mikroinjektionen von fluoreszierend gekennzeichneten snRNAs eingesetzt, um deren Transport innerhalb der Zelle zu überwachen.

Zusammenfassung

Die Biogenese von spliceosomalen snRNAs ist ein komplexer Prozess, der sowohl nukleare als auch zytoplasmatische Phasen einbezieht, und der letzte Schritt findet in einem nuklearen Kompartiment namens Cajal-Körper statt. Sequenzen, die eine direkte snRNA-Lokalisierung in diese subnukleare Struktur direkt machen, sind jedoch bis vor kurzem nicht bekannt. Um Sequenzen zu bestimmen, die für die Akkumulation von snRNAs in Cajal-Körpern wichtig sind, verwendeten wir mikroinjection von fluoreszierend markierten snRNAs, gefolgt von ihrer Lokalisierung in Zellen. Zuerst bereiteten wir snRNA-Deletionsmutanten, synthetisierte DNA-Vorlagen für die In-vitro-Transkription und transkribierte SnRNAs in Gegenwart von UTP in Verbindung mit Alexa488. Beschriftete snRNAs wurden mit 70 kDa-Dextran konjugiert mit TRITC gemischt und mikroinjiziert in den Kern oder das Zytoplasma menschlicher HeLa-Zellen. Die Zellen wurden für 1 h inkubiert und fixiert und das Cajal-Körpermarker-Spulen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz visualisiert, während SnRNAs und Dextran, die als Marker der nuklearen oder zytoplasmatischen Injektion dienen, direkt mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet wurden. Diese Methode ermöglicht effiziente und schnelle Tests, wie verschiedene Sequenzen die RNA-Lokalisierung in Zellen beeinflussen. Hier zeigen wir die Bedeutung der Sm-Bindungssequenz für die effiziente Lokalisierung von snRNAs in den Cajal-Körper.

Einleitung

DIE RNA-Spleißung ist einer der entscheidenden Schritte in der Genexpression, der durch einen großen Ribonukleoprotein-Komplex, das Spleceoom genannt wird, katalysiert wird. Insgesamt sind mehr als 150 Proteine und 5 kleine nukleare RNAs (snRNAs) in verschiedenen Stadien des Spleißwegs in das Spleißmittel integriert. U1, U2, U4, U5 und U6 snRNAs beteiligen sich an der Spleißung großer GU-AG-Introns. Diese snRNAs verbinden das Sifasam als vorgeformte kleine kernnukleare Ribonukleoproteinpartikel (snRNPs), die snRNA, sieben Sm-Proteine enthalten, die mit snRNA (oder Like-Sm-Proteinen, die mit der U6 snRNA assoziiert werden) und 1-12 Proteine, die für jeden snRNP spezifisch sind, assoziiert werden.

Die Montage von snRNPs umfasst zytoplasmatische und nukleare Stadien. Neu transkribierte snRNA wird in das Zytoplasma exportiert, wo sie einen Ring erhält, der aus sieben Sm-Proteinen zusammengesetzt ist. Der Sm-Ring dient anschließend als Signal für den snRNA-Re-Import zurück in den Kern. Defekte snRNAs, die sich nicht mit Sm-Proteinen verbinden, werden im Zytoplasma¹beibehalten. Neu importierte snRNPs erscheinen zuerst im Cajal-Körper, wo sie auf snRNP-spezifische Proteine treffen und ihre Reifung beenden (in Referenz^2,3). Wir haben vor kurzem gezeigt, dass die Hemmung der endgültigen Reifungsschritte zur Sequestrierung unreifer SnRNPs in Cajal-Körpern^4,5führt. Wir haben ein Modell vorgeschlagen, bei dem die endgültige snRNP-Reifung unter Qualitätskontrolle steht, die die Zugabe von snRNP-spezifischen Proteinen und die Bildung aktiver snRNPs überwacht. Molekulare Details darüber, wie Zellen zwischen richtig zusammengesetzten reifen und aberranten unreifen Partikeln unterscheiden, bleiben jedoch schwer fassbar.

Um snRNA-Sequenzen zu bestimmen, die für die Ausrichtung und Akkumulation von snRNAs in nuklearen Cajal-Körpern unerlässlich sind, haben wir beschlossen, Mikroinjektionen von fluoreszierend markierten snRNAs einzusetzen. Microinjection war eine Methode der Wahl, weil: 1) es erfordert keine zusätzliche Sequenz-Tag, um synthetische snRNAs zu unterscheiden bilden ihre endogenen Gegenstücke, die besonders wichtig für kurze RNAs mit wenig Platz für das Einfügen von zusätzlichen Tag-Sequenz ist; 2) es ermöglicht die Analyse von Sequenzen, die für die Biogenese wichtig sind. Beispielsweise ist die Sm-Sequenz für die Sm-Ringmontage und den erneuten Import in den Kern⁶unerlässlich. Wenn snRNAs in der Zelle exprimiert werden, werden snRNAs, denen die Sm-Sequenz fehlt, im Zytoplasma abgebaut und erreichen nicht den Kern und die Cajal-Körper⁷. SnRNAs ohne die Sm-Sequenz können jedoch direkt in den Zellkern injiziert werden und somit eine mögliche Rolle der Sm-Sequenz in der Cajal-Körperlokalisierung sprossiert.

Hier beschreiben wir detailliert eine Mikroinjektionsmethode, die wir angewendet haben, um snRNA-Sequenzen zu bestimmen, die notwendig sind, um snRNAs in den Cajal-Körper⁵zu zielen. Wir haben gezeigt, dass Sm- und SMN-Bindungsstellen zusammen notwendig und ausreichend sind, um nicht nur snRNAs, sondern auch verschiedene kurze nicht-kodierende RNAs in den Cajal-Körper zu lokalisieren. Basierend auf Mikroinjektionen und anderen Beweisen schlugen wir vor, dass der auf der Sm-Bindungsstelle montierte Sm-Ring das Cajal-Körperlokalisierungssignal ist.

Protokoll

1. Herstellung von snRNAs für die Mikroinjektion

1. Erstellen Sie eine DNA-Vorlage mit der abendfüllenden oder abgeschnittenen/mutierten Version von snRNA by PCR unter Verwendung eines folgenden PCR-Setups: 98 °C für 60 s, 98 °C für 15 s, 68 °C für 30 s, 72 °C für 1 min, 98 °C für 15 s für 35x und 72 °C für 5 min.
2. Die Vorwärtsgrundierung muss eine Promotorsequenz für die In-vitro-Transkription vor dem ersten transkribierten Nukleotid enthalten. Verstärken Sie die U2-SnRNA-Sequenz mit dem Vorwärtsprimer, der den T7-Promotor und den Reverse primer enthält, der mit dem letzten transkribierten Nukleotid endet (Details siehe Tabelle der Materialien).
3. Synthesize snRNA mit einem Kit für kurze RNA-Synthese (siehe Tabelle der Materialien für Details), die T7-RNA-Polymerase enthalten. 1 mM ATP hinzufügen, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM Trimethylguanosin-Kappe analog (m3^2,2,7G(5')ppp(5')G), 1 ml eines RNA-Inhibitors und 500-700 ng der DNA-Vorlage zum Reaktionsgemisch und inkubieren bei 37 °C über Nacht.
4. Fügen Sie 1 L (2U) DNase in die Reaktion ein und brüten Sie weitere 15 min bei 37 °C.
5. Isolieren Sie snRNA durch saure Phenol/Chloroform-Extraktion. Entfernen Sie die obere Wasserphase und fügen Sie 1/10 des ursprünglichen Volumens von 3 M Natriumacetat (pH = 5,2), 3 l Glykogen für eine bessere Pellet-Visualisierung und 2,5 Volumen von 100% Ethanol hinzu. 1 h bei -80 °C inkubieren, Zentrifuge 10 min bei 14.000 x g und 4 °C.
6. Das Pellet mit 70% Ethanol waschen und in 12 l nukleasefreiem Wasser auflösen. Die übliche RNA-Ausbeute lag bei rund 600 ng/ml. Bei -80 °C lagern.
7. Überwachen Sie die Integrität von in vitro transkribierten snRNAs durch Agarose-Gel-Elektrophoresen.
8. Vor der Mikroinjektion die RNA auf die Endkonzentration 200 ng/ml in Wasser mit 10 g/l Dextran-TRITC 70 kDa verdünnen.

2. Zellen

1. Vor der Verwendung die Deckellipsen mit 1 M HCl für 1 h behandeln, gründlich in destilliertem Wasser waschen und in 100% Ethanol lagern. Die saure Behandlung fördert die Zellhaftung, um das Zellpeeling während oder nach der Injektion zu verhindern. Um die injizierte Zellen leichter zu identifizieren, verwenden Sie einen Deckschein mit einem Raster.
2. Seed HeLa oder andere anhantibe Zellen 1 Tag vor der Mikroinjektion auf 12 mm Abdeckungen (Nr. 1 oder Nr. 1.5), um 50% Konfluenz zum Zeitpunkt der Mikroinjektion zu erreichen.

3. Injektion

HINWEIS: HeLa-Zellen wurden im modifizierten Eagle Medium des Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-Glucose mit Phenolrot und Antibiotika) mikroinjiziert. Die Injektion erfolgte mit einem Injektor und einem Mikromanipulator, der mit der sterilen Nadel ausgestattet war (Details siehe Materialtabelle). Das gesamte mikroskopische/mikromanipulatorische System wurde mindestens 4 h lang auf 37 °C vorgeheizt, um Schwankungen einzelner Teile des Mikroskops und des Mikroinjektors zu verhindern.

1. Die Petrischale (30 mm) mit 2 ml Kulturmedien mit dem Deckelin in der Mitte in den Halter des Mikroskops geben. Mit einem Mikrolader 3 l snRNA-Mischung in die Nadel geben. Setzen Sie die Nadel in den Halter des Mikroinjektors in 45° in Bezug auf die Oberfläche der Petrischale ein.
2. Um die Nadel zu finden, verwenden Sie ein 10x Langstreckenobjektiv. Stellen Sie zunächst die Geschwindigkeit COARSE auf dem Injektor ein und senken Sie die Nadel, bis sie das Kulturmedium berührt. Finden Sie mit dem Mikroskop-Fernglas den hellen Fleck, der der Ort ist, an dem die Nadel das Kulturmedium berührt.
3. Ändern Sie die Geschwindigkeit auf FINE und senken Sie die Nadel weiter, während Sie in das Mikroskop schauen, bis die Spitze der Nadel beobachtet wird. Bewegen Sie die Nadel in der Mitte des Gesichtsfeldes und wechseln Sie zu einem 40-fachen Langstreckenobjektiv.
4. Nachdem Sie das Ziel geändert haben, wählen Sie die Zelle aus und bewegen Sie die Nadel über diese Zelle. Stellen Sie den Druck und die Zeit für den Zellkontakt ein (siehe Tipps und Fehlerbehebung im Gespräch).
5. Bewegen Sie die Nadel nach unten in die Zelle und setzen Sie dann die untere Grenze für den Mikromanipulator. Achten Sie darauf, die Nadel nicht unter die Zelle zu bewegen.
6. Nachdem Sie die untere Grenze gesetzt haben, bewegen Sie die Nadel wieder über die Zelle und drücken Sie die Injektionstaste am Joystick des Injektors. Die Nadel bewegt sich automatisch innerhalb der Zelle an die Stelle, an der die Grenze gesetzt wird, und injiziert das RNA-Gemisch.
7. Um zu beenden, drücken Sie die Taste MENU auf dem Injektor und entfernen Sie die Nadel aus dem Halter. Trennen Sie dann das Rohr vom Injektor, bevor Sie den Injektor und den Mikromanipulator ausschalten.

4. Zellfixierung und Färbung

1. Nach der Mikroinjektion die Zellen in einen CO2-Inkubator zurückgeben und bei 37 °C für 1 h inkubieren.
2. Nach der Inkubation die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalinelösung (PBS) bei Raumtemperatur abspülen, 20 min mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PIPES pH 6.9 fixieren und dreimal mit Raumtemperatur PBS waschen. Wenn nur die snRNA-Lokalisierung analysiert wird, spülen Sie die Zellen kurz in Wasser aus und montieren Sie sie in einem Montagemedium mit DAPI.
3. Im Falle einer zusätzlichen Proteinlokalisierung permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5% Triton-X100 in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Nach drei Spülungen mit PBS, inkubieren die Zellen mit primären und sekundären Antikörpern und nach dem letzten Spülen in PBS und kurz spülen in Wasser, in einem Montagemedium mit DAPI montieren.

5. Mikroskopie

1. Wenn sie nicht unmittelbar nach der Montage abgebildet werden, lagern Sie die Dias bei 4 °C bis zur Bildgebung.
2. Erfassen Sie Bilder mit einem hochwertigen fluoreszenzmikroskopischen System, das mit einem Tauchobjektiv (60X oder 100x/1.4NA) ausgestattet ist.
3. Sobald mikroinjizierte Zellen identifiziert sind, sammeln Sie einen Stapel von 20 Z-Abschnitten mit 200 nm z Schritten pro Probe und unterliegen mathematischer Dekonvolution. Anschließend wurden maximale Projektionen oder einzelne z-Stacks vorgestellt.
4. Um das fluoreszierende Signal zu quantifizieren, zeichnen Sie Region of Interest (ROI) um einen Cajal-Körper, der durch Coilin-Immunostaining identifiziert wurde. Messen Sie die Intensität des snRNA-Signals im coilindefinierten ROI. Als nächstes bestimmen Sie die Intensität der snRNA-Fluoreszenz im ROI zufällig im Nukleoplasma platziert und berechnen das Verhältnis des RNA-Signals im Cajal-Körper und Nukleoplasma.

Ergebnisse

Um die SnRNA-Lokalisierung und die Rolle der Sm-Bindungsstelle im Cajal-Körper-Targeting zu überwachen, haben wir eine DNA-Vorlage mit dem T7-Promotor und entweder der in voller Länge U2-SnRNA oder U2-SnRNA ohne die sieben Nukleotide (AUUUUUG) vorbereitet, die die Sm-Bindungsstelle bilden. snRNAs wurden in vitro transkribiert, isoliert und mit TRITC-gekoppeltem Dextran-70kDa gemischt. Wir haben das In-vitro-Transkribierte snRNA mikroinjiziert in den Zellkern oder das Zytoplasma von HeLa-Zellen.

Diskussion

Wir verwendeten Mikroinjektionen von fluoreszierend markierten snRNAs, um Sequenzen zu bestimmen, die für die snRNA-Lokalisierung in nuklearen Cajal-Körpern wichtig sind. Durch die schnelle und recht einfache Vorbereitung von markierten RNAs (Vorbereitung der DNA-Vorlage durch PCR gefolgt von In-vitro-Transkription) bietet die Methode eine effektive Analyse, wie verschiedene Sequenzen zur RNA-Lokalisierung beitragen. In relativ kurzer Zeit konnten wir zehn verschiedene Deletionen oder Substitutionen der U2 snRNA analys...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%