マイクロインジェクションを用いたヒトヘラ細胞におけるスプリセオソームsnRNA局在化の解析

要約

スプライセオソームsnRNAの生体発生は、様々な細胞コンパートメントを含む複雑なプロセスである。ここでは、細胞内での輸送を監視するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用しました。

要約

スプライセオソームsnRNAの生体発生は、核相と細胞質相の両方を含む複雑なプロセスであり、最後のステップはCajal体と呼ばれる核コンパートメントで起こる。しかし、この亜核構造にsnRNA局在化を指示する配列は、最近まで知られていなかった。カジャール体内のsnRNAの蓄積に重要な配列を決定するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用し、その後細胞内での局在化を行った。まず、SnRNA欠失変異体、インビトロ転写用の合成DNAテンプレート、およびAlexa488と組み合わせたUTPの存在下で転写されたsnRNAを調製した。標識されたsnRNAをTRITCと共役した70kDa-Dextranと混合し、ヒトHeLa細胞の核または細胞質にマイクロ注入した。細胞を1時間固定して固定し、カジャルボディマーカーコイルリンを間接免疫蛍光で可視化し、核または細胞質注射のマーカーとなるsnRNAとデキストランを蛍光顕微鏡で直接観察した。この方法は、様々な配列が細胞内のRNA局在化にどのように影響するかを効率的かつ迅速にテストすることを可能にします。ここでは、Cajal体内へのSnRNAの効率的なローカリゼーションのためのSm結合配列の重要性を示す。

概要

RNAスプライシングは、遺伝子発現における重要なステップの1つであり、スプライセオソームと呼ばれる大きなリボヌクレオタンパク質複合体によって触媒される。合計で、150以上のタンパク質と5つの小さな核RNA(snRNA)がスプライシング経路の異なる段階でスプライセオソームに統合されています。U1、U2、U4、U5、U6 snRNAは、主要なGU-AGイントロンのスプライシングに参加しています。これらのsnRNAは、snRNAを含む予め形成された小さな核リボヌクレオタンパク質粒子(snRNA)としてスプリセオソームに結合し、snRNAに関連する7つのSmタンパク質(またはU6 snRNAに関連するライクSmタンパク質)および各snRNPに特異的な1-12タンパク質を含む。

snNRPsの組み立てには、細胞質および核段階が含まれる。新たに転写されたsnRNAは細胞質にエクスポートされ、7つのSmタンパク質から組み立てられたリングを獲得する。Smリングは、その後、snRNAを核に再インポートするためのシグナルとして機能します。Smタンパク質と関連付けることができない欠陥のあるsnRNAは、細胞^質1に保持される。新しくインポートされたsnRAPは、まずSnRNP特異的タンパク質を満たし、その成熟を終えるCajal体内に現れ(参照2、3で確認)。我々は最近、最終的な成熟ステップの阻害がCajal体内の未熟なsnNRRpの隔離をもたらすことを示した^4,5.我々は、snRNP特異的タンパク質の添加と活性snRNPの形成を監視する品質管理下にある最終snRNP成熟モデルを提案した。しかし、細胞が正しく組み立てられた成熟粒子と異常な未熟粒子を区別する方法の分子詳細は、依然として不明瞭なままである。

核カジャール体内のsnRNAの標的化と蓄積に不可欠なsnRNA配列を決定するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用することにしました。マイクロインジェクションは、1)合成snRNAを区別するために追加のシーケンスタグを必要としないため、余分なタグ配列を挿入するためのスペースが少ない短いRNAにとって特に重要です。2)それは生体発生のために重要な配列の分析を可能にする。たとえば、Sm シーケンスは Sm リング アセンブリに不可欠であり、核⁶に再インポートします。snRNAが細胞内で発現されると、Sm配列を欠くsnRNAは細胞質中で分解され、核およびCajal^体7に到達しない。しかしながら、Sm配列を持たないSnRNAは、核に直接マイクロ注入することができ、したがって、Cajal体局在化におけるSm配列の潜在的な役割をアッセイする。

ここでは、Cajal本体5にsnRNAを標的にするために必要なsnRNA配列を決定するために適用したマイクロインジェクション法について詳しく説明する。我々は、SmおよびSMN結合部位が一緒に必要であり、SnRNAだけでなく、Cajal本体に様々な短い非コーディングRNAをローカライズするのに十分であることを示した。マイクロインジェクションおよび他の証拠に基づいて、Sm結合部位に組み立てられたSMリングがCajal本体ローカリゼーション信号であることを提案した。

プロトコル

1. マイクロインジェクション用snRNAの調製

1. 次の PCR セットアップを使用して PCR による snRNA の全長または切り捨て/変異バージョンを含む DNA テンプレートを準備する: 60 s の場合は 98 °C、15 s の場合は 98 °C、30 s は 68 °C、1 分間は 72 °C、98 °C は 1 分間、98 °C は 35 倍の場合、および5分間72 °C。
2. 前方プライマーは、最初に転写されたヌクレオチドのちょうど上流のインビトロ転写のためのプロモーター配列を含んでいなければならない。T7プロモーターとリバースプライマーを含むフォワードプライマーを用いてU2 snRNA配列を増幅し、最後に転写されたヌクレオチドで終わる(詳細は材料表を参照)。
3. T7 RNA ポリメラーゼを含む短い RNA 合成キットを使用して snRNA を合成します(詳細については材料表を参照)。1 mM ATP を追加します。 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0.8 mM UTP-Alexa488, 1.8 mM トリメチルグアノシンキャップ類似体 (m3^2,2,7G(5')ppp(5'G), 1 mLのRNA阻害剤と500-700 ngのDNAテンプレートの一晩の反応で°7.
4. 反応にDNaseの1 μL(2U)を加え、37°Cでさらに15分間インキュベートします。
5. 酸性フェノール/クロロホルム抽出によりsnRNAを単離する。トップ水位相を取り除き、3M酢酸ナトリウム(pH= 5.2)の元の体積の1/10、より良いペレット可視化のためのグリコーゲンの3 μL、および100%エタノールの2.5ボリュームを追加します。-80 °Cで1時間、遠心分離機を14,000 x gおよび4°Cで10分間インキュベートする。
6. 70%エタノールでペレットを洗浄し、ヌクレルスフリー水の12 μLに溶解します。通常のRNA収率は約600ng/mLであった。-80 °C.で保存します。
7. アガロースゲル電気泳動によるインビトロ転写snRNAの完全性を監視します。
8. マイクロインジェクションの前に、10 μg/μLデキストラン-TRITC 70 kDaを含む水中の最終濃度200 ng/mLにRNAを希釈する。

2. セル

1. 使用前に、1M HClで1M HClでカバースリップを処理し、蒸留水で十分に洗浄し、100%エタノールで保存します。酸性治療は、注射中または注射後の細胞剥離を防ぐために細胞の接着を促進します。注入された細胞の識別を容易にするために、グリッド付きのカバースリップを使用します。
2. 種子HeLaまたは他の付着細胞は、マイクロインジェクション時に50%の合流性に達する12mmカバースリップ(No.1またはNo.1.5)上のマイクロインジェクションの1日前に。

3. インジェクション

注:HeLa細胞は、ダルベッコの修飾イーグル培地(D-MEM、フェノール赤および抗生物質を含む4.5g/L D-グルコース)にマイクロ注入された。注射は、無菌針を装備したインジェクターとマイクロマニピュレータを用いて行った(詳細は材料表参照)。顕微鏡/マイクロマニピュレータシステム全体を、顕微鏡とマイクロインジェクターの個々の部分の変動を防ぐために、少なくとも4時間37°Cに予熱しました。

1. 2mLの培養培地を含むペトリ皿(30mm)を中央にカバースリップして顕微鏡のホルダーに入れます。マイクロローダーを使用して、3 μLのsnRNA混合物を針にロードします。ペトリ皿の表面に対して45°のマイクロインジェクターのホルダーに針を取り付けます。
2. 針を見つけるには、10倍の長距離目的を使用します。まず、インジェクタの速度をCOARSEに設定し、培養剤に触れるまで針を下げます。顕微鏡双眼鏡を使用して、針が培養培地に触れる場所である明るいスポットを見つけます。
3. 針の先端が観察されるまで顕微鏡を見ながら、針の速度をFINEに変更し、さらに針を下げます。視野の中央に針を移動し、40倍の長距離目標に切り替えます。
4. 目的を変更した後、セルを選択し、このセルの上に針を移動します。セル接触の圧力と時間を設定します (説明のヒントとトラブルシューティングを参照)。
5. 針をセルに下ろし、マイクロマニピュレータの下限を設定します。細胞の下に針を動かさないで下さい。
6. 下限を設定した後、針をセルの上に戻し、インジェクタのジョイスティックのインジェクションボタンを押します。針は、限界が設定された場所に細胞内で自動的に移動し、RNA混合物を注入します。
7. 仕上げるには、インジェクタのボタンMENUを押し、ホルダーから針を取り外します。次に、インジェクタとマイクロマニピュレータをオフにする前に、インジェクタからチューブを取り外します。

4. 細胞の固定と染色

1. マイクロインジェクション後、細胞をCO2インキュベーターに戻し、37°Cで1時間インキュベートする。
2. インキュベーション後、リン酸緩衝生理食液(PBS)で細胞を室温で3回すすいで、0.1 M PIPES pH 6.9で4%のパラホルムアルデヒドで20分間固定し、室温PBSで3回洗浄する。snRNA局在度のみを解析する場合は、細胞を水中で簡単にすすいで、DAPIを使用して取り付け媒体に取り付けます。
3. 追加のタンパク質局在化の場合は、室温で5分間PBSで0.5%トリトン-X100で細胞を透過化します。PBSで3回のリンスの後、一次および二次抗体で細胞をインキュベートし、PBSで最終洗い、水中で短いリンスをした後、DAPIを用いた取り付け媒体に取り付けます。

5. 顕微鏡検査

1. 取り付け直後に画像を撮影しない場合は、画像化するまでスライドを4°Cに保管してください。
2. 没入目的(60Xまたは100x/1.4NA)を備えたハイエンド蛍光顕微鏡システムを使用して画像を取得します。
3. マイクロ注入された細胞が同定されたら、サンプルあたり200 nm zステップで20zセクションのスタックを収集し、数学的な破壊の対象となる。その後、最大投影または個々のzスタックが提示された。
4. 蛍光シグナルを定量化するには、コイル免疫染色によって同定されたカジャル体の周りに関心領域(ROI)を描画します。コイル定義ROIにおけるsnRNA信号の強度を測定します。次に、核内にランダムに配置されたROIにおけるsnRNA蛍光の強度を決定し、Cajal体内および核内のRNAシグナルの比率を計算する。

結果

SnRNA局在化とカジャール体内標的におけるSm結合部位の役割を監視するために、T7プロモーターと全長U2 snRNAまたはU2 snRNAを含むDNAテンプレートを調製し、Sm結合部位を形成する7つのヌクレオチド(AUUUUUG)を欠いている。snRNAは、TRITC結合デキストラン-70kDaとインビトロ転写し、単離され、混合された。インビトロ転写snRNAを含む混合物をHeLa細胞の核または細胞質にマイクロ注入した。

ディスカッション

蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを用い、核カジャール体へのsnRNA局在化に重要な配列を決定した。標識されたRNAの迅速かつかなり単純な調製(PCRによるDNAテンプレートの調製、インビトロ転写)により、この方法は、様々な配列がRNA局在化にどのように寄与するかの効果的な分析を提供します。比較的短時間で、U2 snRNAの10種類の欠損または置換を分析することができました(参?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%