Análisis de la localización de ARNS spliceosomal en células hela humanas con microinyección

Resumen

La biogénesis de los snRNA spliceosomales es un proceso complejo que involucra varios compartimentos celulares. Aquí, empleamos microinyección de nmRNA etiquetados fluorescentemente con el fin de monitorear su transporte dentro de la célula.

Resumen

La biogénesis de los snRNA spliceosomales es un proceso complejo que implica fases nucleares y citoplasmáticas y el último paso se produce en un compartimiento nuclear llamado cuerpo Cajal. Sin embargo, las secuencias que dirigen la localización de ARN SnRNA en esta estructura subnuclear no se han conocido hasta hace poco. Para determinar secuencias importantes para la acumulación de SnRNAs en cuerpos de Cajal, empleamos microinyección de snRNAs etiquetados fluorescentemente seguido de su localización dentro de las células. Primero, preparamos mutantes de eliminación de SnRNA, sintetizamos plantillas de ADN para transcripción in vitro y snRNAs transcritos en presencia de UTP junto con Alexa488. Los snRNA etiquetados se mezclaron con 70 kDa-Dextran conjugados con TRITC, y microinyectados al núcleo o al citoplasma de células HeLa humanas. Las células fueron incubadas durante 1 h y fijas y la bobina marcadora del cuerpo Cajal fue visualizada por inmunofluorescencia indirecta, mientras que los snRNA y el dextran, que sirve como marcador de inyección nuclear o citoplasmamática, se observaron directamente utilizando un microscopio de fluorescencia. Este método permite realizar pruebas eficientes y rápidas de cómo varias secuencias influyen en la localización del ARN dentro de las células. Aquí, mostramos la importancia de la secuencia de encuadernación Sm para la localización eficiente de los snRNAs en el cuerpo de Cajal.

Introducción

El empalme de ARN es uno de los pasos cruciales en la expresión génica, que es catalizado por un gran complejo de ribonucleoproteína llamado spliceosoma. En total, más de 150 proteínas y 5 pequeños ARN nucleares (snRNA) se integran en el espliceosoma en diferentes etapas de la vía de empalme. Los nmarendes U1, U2, U4, U5 y U6 participan en el empalme de los principales intrones GU-AG. Estos snRNAs se unen al spliceosoma como pequeñas partículas de ribonucleoproteína sinformato preformados (snRNPs) que contienen snRNA, siete proteínas Sm asociadas con el ARNs (o proteínas Like-Sm, que se asocian con el ARNS U6) y 1-12 proteínas específicas para cada snRNP.

El montaje de los snRNPs implica etapas citoplasmáticas y nucleares. El ARNN recién transcrito se exporta al citoplasma donde adquiere un anillo ensamblado a partir de siete proteínas Sm. El anillo Sm sirve posteriormente como señal para el ARN SnRNA re-importación de nuevo al núcleo. Los snRNA defectuosos que no se asocian con las proteínas Sm se retienen en el citoplasma^1. Los snRNP recién importados aparecen por primera vez en el cuerpo de Cajal, dondese encuentran con proteínas específicas de snRNP y terminan su maduración (revisada en la referencia 2,^3). Recientemente mostramos que la inhibición de los pasos finales de maduración resulta en el secuestro de snRNPs inmaduros en cuerpos Cajal^4,5. Propusimos un modelo donde la maduración final de snRNP está bajo control de calidad que monitorea la adición de proteínas específicas de snRNP y la formación de snRNPs activos. Sin embargo, los detalles moleculares de cómo las células distinguen entre partículas maduras correctamente ensambladas y aberrantes inmaduras siguen siendo esquivas.

Para determinar las secuencias de ARNQue que son esenciales para la focalización y acumulación de ARNA en cuerpos nucleares de Cajal, decidimos emplear microinyección de snRNA etiquetados fluorescentemente. La microinyección fue un método de elección porque: 1) no requiere una etiqueta de secuencia adicional para distinguir los snRNA sintéticos forman sus homólogos endógenos, lo que es especialmente importante para ARN cortos con poco espacio para la inserción de secuencia de etiquetas adicionales; 2) permite el análisis de secuencias que son importantes para la biogénesis. Por ejemplo, la secuencia Sm es esencial para el montajedel anillo Sm y reimportar en el núcleo 6. Cuando los snRNA se expresan en la célula, los NMNAr que carecen de la secuencia de Sm se degradan en el citoplasma y no alcanzan el núcleo y los cuerpos de Cajal⁷. Sin embargo, los snRNA sin la secuencia Sm se pueden microinyectar directamente en el núcleo y, por lo tanto, se puede ensayar un papel potencial de la secuencia Sm en la localización del cuerpo de Cajal.

Aquí, describimos en detalle un método de microinyección que aplicamos para determinar las secuencias de ARNS necesarios para apuntar a los NMNm en el cuerpo de Cajal⁵. Mostramos que los sitios de unión Sm y SMN son juntos necesarios y suficientes para localizar no sólo los ARN de snRNA, sino varios ARN cortos no codificantes en el cuerpo de Cajal. Basándonos en la microinyección, así como en otras pruebas, propusimos que el anillo Sm ensamblado en el sitio de unión Sm sea la señal de localización del cuerpo Cajal.

Protocolo

1. Preparación de snRNAs para microinyección

1. Preparar una plantilla de ADN que contenga la versión de longitud completa o truncada/mutada de snRNA por PCR utilizando una siguiente configuración de PCR: 98 oC para 60 s, 98 oC para 15 s, 68 oC para 30 s, 72 oC para 1 min, 98 oC para 15 s para 35x , y 72 oC durante 5 min.
2. La imprimación delantera debe contener una secuencia promotora de la transcripción in vitro justo aguas arriba del primer nucleótido transcrito. Amplifique la secuencia de ARN U2 utilizando la imprimación delantera que contiene el promotor T7 y la imprimación inversa, que termina con el último nucleótido transcrito (ver Tabla de Materiales para más detalles).
3. Sintetizar el ARNS utilizando un kit para la síntesis corta de ARN (ver Tabla de Materiales para más detalles) que contiene ARN t7 polimerasa. Añadir 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0.8 mM UTP, 0.2 mM UTP-Alexa488, 1.8 mM tapón de trimetilguanosina analógico (m3^2,2,7G(5')ppp(5')G), 1 mL de un inhibidor de ARN y 500-700 ng de la plantilla de ADN a la mezcla de reacción y la incubación a la noche a 37.
4. Añadir 1 l (2U) de DNase en la reacción e incubar durante 15 min adicionales a 37 oC.
5. Aislar el ARNN mediante la extracción ácida de fenol/cloroformo. Retirar la fase superior del agua y añadir 1/10 del volumen original de acetato de sodio de 3 M (pH a 5,2), 3 ml de glucógeno para una mejor visualización del pellet y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar durante 1 h a -80oC, centrífuga durante 10 min a 14.000 x g y 4oC.
6. Lavar el pellet con 70% de etanol y disolver en 12 ml de agua libre de nucleasas. El rendimiento habitual del ARN era de alrededor de 600 ng/ml. Conservar a -80oC.
7. Supervise la integridad de los snRNA transcritos in vitro mediante electroforeses de gel de agarosa.
8. Antes de la microinyección, diluir el ARN hasta la concentración final 200 ng/ml en agua que contenga 10 g/l dextran-TRITC 70 kDa.

2. Células

1. Antes del uso, tratar las cubiertas con 1 M HCl durante 1 h, lavar bien en agua destilada y almacenar en 100% etanol. El tratamiento ácido promueve la adhesión de las células para prevenir la descamación celular durante o después de la inyección. Para facilitar la identificación de las células inyectadas, utilice un cubreobjetos con una rejilla.
2. Semilla HeLa u otras células adherentes 1 día antes de la microinyección en cubrepitos de 12 mm (n.o 1 o no. 1.5) para alcanzar el 50% de confluencia en el momento de la microinyección.

3. Inyección

NOTA: Las células de HeLa se inyectaron microinyectas en el medio de águila modificado de Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L de glucosa D que contiene rojo fenol y antibióticos). La inyección se llevó a cabo utilizando un inyector y un micromanipulador equipado con la aguja estéril (ver Tabla de Materiales para más detalles). Todo el sistema microscópico/micromanipulador se precalentaba a 37 oC durante al menos 4 h para evitar fluctuaciones de partes individuales del microscopio y del microinyector.

1. Coloque el plato Petri (30 mm) que contiene 2 ml de medios de cultivo con el cubreobjetos en el centro en el soporte del microscopio. Cargue 3 ml de mezcla de ARN en la aguja utilizando un microcargador. Instale la aguja en el soporte del microinyector en 45o con respecto a la superficie de la placa Petri.
2. Para encontrar la aguja, utilice un objetivo de larga distancia de 10x. En primer lugar, ajuste la velocidad COARSE en el inyector y baje la aguja hasta que toque el medio de cultivo. Usando los prismáticos del microscopio, encuentre el punto brillante, que es el lugar donde la aguja toca el medio de cultivo.
3. Cambie la velocidad a FINE y baje aún más la aguja mientras mira en el microscopio hasta que se observe la punta de la aguja. Mueva la aguja en el medio del campo visual y cambie a un objetivo de larga distancia de 40x.
4. Después de cambiar el objetivo, seleccione la celda y mueva la aguja por encima de esta celda. Establezca las presiones y el tiempo para el contacto de la célula (consulte Consejos y solución de problemas en la discusión).
5. Mueva la aguja hacia abajo en la celda y luego establezca el límite inferior en el micromanipulador. Tenga cuidado de no mover la aguja debajo de la celda.
6. Después de ajustar el límite inferior, mueva la aguja hacia atrás por encima de la celda y presione el botón de inyección en el joystick del inyector. La aguja se mueve automáticamente dentro de la célula hasta el lugar donde se establece el límite e inyecta la mezcla de ARN.
7. Para finalizar, pulse el botón MENU del inyector y retire la aguja del soporte. A continuación, desconecte el tubo del inyector antes de apagar el inyector y el micromanipulador.

4. Fijación y tinción celular

1. Después de la microinyección, vuelva a colocar las células en una incubadora de CO₂ e incubar a 37 oC durante 1 h.
2. Después de la incubación, enjuague las células tres veces con solución salina tamponada de fosfato (PBS) a temperatura ambiente, fijar durante 20 minutos con 4% de paraformaldehído en 0,1 M PIPES pH 6.9, y lavar tres veces con PBS a temperatura ambiente. Si solo se analiza la localización del ARNs, enjuague brevemente las células en agua y monte en un medio de montaje con DAPI.
3. En caso de localización adicional de proteínas, permeabilizar las células con 0.5% Triton-X100 en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Después de tres enjuagues con PBS, incubar las células con anticuerpos primarios y secundarios y después de lavados finales en PBS y breve enjuague en agua, montar en un medio de montaje con DAPI.

5. Microscopía

1. Si no se toma la imagen inmediatamente después del montaje, guarde las diapositivas a 4 oC hasta que se muestren imágenes.
2. Adquiera imágenes utilizando un sistema microscópico de fluorescencia de alta gama equipado con un objetivo de inmersión (60X o 100x/1.4NA).
3. Una vez identificadas las células microinyectadas, recoja una pila de 20 secciones z con pasos de 200 nm z por muestra y sujeto a desconvolución matemática. A continuación, se presentaron proyecciones máximas o pilas z individuales.
4. Para cuantificar la señal fluorescente, dibuje región de interés (ROI) alrededor de un cuerpo Cajal identificado por inmunoinsero de bobina. Mida la intensidad de la señal snRNA en el ROI definido por bobina. A continuación, determinar la intensidad de la fluorescencia del ARNS en el ROI colocado aleatoriamente en el nucleoplasmo y calcular la relación de la señal de ARN en el cuerpo de Cajal y el nucleoplasmo.

Resultados

Para monitorear la localización de SnRNA y el papel del sitio de unión SM en la segmentación del cuerpo de Cajal, preparamos una plantilla de ADN que contiene el promotor T7 y el snRNA U2 de longitud completa o el snRNA U2 que carece de los siete nucleótidos (AUUUUUU) que forman el sitio de unión SM. los snRN fueron transcritos in vitro, aislados y mezclados con dextran-70kDa acoplado a TRITC. Hemos microinyectado la mezcla que contiene ARNn transcrito in vitro en el núcleo o el citoplasma de las células de HeLa.<...

Discusión

Empleamos microinyección de NMNM con etiqueta fluorescente para determinar secuencias importantes para la localización de ARNEnS en cuerpos nucleares de Cajal. Debido a la preparación rápida y bastante simple de ARN etiquetados (preparación de la plantilla de ADN por PCR seguida de transcripción in vitro), el método ofrece un análisis eficaz de cómo varias secuencias contribuyen a la localización del ARN. En relativamente poco tiempo, pudimos analizar diez eliminaciones o sustituciones diferentes del ARNU U2 (r...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%