Analisi della localizzazione snRNA Spliceosomic nelle cellule umane di Hela utilizzando la microiniezione

Riepilogo

La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge vari compartimenti cellulari. Qui, abbiamo impiegato la microiniezione di snRNA fluorescenti per monitorare il loro trasporto all'interno della cellula.

Abstract

La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge fasi nucleari e citoplasmatiche e l'ultimo passo si verifica in un compartimento nucleare chiamato corpo di Cajal. Tuttavia, le sequenze che indirizzano la localizzazione dello snRNA in questa struttura subnucleare non sono note fino a poco tempo fa. Per determinare sequenze importanti per l'accumulo di snRNA nei corpi di Cajal, abbiamo impiegato microiniezione di snRNA fluorescenti etichettati in modo fluorescente seguito dalla loro localizzazione all'interno delle cellule. In primo luogo, abbiamo preparato mutanti di delezione snRNA, sintetizzato modelli di DNA per la trascrizione in vitro e snRNA trascritti in presenza di UTP accoppiati con Alexa488. Gli snRNA etichettati sono stati miscelati con 70 kDa-Dextran coniugati con TRITC, e microiniettati al nucleo o al citoplasma delle cellule umane di HeLa. Le cellule sono state incubate per 1 h e fissa e la bobina del marcatore del corpo di Cajal è stata visualizzata mediante immunoororescenza indiretta, mentre snRNA e dextran, che funge da marcatore di iniezione nucleare o citoplasmica, sono stati osservati direttamente utilizzando un microscopio a fluorescenza. Questo metodo consente di testare in modo efficiente e rapido il modo in cui le varie sequenze influenzano la localizzazione dell'RNA all'interno delle cellule. Qui, mostriamo l'importanza della sequenza di legame Sm per una localizzazione efficiente degli snRNA nel corpo di Cajal.

Introduzione

Lo splicing dell'RNA è uno dei passi cruciali nell'espressione genica, catalizzata da un grande complesso di ribonucleoproteina chiamato slicsome. In totale, più di 150 proteine e 5 piccoli RNA nucleari (snRNA) sono integrati nello spliceosome nelle diverse fasi del percorso di giunzione. U1, U2, U4, U5 e U6 snRNA stanno partecipando alla giunzione dei principali introni GU-AG. Questi snRNA si uniscono allo spliceo come piccole particelle di ribonucleoproteina nucleare preformate (snRNP) che contengono snRNA, sette proteine Sm associate allo snRNA (o alle proteine Like-Sm, che si associano allo snRNA U6) e 1-12 proteine specifiche per ogni snRNP.

L'assemblaggio di snRNP comporta stadi citoplasmatici e nucleari. Lo snRNA appena trascritto viene esportato nel citoplasma dove acquisisce un anello assemblato da sette proteine Sm. L'anello Sm successivamente funge da segnale per la reimportazione dello snRNA nel nucleo. Gli snRNA difettosi che non riescono ad associarsi alle proteine Sm vengono conservati nel citoplasma¹. Gli snRNP appena importati appaiono per la prima volta nel corpo di Cajal dove incontrano proteine specifiche snRNP e terminano la loro maturazione (rivisto nel riferimento^2,3). Recentemente abbiamo dimostrato che l'inibizione delle fasi di maturazione finale si traduce nel sequestro di snRNP immaturi nei corpi di Cajal^4,5. Abbiamo proposto un modello in cui la maturazione finale dello snRNP è sotto controllo di qualità che monitora l'aggiunta di proteine specifiche snRNP e la formazione di snRNP attivi. Tuttavia, i dettagli molecolari di come le cellule distinguono tra particelle immature mature e aberranti correttamente assemblate rimangono sfuggenti.

Per determinare le sequenze di snRNA che sono essenziali per il targeting e l'accumulo di snRNA nei corpi nucleari di Cajal, abbiamo deciso di impiegare la microiniezione di snRNA fluorescentmente etichettati. La microiniezione è stato un metodo di scelta perché: 1) non richiede un tag di sequenza aggiuntivo per distinguere gli snRNA sintetici che formano le loro controparti endogene, il che è particolarmente importante per gli RNA brevi con poco spazio per l'inserimento di sequenze di tag extra; 2) permette l'analisi di sequenze che sono importanti per la biogenesi. Ad esempio, la sequenza Sm è essenziale per l'assemblaggio dell'anello Sm e reimportata nel nucleo⁶. Quando i snRNA sono espressi nella cellula, i snRNA privi della sequenza Sm sono degradati nel citoplasma e non raggiungono il nucleo e i corpi Cajal⁷. Tuttavia, gli snRNA senza la sequenza Sm possono essere microiniettati direttamente nel nucleo e quindi un potenziale ruolo della sequenza Sm nella localizzazione del corpo di Cajal analizzato.

Qui, descriviamo in dettaglio un metodo di microiniezione che abbiamo applicato per determinare le sequenze snRNA necessarie per indirizzare gli snRNA nel corpo di Cajal⁵. Abbiamo dimostrato che i siti di legame Sm e SMN sono insieme necessari e sufficienti per localizzare non solo snRNA ma vari RNA brevi non codificanti nel corpo di Cajal. Sulla base di microiniezione e di altre prove, abbiamo proposto che l'anello Sm assemblato sul sito di rilegatura Sm è il segnale di localizzazione del corpo Cajal.

Protocollo

1. Preparazione di snRNA per microiniezione

1. Preparare un modello di DNA contenente la versione a lunghezza intera o troncata/mutata di snRNA da PCR utilizzando una seguente configurazione PCR: 98 C per 60 s, 98 s per 15 s, 68 gradi C per 30 s, 72 s per 1 min, 98 S per 15 s per 35x e 72 gradi centigradi per 5 min.
2. Il primer in avanti deve contenere una sequenza promotore per la trascrizione in vitro appena a monte del primo nucleotide trascritto. Amplifica la sequenza di snRNA U2 usando il primer in avanti contenente il promotore T7 e il primer inverso, che termina con l'ultimo nucleotide trascritto (vedi Tabella dei materiali per i dettagli).
3. Sintetizzare snRNA utilizzando un kit per breve sintesi dell'RNA (vedere Tabella dei materiali per i dettagli) contenente la polimerasi dell'RNA T7. Aggiungere 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine cap analogico (m3^2,2,7G(5')ppp(5')G), 1 mL di un inibitore dell'RNA e 500-700 ng del modello di DNA per la miscela di reazione e incubazione a 37 C.
4. Aggiungere 1 L (2U) di DNase nella reazione e incubare per ulteriori 15 min a 37 gradi centigradi.
5. Isolare lo snRNA mediante estrazione di fenolo acido/cloroformio. Rimuovere la fase superiore dell'acqua e aggiungere 1/10 del volume originale di acetato di sodio da 3 M (pH - 5,2), 3 litri di glicogeno per una migliore visualizzazione del pellet e 2,5 volumi di 100% di etanolo. Incubare per 1 h a -80 gradi centigradi, centrifugare per 10 min a 14.000 x g e 4 gradi centigradi.
6. Lavare il pellet con il 70% di etanolo e sciogliere in 12 gradi di acqua priva di nuclea. La solita resa dell'RNA era di circa 600 ng/mL. Conservare a -80 gradi centigradi.
7. Monitorare l'integrità delle snRNA trascritte in vitro da elettrofori gel agarose.
8. Prima della microiniezione, diluire l'RNA alla concentrazione finale 200 ng/mL in acqua contenente 10 g/L dextran-TRITC 70 kDa.

2. Celle

1. Prima dell'uso, trattare i copricopro con 1 M HCl per 1 h, lavare accuratamente in acqua distillata e conservare in 100% etanolo. Il trattamento acido promuove l'adesione delle cellule per prevenire il peeling cellulare durante o dopo l'iniezione. Per facilitare l'identificazione delle cellule iniettate, utilizzare un coverslip con una griglia.
2. Seme HeLa o altre cellule aderenti 1 giorno prima della microiniezione su copricapelli 12 mm (n. 1 o 1,5) per raggiungere il 50% di confluenza al momento della microiniezione.

3. Iniezione

NOT: Le cellule di HeLa sono state microiniettate nel Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, 4,5 g/L D-glucosio contenente fenolo rosso e antibiotici). L'iniezione è stata effettuata utilizzando un iniettore e un micromanipolatore dotato dell'ago sterile (vedi Tabella dei materiali per i dettagli). L'intero sistema microscopico/micromanipolatore è stato preriscaldato a 37 gradi per almeno 4 h per prevenire la fluttuazione di singole parti del microscopio e del microiniettore.

1. Mettere il piatto Petri (30 mm) contenente 2 mL di supporti di coltura con la coverslip al centro nel supporto del microscopio. Caricare 3 -L l di miscela di snRNA nell'ago utilizzando un microloader. Installare l'ago nel supporto del microiniettore in 45 gradi rispetto alla superficie della parabola Petri.
2. Per trovare l'ago, utilizzare un obiettivo a lunga distanza 10x. In primo luogo, impostare la velocità COARSE sull'iniettore e abbassare l'ago fino a toccare il mezzo di coltura. Utilizzando il binocolo al microscopio, trovare il punto luminoso, che è il luogo in cui l'ago tocca il mezzo di coltura.
3. Modificare la velocità in FINE e abbassare ulteriormente l'ago mentre si guarda al microscopio fino a quando non viene osservata la punta dell'ago. Spostare l'ago nel mezzo del campo visivo e passare a un obiettivo di 40 volte a lunga distanza.
4. Dopo aver modificato l'obiettivo, selezionare la cella e spostare l'ago sopra questa cella. Impostare le pressioni e il tempo per il contatto cellulare (vedere Suggerimenti e risoluzione dei problemi nella discussione).
5. Spostare l'ago verso il basso nella cella e quindi impostare il limite inferiore sul micromanipolatore. Fare attenzione a non spostare l'ago sotto la cella.
6. Dopo aver impostato il limite inferiore, spostare l'ago indietro sopra la cella e premere il pulsante di iniezione sul joystick dell'iniettore. L'ago si muove automaticamente all'interno della cellula nel punto in cui è impostato il limite e inietta la miscela di RNA.
7. Per finire, premere il pulsante MENU sull'iniettore e rimuovere l'ago dal supporto. Quindi scollegare il tubo dall'iniettore prima di spegnere l'iniettore e il micromanipolatore.

4. Fissazione e colorazione delle cellule

1. Dopo la microiniezione, riportare le cellule in un'incubatrice di CO₂ e incubare a 37 gradi centigradi per 1 h.
2. Dopo l'incubazione, sciacquare le cellule tre volte con soluzione salina tampolata di fosfato (PBS) a temperatura ambiente, fissare per 20 min con 4% paraformaldeide in 0,1 M PIPES pH 6,9, e lavare tre volte con temperatura ambiente PBS. Se viene analizzata solo la localizzazione dello snRNA, sciacquare brevemente le cellule in acqua e montare in un supporto di montaggio con DAPI.
3. In caso di ulteriore localizzazione delle proteine, permeabilizzare le cellule con 0,5% Triton-X100 in PBS per 5 min a temperatura ambiente. Dopo tre risciacqui con PBS, incubare le cellule con anticorpi primari e secondari e dopo i lavamenti finali in PBS e un breve risciacquo in acqua, montare in un supporto di montaggio con DAPI.

5. Microscopia

1. Se non viene immagine subito dopo il montaggio, conservare i vetrini a 4 gradi centigradi fino all'imaging.
2. Acquisire immagini utilizzando un sistema microscopico a fluorescenza di fascia alta dotato di un obiettivo di immersione (60X o 100x/1.4NA).
3. Una volta identificate le cellule microiniettate, raccogliere una pila di 20 z-sezioni con passaggi da 200 nm z per campione e soggetti a deconvoluzione matematica. Sono state poi presentate proiezioni massime o singole pile di z.
4. Per quantificare il segnale fluorescente, disegnare Regione di Interesse (ROI) intorno a un corpo cajal identificato dall'immunostaining a bobina. Misurare l'intensità del segnale snRNA nel ROI definito dalla bobina. Successivamente determinare l'intensità della fluorescenza snRNA nel ROI collocato in modo casuale nel nucleoclasmo e calcolare il rapporto del segnale di RNA nel corpo di Cajal e nucleoclasmo.

Risultati

Per monitorare la localizzazione dello snRNA e il ruolo del sito di legame Sm nel targeting del corpo di Cajal, abbiamo preparato un modello di DNA contenente il promotore T7 e il snRNA U2 o U2 a piena lunghezza che mancano i sette nucleotidi (AUUUUUGUG) che formano il sito di legame Sm. gli snRNA sono stati trascritti in vitro, isolati e mescolati con dextran-70kDa accoppiato a TRITC. Abbiamo microiniettato la miscela contenente snRNA trascritto in vitro nel nucleo o il citoplasma delle cellule HeLa.

Discussione

Abbiamo impiegato la microiniezione di snRNA fluorescenti per determinare sequenze importanti per la localizzazione del snRNA nei corpi nucleari di Cajal. Grazie alla rapida e piuttosto semplice preparazione degli RNA etichettati (preparazione del modello di DNA da PCR seguita dalla trascrizione in vitro) il metodo offre un'analisi efficace di come le varie sequenze contribuiscono alla localizzazione dell'RNA. In tempi relativamente brevi, siamo stati in grado di analizzare dieci diverse eliminazioni o sostituzioni dello...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%