Análise da localização de snRNA Spliceosomal em células HeLa humanas usando microinjeção

Resumo

A biogênese de snRNAs spliceosomal é um processo complexo envolvendo vários compartimentos celulares. Aqui, nós empregamos o microinjection de snrnas cDNAs etiquetado a fim monitorar seu transporte dentro da pilha.

Resumo

A biogênese de snRNAs spliceosomal é um processo complexo envolvendo ambas as fases nuclear e citoplasmática e o último passo ocorre em um compartimento nuclear chamado corpo de Cajal. No entanto, as sequências que direcionam a localização de snRNA para esta estrutura subnuclear não foram conhecidas até recentemente. Para determinar seqüências importantes para a acumulação de snrnas em corpos de Cajal, nós empregamos o microinjection de snrnas cDNAs etiquetado seguido por sua localização dentro das pilhas. Primeiramente, nós preparamos mutantes do apagamento de snRNA, moldes sintetizados do ADN para in vitro a transcrição e transcrito snRNAs na presença de UTP acoplado com Alexa488. Os snRNAs rotulados foram misturados com 70 kDa-Dextran conjugados com TRITC, e microinjetado no núcleo ou no citoplasma de células HeLa humanas. As células foram incubadas por 1 h e fixadas e a coilina do marcador do corpo de Cajal foi visualizada por imunofluorescência indireta, enquanto snRNAs e Dextran, que serve como marcador de injeção nuclear ou citoplasmática, foram observados diretamente com um microscópio de fluorescência. Este método permite o teste eficiente e rápido de como as várias seqüências influenciam a localização do RNA dentro das pilhas. Aqui, mostramos a importância da sequência de ligação SM para uma localização eficiente de snRNAs no corpo de Cajal.

Introdução

A emenda do RNA é uma das etapas cruciais na expressão de Gene, que é catalisada por um grande complexo do ribonucleoprotein chamado o spliceosome. No total, mais de 150 proteínas e 5 RNAs nucleares pequenas (snrnas) são integrados no spliceossoma em estágios diferentes da via de emenda. U1, U2, U4, U5 e U6 snRNAs estão participando na emenda dos principais introns GU-AG. Estes snrnas juntam-se ao spliceossoma como partículas nucleares pequenas pré-formadas do ribonucleoprotein (snRNPs) que contêm snRNA, sete proteínas do SM associadas com o snRNA (ou proteínas de like-SM, que associam com o snRNA U6) e 1-12 proteínas específicas para cada snRNP.

A montagem de snRNPs envolve estágios citoplasmáticos e nucleares. O snRNA recentemente transcrito é exportado para o citoplasma onde adquire um anel montado a partir de sete proteínas SM. O anel SM, subsequentemente, serve como um sinal para snRNA re-importação de volta para o núcleo. SnRNAs defeituosos que não conseguem associar com proteínas SM são retidos no citoplasma¹. Os snRNPs recém-importados aparecem pela primeira vez no corpo de Cajal, onde eles atendem às proteínas específicas de snRNP e terminam sua maturação (revisada na referência^2,3). Nós mostramos recentemente que a inibição de etapas finais da maturação conduz ao sequestro de snRNPs imaturos em corpos de Cajal^4,5. Nós propusemos um modelo onde a maturação final de snRNP esteja o controle de qualidade que monitora a adição de proteínas snRNP-específicas e a formação de snRNPs ativo. Entretanto, os detalhes moleculars de como as pilhas distinguem entre as partículas imaturas maduras e aberrantes corretamente montadas permanecem indescritível.

Para determinar as sequências de snRNA que são essenciais para o direcionamento e acúmulo de snrnas em corpos nucleares de Cajal, decidimos empregar microinjeção de snrnas rotulados com cDNAs. A microinjeção foi um método de escolha porque: 1) não requer uma tag de seqüência adicional para distinguir snRNAs sintéticos formam suas contrapartes endógenas que é especialmente importante para RNAs curtas com pouco espaço para inserção de seqüência de Tags extra; 2) permite a análise de sequências que são importantes para a biogênese. Por exemplo, a sequência SM é essencial para o conjunto do anel SM e re-importar para o núcleo⁶. Quando snRNAs são expressos na célula, snRNAs faltando a seqüência SM são degradadas no citoplasma e não atingem o núcleo e corpos Cajal⁷. Entretanto, snrnas sem a seqüência do SM pode diretamente ser injetado no núcleo e assim um papel potencial da seqüência do SM na localização do corpo de Cajal assayed.

Aqui, nós descrevemos em detalhe um método do microinjection que nós aplicamos para determinar as seqüências de snRNA necessárias para alvejar snRNAs no corpo⁵de Cajal. Nós mostramos que os locais obrigatórios do SM e do SMN são junto necessário e suficiente localizar não somente snRNAs mas vários RNAs não-codificando curtos no corpo de Cajal. Com base na microinjeção, bem como outras evidências, propusemos que o anel SM montado no local de ligação SM é o sinal de localização do corpo Cajal.

Protocolo

1. preparação de snRNAs para microinjection

1. Prepare um molde do ADN que contem a versão full-length ou truncada/Mutated de snRNA pelo PCR usando uma seguinte configuração do PCR: 98 ° c para 60 s, 98 ° c para 15 s, 68 ° c para 30 s, 72 ° c para 1 minuto, 98 ° c para 15 s para 35x e 72 ° c por 5 min.
2. O primer dianteiro deve conter uma sequência de promotor para a transcrição in vitro apenas a montante do primeiro nucleotídeo transcrito. Amplify a seqüência de snRNA U2 usando o primer dianteiro que contem o promotor T7 e o primer reverso, que termina com o último nucleotide transcrito (veja a tabela de materiais para detalhes).
3. Sintetizar snRNA usando um kit para síntese de RNA curto (ver tabela de materiais para detalhes) contendo T7 RNA polimerase. Adicionar 1 mm ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimetilguanosina Cap analógico (m3^{2, 2, 7}g (5 ') PPP (5 ') G), 1 ml de um inibidor de RNA e 500-700 ng do modelo de DNA para a mistura de reação e incubar a 37 ° c durante
4. Adicionar 1 μL (2U) de DNase na reacção e incubar por 15 min adicionais a 37 ° c.
5. Isole o snRNA pela extração ácida do fenol/clorofórmio. Retire a fase superior da água e adicione 1/10 do volume original de 3 M de acetato de sódio (pH = 5,2), 3 μL de glicogênio para melhor visualização da pelota e 2,5 volumes de 100% de etanol. Incubar durante 1 h a-80 ° c, centrifugador por 10 min a 14.000 x g e 4 ° c.
6. Lave a pelota com 70% de etanol e dissolva em 12 μL de água sem nuclease. O rendimento usual do RNA era ao redor 600 ng/mL. Conservar a-80 ° c.
7. Monitore a integridade de snRNAs transcritas in vitro por electrophoreses do gel do agarose.
8. Antes da microinjecção, diluir o RNA para a concentração final 200 ng/mL em água contendo 10 μg/μL de Dextran-TRITC 70 kDa.

2. células

1. Antes do uso, trate os COVERSLIP com 1 M HCl para 1 h, lave-o completamente na água destilada e armazene-o em 100% etanol. O tratamento ácido promove a adesão das pilhas para impedir a casca da pilha durante ou após a injeção. Para facilitar a identificação de células injetadas, use uma lamínula com uma grade.
2. Semente HeLa ou outras células aderentes 1 dia antes da microinjecção em 12 mm COVERSLIP (n º 1 ou n º 1,5) para atingir 50% confluência no momento da microinjecção.

3. injeção

Nota: As células de HeLa foram microinjetadas no meio de águia modificada de Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-glicose contendo fenol vermelho e antibióticos). A injeção foi feita usando um injector e um micromanipulador equipado com a agulha estéril (veja a tabela de materiais para detalhes). Todo o sistema microscópico/micromanipulador foi pré-aquecido a 37 ° c por pelo menos 4 h para evitar a flutuação de partes individuais do microscópio e do microinjetor.

1. Coloque o prato de Petri (30 mm) contendo 2 mL de meios de cultura com a lamínula no meio no suporte do microscópio. Carregar 3 μL de mistura de snRNA na agulha utilizando um microloader. Instale a agulha no suporte do microinjector em 45 ° com respeito à superfície do prato de Petri.
2. Para encontrar a agulha, use um objetivo de longa distância de 10x. Primeiramente, ajuste a velocidade grosseira no injector e abaixe a agulha até que toque o meio de cultura. Usando os binóculos microscópio, encontrar o ponto luminoso, que é o lugar onde a agulha toca o meio de cultura.
3. Mude a velocidade para multa e abaixe mais a agulha ao olhar no microscópio até que a ponta da agulha esteja observada. Mova a agulha no meio do campo visual e mude para um objetivo de longa distância de 40x.
4. Depois de alterar o objetivo, selecione a célula e mova a agulha acima desta célula. Defina as pressões e o tempo para o contato da célula (consulte Dicas e solução de problemas em discussão).
5. Mova a agulha para baixo na célula e, em seguida, defina o limite inferior no micromanipulador. Tenha cuidado para não mover a agulha abaixo da célula.
6. Depois de definir o limite inferior, mova a agulha para trás acima da célula e pressione o botão de injeção no joystick do injector. A agulha se move automaticamente dentro da célula para o local onde o limite é definido e injeta a mistura de RNA.
7. Para terminar, empurre o menu do botão no injector e retire a agulha do suporte. Em seguida, desconecte o tubo do injector antes de desligar o injector e o micromanipulador.

4. fixação e coloração de células

1. Após a microinjecção, devolva as células a uma incubadora de CO₂ e incubar a 37 ° c durante 1 h.
2. Após a incubação, enxágüe as células três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente, correção por 20 min com paraformaldeído a 4% em tubos de 0,1 M pH 6,9 e lave três vezes com a temperatura ambiente PBS. Se apenas a localização de snRNA for analisada, enxague brevemente as células em água e monte em um meio de montagem com DAPI.
3. Em caso de localização de proteínas adicionais, permeabilize as células com 0,5% Triton-X100 em PBS por 5 min à temperatura ambiente. Após três enxaguatórios com PBS, incubar as células com anticorpos primários e secundários e após lavagens finais em PBS e breve enxágüe em água, montagem em um meio de montagem com DAPI.

5. microscopia

1. Se não imaged imediatamente após a montagem, armazene as corrediças em 4 ° c até a imagem latente.
2. Adquira imagens usando um sistema microscópico high-end da fluorescência equipado com um objetivo da imersão (60X ou 100x/1.4 NA).
3. Uma vez que as células microinjetadas são identificadas, coletar uma pilha de 20 seções z com 200 nm z passos por amostra e sujeitos a desvolução matemática. Projeções máximas ou pilhas z individuais foram então apresentadas.
4. Para quantificar o sinal fluorescente, desenhe região de interesse (ROI) em torno de um corpo de Cajal identificado por imunomarcação de coilina. Meça a intensidade do sinal snRNA no ROI definido pela coilina. Em seguida determine a intensidade da fluorescência de snRNA no ROI coloc aleatòria no Nucleoplasm e calcule a relação do sinal do RNA no corpo e no Nucleoplasm de Cajal.

Resultados

Para monitorar a localização de snRNA e o papel do local obrigatório do SM na segmentação do corpo de Cajal, nós preparamos um molde do ADN que contem o promotor T7 e o snRNA U2 completo ou o snRNA U2 que faltam os sete nucleotídeos (auuuuug) que formam o local obrigatório do SM. os snRNAs foram transcritos in vitro, isolados e misturados com Dextran-70kDa acoplado ao TRITC. Nós injetado a mistura que contem in vitro o snRNA transcrito no núcleo ou no citoplasma de pilhas de Hela.

Fo...

Discussão

Nós empregamos o microinjection de snrnas cDNAs etiquetado para determinar as seqüências importantes para a localização de snRNA em corpos nucleares de Cajal. Devido à preparação rápida e rather simples de RNAs etiquetado (preparação do molde do ADN pelo PCR seguido pela transcrição in vitro) o método oferece a análise eficaz de como as várias seqüências contribuem à localização do RNA. Em tempo relativamente curto, pudemos analisar dez diferentes exclusões ou substituições do snRNA U2 (referênci...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%