Mikroenjeksiyon kullanarak ınsan hela hücrelerinde Spliceosomal snRNA yerelleştirme Analizi

Özet

İntronları snrnas Biogenesis çeşitli hücresel bölmeler içeren karmaşık bir süreçtir. Burada, hücrenin içindeki taşımalarını izlemek için floresan etiketli snRNAs 'ın Mikroenjeksiyonu çalışılmış.

Özet

İntronları snrnas Biogenesis hem nükleer ve sitoplazmik aşamaları içeren karmaşık bir süreçtir ve son adım Cajal vücut denilen bir nükleer bölme oluşur. Ancak, snRNA lokalizasyonu bu subnuclear yapısına doğrudan dizileri yakın zamana kadar bilinmemektedir. Cajal vücutlarında snRNAs birikimi için önemli dizileri belirlemek için, floresan etiketli snRNAs 'ın Mikroenjeksiyonu ve ardından hücrelerin içindeki lokalizasyonu ile çalışmaktadır. İlk olarak, snRNA silme mutantlar hazırladık, in vitro transkripsiyon için sentezlenmiş DNA şablonları ve Alexa488 ile birleştiğinde UTP varlığı ile snRNAs transkripsiyonu. Etiketli snRNAs TRITC ile konjuli 70 kDa-dextran ile karıştırıldı ve Kernel veya insan HeLa hücrelerinin sitoplazması mikroenjekte edildi. Hücreler 1 h ve sabit ve Cajal vücut Marker aytac dolaylı immünofluorescence tarafından görselleştirilmiş iken, snrnas ve dextran, hangi nükleer veya sitoplazmik enjeksiyon bir marker olarak hizmet veren, doğrudan bir floresan mikroskop kullanılarak gözlenmiştir. Bu yöntem, çeşitli sıraları hücrelerin içinde RNA lokalizasyonu nasıl etkilediğini verimli ve hızlı test etmek için izin verir. Burada, snRNAs 'ın Cajal gövdesine verimli bir şekilde lokalizasyonu için SM-bağlayıcı dizisinin önemini gösteriyoruz.

Giriş

RNA birleştirme, spliceosome denilen büyük bir Ribonükleoprotein kompleksi tarafından katalizlenmiş gen ifadesinde önemli adımlardan biridir. Toplam olarak, 150 ' den fazla protein ve 5 küçük nükleer RNAs (snRNAs) spliceosome içine birleştirme yolu farklı aşamalarında entegre edilmiştir. U1, U2, U4, U5 ve U6 snRNAs, büyük GU-AG intron 'larının takılmasını yapmaya katılıyor. Bu snRNAs, snRNA içeren önceden biçimlendirilmiş küçük nükleer Ribonükleoprotein parçacıkları (snRNPs), snRNA ile ilişkili yedi SM proteinleri (U6 snRNA ile ilişkilendirmek gibi-SM proteinleri) ve her snRNP için spesifik 1-12 proteinleri olan spliceosome 'a katılır.

SnRNPs montajı sitoplazmik ve nükleer aşamaları içerir. Yeni yazılmış snRNA, yedi SM proteininden toplanan bir yüzüğü satın aldığı sitoplazmada ihraç edilir. SM halkası daha sonra snRNA 'nın çekirdeğe yeniden ithalatı için bir sinyal olarak hizmet vermektedir. SM proteinleri ile ilişkilendirmek için başarısız arızalı snRNAs sitoplazmada korunur¹. Yeni ithal snrnps ilk Cajal vücutta nerede onlar snrnp özgü proteinler karşılamak ve olgunlaşma bitirmek görünür (referans^2,3' te gözden). Son olgunlaşma adımlarını inhibisyonu Cajal organları^4,5olgunlaşmamış snrnps sekestrasyon sonuçları gösterdi. Biz son snRNP olgunlaşma snRNP özgü Protein ilavesi ve aktif snRNPs oluşumu izler kalite kontrol altında bir model önerdi. Ancak, hücrelerin doğru birleştirilen olgun ve anormal olgunlaşmamış parçacıklar arasında ayırt nasıl moleküler detayları zor kalır.

Nükleer Cajal vücutlarının hedefleme ve snRNAs birikimi için gerekli olan snRNA dizileri belirlemek için, floresan etiketli snRNAs mikroenjeksiyon istihdam etmeye karar verdik. Mikroenjeksiyon bir seçim yöntemidir, çünkü: 1) sentetik snRNAs 'ların, ekstra etiket dizisinin yerleştirilmesi için az alan olan kısa RNAs 'lar için özellikle önemli olan endojen meslektaşlarını ayırt etmek için ek bir sıralı etiket gerektirmediği; 2) biyogenesis için önemli olan dizileri analiz sağlar. Örneğin, SM dizisi SM Ring montajı için gereklidir ve çekirdek⁶' ya yeniden içe aktarabilir. SnRNAs hücrede ifade edildiğinde, SM dizisi bulunmayan snRNAs sitoplazmada bozulur ve çekirdeğin ve Cajal organları⁷' ye ulaşmaz. Ancak, SM dizisi olmadan snRNAs doğrudan çekirdeğin içine mikro enjekte edilebilir ve böylece Cajal vücut lokalizasyonu içinde SM dizisinin potansiyel bir rolü assayed.

Burada, snRNA dizilerini Cajal gövdesine⁵' e hedef almak için gerekli olan bir mikroenjeksiyon yöntemi hakkında ayrıntılı olarak tarif ediyoruz. Biz SM ve SMN bağlayıcı siteleri birlikte gerekli ve sadece snRNAs ama Cajal vücuda çeşitli kısa olmayan kodlama RNAs yerelleştirmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Mikroenjeksiyon yanı sıra diğer kanıtlar dayalı, biz SM halka SM bağlayıcı site monte Cajal vücut yerelleştirme sinyali olduğunu önerdi.

Protokol

1. mikroenjeksiyon için snRNAs hazırlanması

1. Aşağıdaki PCR kurulumunu kullanarak snRNA 'nın tam uzunluklu veya kesilmiş/mutasyona uğramış sürümünü içeren bir DNA şablonunu hazırlayın: 98 °C 60 s, 98 °C için 15 s, 68 °C 30 s, 72 °C için 1 dakika, 98 °C için 15 s 35x ve 72 °C 5 dk.
2. İleriye dönük astar, ilk transkripsiyon nükperotid 'in sadece upstream olarak in vitro dökümü için bir organizatör dizisi içermelidir. U2 snRNA dizisini, T7 promotör ve ters astar içeren ileri astar kullanarak arttırın (Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın).
3. Kısa RNA sentezi için bir kit kullanarak snRNA sentezini (bkz: Ayrıntılar için malzeme tablosu ) T7 RNA polimeraz içeren. 1 mM ATP Ekle, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine Cap analog (m3^{2, 2, 7}g (5 ') PPP (5 ') G), 1 ml RNA inhibitörü ve NG reaksiyon500-700 una karşı karışımı ve 37 °c ' de bir gecede inkük.
4. Reaksiyonda 1 μL (2U) DNase ekleyin ve 37 °C ' de 15 dk ek için Inküye yapın.
5. Asitli fenol/kloroform ekstraksiyon ile snRNA izole. Üst su fazını çıkarın ve 3 M sodyum asetat (pH = 5,2), 3 μL glikojen daha iyi Pelet görselleştirme ve 2,5 hacimleri% 100 etanol orijinal hacminin 1/10 ekleyin. 1 saat-80 °C ' ye kadar inkük, 14.000 x g ve 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü.
6. 70% etanol ile Pelet yıkayın ve 12 μL nükleücretsiz su içinde çözülür. Her zamanki RNA verimi yaklaşık 600 ng/mL 'Dir. -80 °C ' de saklayın.
7. Agaroz jel elektrophoreses ile in vitro transkripsiyonu snrnas bütünlüğünü izleyin.
8. Mikroenjeksiyonu yapmadan önce, 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa içeren suda son konsantrasyon 200 ng/mL 'ye seyreltin.

2. hücreler

1. Kullanmadan önce, 1 M HCl ile coverfları tedavi 1 h, damıtılmış su iyice yıkayın ve 100% etanol içinde saklayın. Asidik tedavi sırasında veya enjeksiyon sonrası hücre peeling önlemek için hücreleri yapışma teşvik eder. Enjekte hücrelerin daha kolay tanımlanması için, bir ızgara ile bir lamel magazini kullanın.
2. Tohum HeLa veya diğer yapışan hücreler 1 gün önce mikroenjeksiyon üzerinde 12 mm kapak (No. 1 veya No. 1,5) ulaşmak için 50% mikroenjeksiyon sırasında konfluency.

3. enjeksiyon

Not: HeLa hücreleri Dulbecco modifiye kartal orta mikroenjekte edildi (D-MEM, 4,5 g/L D-glikoz fenol kırmızı ve antibiyotikler içeren). Enjeksiyon bir enjektör ve steril iğne ile donatılmış bir Mikromanipülatör kullanılarak yapılmıştır (Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın). Mikroskobik/Mikromanipülatör sistemi, mikroskop ve microinjector bireysel parçalarının dalgalanması önlemek için en az 4 h için 37 °C ' ye önceden ısıtıldı.

1. 2 ml kültür ortamını içeren Petri tabağı (30 mm), ortadaki lamel magazini ile mikroskop sahibi haline koyun. Bir mikroyükleyici kullanarak iğne içine 3 μL snRNA karışımı yükleyin. Petri tabağı yüzeyine göre 45 ° ' de mikroenjektör tutucusuna iğne takın.
2. İğne bulmak için, 10X uzun mesafe hedefi kullanın. İlk olarak, enjektör üzerinde hızı kaba ayarlayın ve kültür ortamına dokunur kadar iğne aşağı. Mikroskop dürbünlerini kullanarak, iğne kültür ortamına dokunan yer olan parlak noktayı bulun.
3. İnce ve iğne ucu görülene kadar mikroskop bakarak iğne daha düşük hızını değiştirin. Görsel alan ortasında iğne hareket ve 40X uzun mesafe hedefe geçiş.
4. Hedefi değiştirdikten sonra, hücreyi seçin ve iğne bu hücrenin üzerine taşıyın. Hücre teması için basınçları ve zamanı ayarlayın (bkz. Ipuçları ve tartışma sorunlarını giderme).
5. İğneyi hücreye taşıyın ve ardından mikromanipülatörün alt sınırını ayarlayın. Hücre altında iğne taşımak için dikkatli olun.
6. Alt sınırı ayarladıktan sonra, iğne hücrenin üzerine geri taşıyın ve enjektör joystick üzerinde enjeksiyon düğmesine basın. İğne, hücrenin içinde otomatik olarak sınırın ayarlanmış olduğu yere taşınır ve RNA karışımı enjekte eder.
7. Bitirmek için, enjektör üzerinde düğme menüsünü itin ve tutucunun iğne çıkarın. Enjektörü ve mikromanipülatörü kapatmadan önce tüpü enjektörden çıkarın.

4. hücre Fikreme ve boyama

1. Mikroenjeksiyonu yaptıktan sonra, hücreleri CO₂ kuluçk içine dönün ve 37 °c ' de 1 saat boyunca Inküye yapın.
2. İnkübasyon sonra, hücreleri üç kez fosfat tamponlu tuz çözeltisi ile durulayın (PBS) Oda sıcaklığında, düzeltmek 20 dakika ile 4% civarında formaldehite 0,1 M borular pH 6,9, ve yıkama üç kez oda sıcaklığı PBS ile. Yalnızca snRNA lokalizasyonu analiz edildiğinde, hücreleri su içinde kısaca durulayın ve DAPı ile bir montaj ortamına monte edin.
3. Ek protein lokalizasyonu durumunda, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS 'de% 0,5 Triton-X100 ile hücreleri geçirgen. PBS ile üç durulama sonra, primer ve ikincil antikorlar ve PBS son yıkanır ve su kısa durulama sonra, DAPı ile bir montaj ortamı monte hücreleri inküstir.

5. mikroskobik

1. Montajdan hemen sonra görüntülenmiş değilse, slaytları görüntüleme kadar 4 °C ' de saklayın.
2. Bir daldırma objektif (60X veya 100x/1.4 NA) ile donatılmış bir High-End floresan mikroskobik sistemi kullanarak görüntüleri elde.
3. Mikroenjeksiyonlu hücreler belirlendikten sonra, numune başına 200 Nm z basamakları ve matematiksel deconvolution ile 20 z-Bölüm yığını toplayın. Daha sonra maksimal projeksiyonlar veya bireysel z yığınları sunuldu.
4. Floresan sinyalini ölçmek için, aytac immünostakresi ile tanımlanan bir Cajal vücudun etrafında ilgi alanı (YG) çizin. Coilin tanımlı YG 'de snRNA sinyalinin yoğunluğunu ölçün. Sonraki ROı içinde snRNA floresans yoğunluğu nükploplazm rasgele yerleştirilir ve Cajal vücutta RNA sinyalinin oranını hesaplamak ve nükostoplazm belirleyin.

Sonuçlar

SnRNA lokalizasyonunu ve Cajal vücut hedeflemede SM bağlama sitesinin rolünü izlemek için, T7 Organizatör içeren bir DNA şablonu ve SM bağlayıcı sitesini oluşturan yedi nükleotid (auuuuug) bulunmayan tam uzunlukta U2 snRNA veya U2 snRNA 'yı hazırladık. snRNAs in vitro transkripsiyonu, izole ve TRITC-bağlı dextran-70kDa ile karışık. İçinde vitro olarak transkripsiyonu snRNA içeren karışımı mikroenjekte ettik.

Daha önce SM bağlayıcı sitenin nükleer ithalat^6<...

Tartışmalar

SnRNA lokalizasyonu için nükleer Cajal organları için önemli dizileri belirlemek için floresan etiketli snRNAs mikroenjeksiyon istihdam. Etiketli RNAs 'ların hızlı ve oldukça basit hazırlanması nedeniyle (PCR ile DNA şablonunun hazırlanması ve ardından in vitro transkripsiyon) yöntem, çeşitli dizilerin RNA lokalizasyonu için nasıl katkıda bulunduğunu etkili bir analiz sunar. Nispeten kısa sürede, U2 snRNA 'nın on farklı silme veya değiştirme işlemlerini analiz edebildik (referans

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%