JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نحن وصف طريقه موثوق بها لقياس الكتلة الميتوكوندريا والقدرة الغشاء في الخلايا الجذعية السابقة مثقف الجسم الدم والخلايا T.

Abstract

ان التوازن الدقيق بين السكون والتجديد الذاتي والتمايز هو المفتاح للحفاظ علي الخلايا الجذعية التي تكون الدم (HSC) والحفاظ علي الإنتاج مدي الحياة لجميع خلايا الدماء الناضجة. في السنوات الاخيره ظهرت الأيض الخلوية كمنظم حاسمه من وظيفة HSC ومصير. لقد أظهرنا سابقا ان تعديل الأيض الميتوكوندريا يؤثر مصير HSC. علي وجه التحديد ، من خلال تفكيك كيميائيا سلسله النقل الكترون كنا قادرين علي الحفاظ علي وظيفة HSC في الظروف الثقافية التي تحفز عاده التمايز السريع. ومع ذلك ، الحد من أرقام HSC غالبا ما يمنع استخدام الاختبارات القياسية لقياس الأيض HSC التالي التنبؤ وظيفتها. هنا ، ونحن الإبلاغ عن فحص التدفق الخلوي بسيطه التي تسمح قياس موثوق بها من المحتملة غشاء الميتوكوندريا وكتله الميتوكوندريا في الخلايا النادرة مثل HSCs. نناقش عزل HSCs من نخاع العظم الماوس وقياس الكتلة الميتوكوندريا والغشاء المحتملة آخر الثقافة المجرية السابقة. علي سبيل المثال ، ونحن نظهر تشكيل هذه المعلمات في HSCs عن طريق العلاج مع المغير الأيض. وعلاوة علي ذلك ، ونحن توسيع نطاق تطبيق هذه المنهجية علي الخلايا البشرية المستمدة من الدم الطرفية والأورام اللمفاوية الإنسان التسلل (TILs) ، والتي تبين الاختلافات المثيرة في لمحات الميتوكوندريا ، ربما تعكس الخلية T مختلفه وظيفه. ونحن نعتقد ان هذا الفحص يمكن ان تستخدم في العروض لتحديد مغيري الأيض الميتوكوندريا في أنواع مختلفه من الخلايا في سياقات مختلفه.

Introduction

الخلايا الجذعية للدم (HSCs) هي مجموعه صغيره من الخلايا المقيمة في نخاع العظم لضمان إنتاج الدم والتوازن طوال عمر الكائن الحي. HSCs التوسط في هذه العملية من خلال التخلي عن الأسلاف التي تنتج بدورها عضال متمايزة السلالات خلايا الدم الناضجة عبر عده جولات من انقسام الخلايا والتمايز جيدا مدبره الخطوات1. الأهم من ذلك ، HSCs تنتج طاقتها عبر تحلل لاهوائية. وعلي النقيض من ذلك ، فان المزيد من العاملين الملتزمينوالنشطين المولدينللدم يحولون ايضهم نحو استقلاب الميتوكوندريا 2،3،4. ويعتقد ان هذه الحالة الايضيه متميزة لحماية hscs من الاضرار الخلوية التي تسببها أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تنتجها الميتوكوندريا النشطة, التالي الحفاظ علي المدى الطويل في وظيفة الجسم الحيوي5,6,7,8. القياس المباشر لحاله الأيض HSC هو تحدي والانتاجيه في كثير من الأحيان منخفضه بسبب أرقامها المحدودة. هنا ، ونحن وصف الفحص القائم علي تدفق الخلوية لقياس قويه من المحتملة غشاء الميتوكوندريا (ΔΨm) باستخدام تيتراميثيلرودامين الميثيل استر (TMRM) فلوري ، وكتله الميتوكوندريا باستخدام وصمه الفلورية الخضراء الميتوكوندريا (Mitotracker الأخضر) في HSCs. لقد أظهرنا سابقا ان انخفاض δψm هو علامة وظيفية حسن النية من hscs عاليه النقاء9 والتحوير الأيضي قادره علي خفض δψm تعزيز hscs وظيفة9،10. هنا نقترح استخدام طريقتنا علي التنميط الميتوكوندريا HSCs كاستراتيجية لتحديد جزيئات جديده قادره علي تحسين HSCs ' طويلة الأجل أعاده تشكيل الدم المحتملة.

علي سبيل المثال ، ونحن نثبت ان هذا الفحص يقيس بشكل موثوق خفض HSC ΔΨm عند التعرض لفيتامين B3 التناظرية نيكوتيناميد ريبوسيد (NR). وفقا لذلك ، في دراستنا التي نشرت مؤخرا ونحن نثبت ان NR يخفف بقوة الدم الانتعاش بعد الزرع في كل من الماوس وأنظمه الماوس أنسنه بتحسين مباشره الجذعية الدموية ووظائف سلف10. قدره هذه المغيرين الايضيه هي من القيمة السريرية كبيره بالنظر إلى ان معدل الوفاات 25 ٪ يرتبط بتاخير في الدم والتعافي المناعي في المرضي بعد زرع11،12.

وعلاوة علي ذلك ، ونحن نقدم أدله علي ان هذه المنهجية يمكن تطبيقها لتوصيف الشخصية الايضيه ووظيفة خلايا T الإنسان. في السنوات الاخيره ، أصبح تطوير العلاج الخلوي بالتبني (ACT) باستخدام الخلايا الليمفاوية اللمفاوية المتسللة (TILs) النهج الأكثر فعاليه لأنواع معينه من السرطان المتقدم مع التكهن غير المواتية للغاية (علي سبيل المثال ،سرطان الجلد المنتشر ، حيث > 50 ٪ من المرضي يستجيبون للعلاج ومع ذلك ، TILs إيواء ما يكفي من النشاط انتيورم من الصعب توليد14. الانتشار واسعه النطاق والتحفيز ان TILs الخضوع خلال التوسع الجسم السابق يسبب الإرهاق الخلية T والشيخوخة التي تضعف بشكل كبير T استجابه الخلية انتيورم15. الأهم من ذلك ، ترتبط قدره tils ' انتيتورال باحكام الأيض16،17 والنهج التي تهدف إلى تعدل الأيض من خلال تثبيط المسار PI3K/akt قد أنتجت نتائج مشجعه18،19. لهذا السبب, نقارن ΔΨm الخلايا T المستمدة من الخلايا أحاديه النواة الدم الطرفية (PBMCs) و TILs المستمدة من المريض, وتبين ان اقل تمايزا المستمدة من PBMCS الخلايا T لديها اقل ΔΨm وكتله الميتوكوندريا بالمقارنة مع TILs عضال متمايزة.

ونحن نتصور ان هذا الفحص يمكن استخدامها لتحديد المغيرين الايضيه الرواية التي تحسن HSC ووظيفة الخلية T عن طريق تشكيل ΔΨm.

Protocol

جميع التجارب الموصوفة في المخطوطة تتبع المبادئ التوجيهية لمؤسستنا وتم تنفيذها وفقا للقانون السويسري للتجارب الحيوانية (الترخيص: VD3194) وللبحوث المتعلقة بعينات الإنسان (البروتوكول: 235/14 ؛ CER-VD 2017-00490)

1. استخراج الخلايا الجذعية للدم

  1. شراء الفئران نوع C57BL6/J البرية والاحتفاظ بها في منزل الحيوانية لمده أسبوع علي الأقل للحد من الإجهاد المرتبطة بالنقل.
  2. في يوم التجربة ، موت ببطء الماوس باستخدام الاختناق CO2 .
  3. رش الماوس مع 70 ٪ الايثانول لتعقيم الفراء وقطع فتح الماوس في البطن باستخدام الاداات الجراحية القياسية ، مثل مقص تشريح وملقط ، لقطع عظم الفخذ وعظم الساق من الساقين الخلفيتين.
  4. أزاله العضلات تعلق علي عظم الفخذ ، الساق ، والحوض باستخدام منشفه ورقيه لينه ووضع العظام التي تم تنظيفها في أنبوب 50 mL التي تحتوي علي برامج تلفزيونيه مع 1 مم أدتا (العازلة) علي الجليد.
  5. رش مدفع هاون ومدقه مع 70 ٪ الايثانول ووضعه في غطاء المحرك الثقافي للخلية. تعقيمها مع الاشعه فوق البنفسجية لمده 30 دقيقه. بعد التعقيم شطف هاون ومدقه مع العازلة لأزاله اثار الايثانول.
  6. وضع العظام نظيفه مع بعض العازلة (~ 10 مل) في هاون وسحق لهم بلطف للحصول علي نخاع العظم في التعليق. الآن ، وجمع تعليق الخلية وتمريرها من خلال مصفاه الخلية 70 μm في أنبوب 50 mL للحصول علي تعليق خليه واحده.
  7. كرر الخطوة 1.6 حتى يتم استخراج كل نخاع العظم والحطام العظام تحولت الأبيض.
  8. وضع أنبوب (s) 50 mL التي تحتوي علي نخاع العظم تعليق خليه واحده علي جهاز الطرد المركزي. تشغيل جهاز الطرد المركزي في 300 x g ل 10 دقيقه في 4 °c إلى بيليه الخلايا.
  9. وفي الوقت نفسه ، اعداد 10 مل من 1x تحلل العازلة في الماء المقطر معقمه. تصفيه الحل من خلال فلتر 0.22 μm.
  10. جمع أنبوب عينه من جهاز الطرد المركزي وصب في supernatant. ماصه 1x المخزن المؤقت تحلل (جدول المواد) علي بيليه الخلية. طرد بيليه واعداد حل متجانس عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا بضع مرات. السماح للأنبوب ان يكون في درجه حرارة الغرفة لمده 1-2 دقيقه لتحلل ار بي سي ان يحدث. إيقاف عمليه تحلل عن طريق ملء أنبوب مع المخزن المؤقت.
  11. وضع أنبوب علي جهاز الطرد المركزي وتدور في 300 x g لمده 5 دقائق في 4 ° c. جمع الأنبوب من جهاز الطرد المركزي وصب supernatant. أعاده تعليق بيليه عن طريق أضافه 10 مل من العازلة وتصفيه الحل في أنبوب 50 mL جديده عن طريق مصفاه الخلية 70 μm لأزاله الحطام بسبب تحلل ار بي سي.
  12. الطرد المركزي أنبوب في 300 x g لمده 5 دقائق في 4 °c. جمع الأنبوب من جهاز الطرد المركزي وصب supernatant. أعاده تعليق بيليه في 500 μL من المخزن المؤقت.
  13. أزاله قسامه 100 μl والاحتفاظ في أنبوب منفصل 1.5 mL. أضافه 50 μl من البيوتين سلاله الأجسام المضادة استنزاف كوكتيل من مجموعه الإثراء سلف (جدول المواد) إلى المتبقية 450 μl من تعليق الخلية. احتضان في 4 درجه مئوية علي شاكر لمده 15 دقيقه.
  14. أضافه 15 مل من العازلة والطرد المركزي الأنبوب في 300 x g ل 5 دقيقه في 4 °c. جمع الأنبوب من جهاز الطرد المركزي وصب supernatant. أعاده تعليق بيليه في 460 μL من المخزن المؤقت. أزاله 10 μl قسامه والاحتفاظ في أنبوب منفصل 1.5 mL.
  15. أضافه 50 μl من الخرز المغناطيسي العقديات من مجموعه الإثراء سلف (جدول المواد) ، إلى تعليق الخلية المتبقية 450 μl. احتضان في 4 درجه مئوية علي شاكر لمده 15 دقيقه.
  16. أضافه 15 مل من العازلة والطرد المركزي الأنبوب في 300 x g ل 5 دقيقه في 4 °c. جمع الأنبوب من جهاز الطرد المركزي وصب supernatant. أعاده تعليق بيليه في 5 مل من العازلة ونقل الحل إلى أنبوب 15 مل.
  17. خذ الأنبوب إلى فاصل الخلايا الألى (جدول المواد). تشغيل برنامج غسيل لشطف ورئيس أنابيب فاصل الخلية. وضع العينة واثنين من أنابيب جمع علي حامل أنبوب. تنفيذ الفصل باستخدام برنامج "تستنفد". جمع الكسور الموجبة والسالبة من فاصل الخلايا المؤتمتة بمجرد انتهاء التشغيل.
    ملاحظه: في غياب فاصل الخلايا التلقائي يمكن للمستخدمين استخدام الاعمده المغناطيسية اليدوية والمغناطيس المقابلة ، في دليل المستخدم. يجب علي المستخدمين ان نضع في اعتبارنا ان عمليه الفصل اليدوي إبطا من الألى واحد. أيضا ، الاعمده اليدوية هي أكثر عرضه لانسداد. ولذلك ، ينصح المستخدمين لتخفيف العينة والتحميل علي العمود ببطء.
  18. تجاهل الجزء الموجب. ملء أنبوب كسر السلبية مع العازلة. الطرد المركزي أنبوب في 300 x g لمده 5 دقائق في 4 °c.
  19. وفي الوقت نفسه ، واعداد مزيج الأجسام المضادة في 1 مل من حل حجم النهائي والضوابط أحاديه اللون في 200 μL من حل حجم النهائي كما هو موضح في جدول المواد والجدول 1.
    ملاحظه: إذا كانت TMRM ووصمه الفلورية الخضراء الميتوكوندريا هي التي سيتم الجمع بينها مع تلطيخ علامة الخلايا الجذعية ، ثم استبدال CD150 مع CD150-PEcy5 و العقديات مع الأحمر مع العقديات الدين باك البرتقالي.
  20. جمع أنبوب عينه من جهاز الطرد المركزي وصب في supernatant. أعاده تعليق بيليه في 1 مل من مزيج الأجسام المضادة. أضافه 10 μL من الخلايا (من الخطوة 1.13) في كل من أنابيب التحكم أحاديه اللون (باستثناء النسب). أضافه 10 μL من الخلايا (من الخطوة 1.14) في أنبوب لون واحد السلالة.
  21. احتضان العينة وأنابيب التحكم أحاديه اللون في 4 درجه مئوية علي شاكر لمده 45 دقيقه. تغطيه دلو الجليد مع غطاء أو رقائق ألومنيوم.
  22. ملء جميع أنابيب مع العازلة والطرد المركزي في 300 x g ل 5 دقيقه في 4 ° c. تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق العينة في 1 مل من المخزن المؤقت وعناصر التحكم أحاديه اللون في 200 μl من المخزن المؤقت.
  23. نقل العينة وعناصر التحكم أحاديه اللون إلى 5 مل مرشح أنابيب FACS اعلي.
  24. تاخذ الأنابيب إلى اله الفرز وفرز السكان HSC (استراتيجية النابضة في الشكل 1ا) في أنابيب 1.5 mL التي تحتوي علي 400 μl من الخلايا الجذعية توسيع المتوسطة.

2. السابق فيفو الثقافة من الخلايا الجذعية التي تكون الدم

  1. جمع الأنابيب التي تحتوي علي خلايا مفروزه (انظر القسم 1 لاستخراج الخلايا). الطرد المركزي أنابيب في 300 x g لمده 5 دقائق في 4 ° c. برفق أزاله معظم ماده طافي دون التخلص من بيليه وترك 50-80 μl علي راس بيليه الخلية. وهذا يقلل من فقدان الخلايا.
  2. أعاده تعليق بيليه الخلية في متوسط توسيع الخلايا الجذعية إلى حجم نهائي يعتمد علي عدد الشروط التي يجب اختبارها (العد ل 100 μL لكل بئر/حاله الثقافة).
  3. اعداد الثقافة 2x المتوسطة التي تحتوي علي توسيع الخلايا الجذعية المتوسطة ، عامل الخلايا الجذعية (200 ng/ml) ، FLT3 يجند (4 نانوغرام/مل) والمضادات الحيوية القلم-بكتيريا (1 ٪) (2x المتوسطة القاعدية; جدول المواد).
  4. تاخذ ثقافة الانسجه المعقمة معالجه 96 لوحه البئر السفلي (جدول المواد) وتحديد الآبار حيث سيتم استزراع الخلايا (تصميم لوحه في الشكل 1ب).
    ملاحظه: وينصح المستخدمين لتجنب الآبار الهامشية ، لأنها أكثر عرضه لتبخر.
  5. وضع 100 μL من المتوسطة 2x القاعدية التي أعدت سابقا في الخطوة 2.3 في هذه الآبار. في NR ملحوظ أضافه 2 μL من محلول NR 100x (جدول المواد). تجديد NR كل 24 ساعة.
    ملاحظه: التجديد محدد ل NR. قد المغيرين الأيض الأخرى أو قد لا تحتاج إلى تجديد.
  6. البذور 100 μL من الخلايا التي أعدت في الخطوة 2.2 علي راس الآبار التي تحتوي علي 2x المتوسطة القاعدية. في هذه التجربة كان عدد HSCs المصنفة في بئر ما بين 800-1000 الخلايا.
  7. اعداد خمسه ابار اضافيه تحتوي علي 2x المتوسطة القاعدية. في كل من هذه أضافه 100,000 خلايا نخاع العظم الكامل (من الخطوة 1.13) أعاده تعليق في 100 μL من الخلايا الجذعية التوسع المتوسطة لاستخدامها كعناصر تحكم تلطيخ لتحليل التدفق الخلوي بعد الثقافة.
    ملاحظه: إذا كان المستخدمون يريدون الجمع بين علامات الخلايا الجذعية وعلامات الميتوكوندريا لتحليل ما بعد الثقافة فمن المستحسن ان فرز بالاضافه إلى ذلك السكان سلف (اما ckit + الخلايا أو LKSCD150). البذور هذه الأسلاف فرزها في الآبار السيطرة تلطيخ لتحليل التدفق الخلوي بعد الثقافة. اعداد واحد جيدا لكل لون وصمه عار واحده.
  8. وضع 200 μL من المياه المعقمة في جميع الآبار المحيطة للحد من التبخر من الآبار التي تحتوي علي الخلايا. ترك لوحه دون عائق في حاضنه في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لمده الفترة الثقافية (72 h). أزاله لوحه لتجديد NR كل 24 ح ووضعه مره أخرى في الحاضنة.

3. قياس الكتلة المتقدريه والاغشيه المحتملة

  1. في نهاية الفترة الثقافية اعداد محلول 100x من TMRM (20 μM) و Mitotracker الأخضر (10 μM) (الأخضر وصمه عار الفلورسنت) في الخلية الجذعية توسيعالمتوسطة (جدول المواد).
  2. أضافه 2 μL من الحل TMRM 100x و 2 μL من 100x الأخضر الحل وصمه عار الفلورسنت في كل من ابار الاختبار. أضافه 2 μL من 100x TMRM في التحكم TMRM جيدا. أضافه 2 μL من 100x الأخضر وصمه عار الفلورسنت في السيطرة Mitotracker جيدا. وضع لوحه مره أخرى في حاضنه في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 ل 45 دقيقه تغطيه الأعلى من لوحه مع رقائق ألومنيوم.
    ملاحظه: ويمكن اعداد عنصر تحكم إضافي مع فيراباميل (المثبط مضخة abc) إذا كانت مضخة abc بوساطة صبغ افلوكس يحتاج إلى اختبار. لهذا ، أضافه 50 μM فيراباميل في واحده من الآبار اختبار 1 ح قبل تلطيخ ل TMRM والأخضر وصمه عار الفلورسنت.
  3. أزاله لوحه من الحاضنة والطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق عكس لوحه لأزاله supernatant. أضافه 200 μL من المخزن المؤقت FACS القياسية (برنامج تلفزيوني-1 مم أدتا-P/S-2 ٪) ، والطرد المركزي لوحه في 300 x g لمده 5 دقائق أزاله supernatant. كرر هذه الخطوة الغسيل 3x. يجب علي المستخدمين التاكد من ان يتم تغطيه لوحه دائما مع إحباط ، لتوفير الحد الأدنى من التعرض للضوء المباشر.
    ملاحظه: إذا كان المستخدمون بحاجه إلى الجمع بين تلطيخ الميتوكوندريا مع تلطيخ الخلايا الجذعية ، فان العينة تحتاج إلى حضن مع مزيج من الأجسام المضادة من جميع علامات الخلايا الجذعية والضوابط أحاديه اللون سوف تحتاج إلى ان ملطخه الأجسام المضادة الفردية بشكل منفصل في 4 درجه مئوية لمده 30-45 دقيقه.
    ملاحظه: في جميع الخطوات يجب علي المستخدمين الحفاظ علي لوحه مغطاه رقائق ألومنيوم. يجب علي المستخدمين ملاحظه ان هذه الخطوة تلطيخ اضافيه وخطوات الغسيل اللاحقة يمكن ان يؤدي إلى فقدان خلايا اضافيه.
  4. أعاده تعليق الخلايا في 200 μL من المخزن المؤقت FACS ونقلها إلى أنابيب FACS.
  5. تشغيل العينات علي مقياس التدفق الخلوي (انظر الشكل 1). وتشمل أنابيب أحاديه اللون التي تحتوي علي WBM: (1) غير ملون ؛ (2) DAPI ؛ (3) TMRM (PE) ؛ (4) بقعه الفلورسنت الخضراء (FITC) ؛ (5) وصمه عار كامل (PE و FITC).
  6. أولا الحصول علي عناصر التحكم أحاديه اللون لاعداد الجهاز. استخدم البرنامج قيد التشغيل علي الجهاز لحساب التعويض. بمجرد تطبيق التعويض ، احصل علي عينه HSC وسجل أكبر عدد ممكن من الاحداث.
    ملاحظه: إذا تم الجمع بين الخلايا الجذعية وعلامات الميتوكوندريا ، المستخدمين بحاجه إلى توخي الحذر بشكل خاص مع التعويض بين TMRM (PE) ، CD150 (PE-Cy5) ، و Sca-1 (APC). أيضا ، يجب تشغيل العينات مباشره بعد تلطيخ.
  7. تصدير ملفات FACS من مقياس المضخم الخلوي وتحليل البيانات علي برنامج تحليل (جدول المواد).
    1. للتحليل ، افتح الملف علي برنامج التحليل. باستخدام FSC-A و SSC-A النابضة تحديد السكان الخلية. تحديد singlets في البوابات التالية قبل التخطيط لكسر DAPI السالب (الخلايا الحية). في بوابه الخلية الحية جعل مؤامرة كفاف في TMRM والخضراء وصمه عار الفلورسنت قناه لقياس ΔΨm والشامل ، علي التوالي (الشكل 2ا). تصدير متوسط كثافة مضان (مؤسسه مونتانيار) من هاتين القناتين في بوابه الخلية الحية.
    2. يتم تعيين بوابه منخفضه TMRM علي أساس السكان الكتف في قناه TMRM. يمكن استخدام عنصر تحكم TMRM أحاديه اللون للتعرف علي هذا العدد من الكتفين لتعيين البوابة. تصدير نسبه الخلايا الحية في بوابه منخفضه TMRM في التحكم وعينات الاختبار للتخطيط.

النتائج

في الشكل 1 نعرض استراتيجية النابضة لعزل الخلايا الجذعية التي تكون الدم من نخاع العظم الماوس وتخطيط لوحه للثقافة الجسم السابق. ويبين الشكل 1الف تحديد الجزء اللمفاوي في SSC-a/FSC-مؤامرة. تمت أزاله المشككات في بوابه قميص متبوعا بتحديد الخلايا الحية بسبب ?...

Discussion

التنظيم المحكم لوظيفة HSC مهم للحفاظ علي الدم مستقره خلال حياه الكائن الحي. مثل مختلف أنواع الخلايا الأخرى في الجسم ، عنصرا رئيسيا يساهم في تنظيم وظيفة HSC هو الأيض الخلوي. الدراسات السابقة من مختبرنا9 وغيرها2,3 وقد تورطت في اهميه الميتوكوندريا في ?...

Disclosures

وقد قدمت بعض عناصر هذا العمل كطلب P1828EP00 إلى المكتب الأوروبي للبراءات.

Acknowledgements

نشكر المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي UNIL علي دعمهم وخاصه الدكتور رومان بيديل. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه مؤسسه كريستيان غيرهارد جيسن المقدمة إلى الجمعية التاسيسيه

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL FACS tubesFalcon352235Sample preparation
96-U bottom plateCorning3799Cell culture
AutoMACS pro separatorMiltenyi BiotecAutomatic Cell separation
BD FACS AriaIIIBecton and DickinsonCell sorting
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kitBD558451Lineage depletion
BD LSRIIBecton and DickinsonFACS acquisition machine
BD-DIVABecton and DickinsonAcquisition software
CD150 PEBiolegend115904Antibody staining mix
CD150 PE-Cy5Biolegend115912Antibody staining mix
CD48 PBBiolegend103418Antibody staining mix
Centrifuge- 5810REppendorfCentrifugation
Ckit PeCy7Biolegend105814Antibody staining mix
Flow joFlowJo LLCFACS Analysis software
GraphPad-PrismGraphPadPlotting data into graphs
Mitotracker GreenInvitrogenM7514Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM
Nicotinamide Riboside (NR)Custom synthesized in houseMetabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM
PBSCHUV1000324Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
Pen-Strep (P/S)Life technologies15140122Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
RBC Lysis bufferBiolegend420301Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)RnD427-FL-005/CFEx vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL
Recombinant mouse stem cell factor (SCF)RnD455-MC-010/CFEx vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL
Sca1 APCThermo Fisher Scientific17-5981-82Antibody staining mix
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion MediumSIGMAS0192Ex vivo culture
Streptavidin Pac orangeLife TechnologiesS32365Antibody staining mix
Streptavidin Tx redLife TechnologiesS872Antibody staining mix
TMRMInvitrogenT668Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM
Ultra pure EDTAInvitrogen15575-038Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM

References

  1. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  2. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  3. Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
  4. Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
  5. Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
  6. Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
  7. Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
  8. Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
  9. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
  10. Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
  11. Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
  12. Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
  13. Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
  14. Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
  15. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).
  16. Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
  17. Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
  18. van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
  19. Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).
  20. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  21. Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
  22. Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
  23. Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

154

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved