造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

要約

ここでは、生体内培養造血幹細胞およびT細胞におけるミトコンドリア質量および膜電位を測定する信頼性の高い方法について説明する。

要約

静止、自己再生、分化の微妙なバランスは、造血幹細胞(HSC)プールを維持し、すべての成熟した血液細胞の生涯産生を維持するための鍵です。近年、細胞代謝はHSC機能と運命の重要な調節装置として浮上している。ミトコンドリア代謝の変調がHSCの運命に影響を与えることを以前に実証しました。具体的には、電子輸送鎖を化学的に結合させることで、通常は急速な分化を誘発する培養条件下でHSC機能を維持することができた。しかし、HSC数を制限すると、多くの場合、HSC代謝を測定するために標準アッセイを使用することを妨げ、したがって、その機能を予測します。ここでは、HSCなどの希少細胞におけるミトコンドリア膜電位とミトコンドリア質量の信頼性の高い測定を可能にする簡単なフローサイトメトリーアッセイを報告する。マウス骨髄からのHSCの分離とミトコンドリア質量および膜電位ポストex vivo培養の測定について議論する。一例として、代謝モジュレーターによる治療を介してHSCにおけるこれらのパラメータの変調を示す。さらに、ヒト末梢血由来T細胞およびヒト腫瘍浸潤リンパ球(TI)に対するこの方法論の適用を拡張し、ミトコンドリアプロファイルに劇的な違いを示し、異なるT細胞を反映している可能性がある機能。このアッセイは、様々な細胞型のミトコンドリア代謝の調節剤を異なる文脈で同定するスクリーニングに用いることができると考えています。

概要

造血幹細胞(HSC)は、生物の生涯を通じて血液産生と恒常性を確保する骨髄に存在する細胞の小さな集団である。HSCは、末端分化した成熟血系統を数ラウンドの細胞分裂および十分に調整された分化ステップ¹を介して末端分化した成熟血統を生成する前駆体を生じさせることによって、このプロセスを仲介する。重要なことに、HSCは嫌気性糖分析を介してエネルギーを生成します。対照的に、よりコミットされ、活性造血前駆者は、ミトコンドリア代謝^2、3、4に向けて代謝を切り替える。この明確な代謝状態は、活性ミトコンドリアによって産生される活性酸素種(ROS)によって生じた細胞損傷からHSCを保護すると考えられており、それによって、その長期インビボ機能^{5、6、7、8}を維持する。HSC代謝状態の直接測定は困難であり、多くの場合、その限られた数のために低スループットです。ここでは、HSCにおける緑色蛍光ミトコンドリア染色(ミトトラッカーグリーン)を用いたテトラメチルロウダミンメチルエステル(TMRM)蛍光を用いたミトコンドリア膜電位(ΔΔμm)の堅牢測定のためのフローサイトメトリー系アッセイとミトコンドリア塊について説明する。我々は、低ΔΔmが高度に精製されたHSC⁹のボナフィード機能マーカーであり、ΔΔmを下げることができる代謝モジュレーターがHSC機能^9、10を増強することを以前に実証した。ここでは、HSCの長期血液再構成電位を向上させることができる新規分子を同定する戦略として、HSCミトコンドリアプロファイリングに関する手法の利用を提案する。

一例として、このアッセイは、ビタミンB3アナログニコチンアミドリボシド(NR)への曝露時にHSC ΔΔΜmの低下を確実に測定することを実証した。従って、最近発表された研究では、造血幹および前駆体機能¹⁰を直接改善することにより、NRがマウスとヒト化マウスシステムの両方で血液回収後移植を強く改善することを実証した。このような代謝調節剤の能力は、25%の死亡率が移植後の患者^11、12における血液および免疫回復の遅延に関連していることを考慮すると、大きな臨床的価値がある。

さらに、この方法論がヒトT細胞の代謝プロファイルおよび機能の特徴付けに適用され得る証拠を提供する。近年、自己腫瘍浸潤リンパ球(TI)を用いた養子細胞療法(ACT)の開発は、非常に不利な予後を有する特定のタイプの進行癌に対して最も効果的なアプローチとなっている(例えば、転移性黒色腫、患者の50%が治療に反応し、患者の24%が完全に退行している^)13。しかしながら、十分な抗腫瘍活性を有するTLSは¹⁴を生成することが困難である。ex vivo膨張の間にTLSが受ける広範な増殖および刺激は、T細胞抗腫瘍応答¹⁵を劇的に損なうT細胞の枯渇および老化を引き起こす。重要なことに、TLSの抗腫瘍能は、それらの代謝^16、17と密接に関連しており、PI3K/Akt経路の阻害を介して代謝を調節することを目的としたアプローチは、励ましの結果^18、19を生み出している。このため、末梢血単核細胞(PBMC)および患者由来TCAL由来のT細胞のΔΔmを比較し、末端分化TLと比較してPBMC由来T細胞の分化が少ないΔΔmおよびミトコンドリア質量が低いことを示しています。

このアッセイは、ΔΔmの変調を介してHSCおよびT細胞機能を改善する新規代謝モジュレーターを同定するために使用できることを想定しています。

プロトコル

原稿に記載されているすべての実験は、当社の機関のガイドラインに従い、動物実験(認証:VD3194)およびヒトサンプルを含む研究のためのスイスの法律に従って行われました(プロトコル:235/14;CER-VD 2017-00490)

1. 造血幹細胞抽出

1. 野生型C57BL6/Jマウスを購入し、輸送関連のストレスを軽減するために、少なくとも1週間動物の家に保管してください。
2. 実験当日_、CO2窒息を用いてマウスを安楽死させる。
3. 70%エタノールでマウスをスプレーし、毛皮を殺菌し、切除ハサミや鉗子などの標準的な外科用具を使用して腹でマウスを切り開き、後ろ足から大腿骨と脛骨の骨を切断します。
4. 柔らかいペーパータオルを使って大腿骨、脛骨、骨盤に付着した筋肉を取り除き、1mM EDTA(緩衝液)のPBSを含む50mLチューブに洗浄された骨を氷の上に置きます。
5. 70%エタノールでモルタルと害虫をスプレーし、細胞培養フードに入れ。30分間UVで殺菌し、後の殺菌は、エタノールの痕跡を除去するために、緩衝液でモルタルと害虫をすすす。
6. きれいな骨を緩衝液(約10mL)でモルタルに入れ、やさしくつぶして骨を懸濁液で出します。ここで、細胞懸濁液を収集し、70 μmのセルストレーナーを通して50 mLチューブに渡し、単一のセル懸濁液を得ます。
7. すべての骨髄が抽出され、骨の破片が白くなるまで、手順 1.6 を繰り返します。
8. 骨髄単細胞懸濁液を含む50mLチューブを遠心分離機に置きます。遠心分離機を300 x gで4°Cで10分間実行し、細胞をペレットにします。
9. 一方、オートクレーブ蒸留水中に1x RBCリシス緩衝液の10mLを調製する。0.22μmフィルターで溶液をろ過します。
10. 遠心分離機からサンプルチューブを収集し、上清をデカントします。細胞ペレット上の1x RBCリシスバッファー(材料の表)をピペット。ペレットを外し、数回上下にピペットをして均質な溶液を調製します。RBCリシスが発生するために、チューブを室温で1~2分間使用できるようにします。チューブをバッファーで満たすことによって、lysisプロセスを停止します。
11. 遠心分離機の上にチューブを置き、300 x gで回転し、4 °Cで5分間回転させます。遠心分離機からチューブを収集し、上清をデカントします。10 mLのバッファーを加えてペレットを再懸濁し、70μmの細胞ストレーナーを介して溶液を新しい50 mLチューブにフィルター処理し、RBC溶解による破片を除去します。
12. チューブを300 x gで遠心分離し、4°Cで5分間。遠心分離機からチューブを収集し、上清をデカントします。ペレットを500°Lのバッファで再サスペンドします。
13. 100 μL アリコートを取り出し、別の 1.5 mL チューブに入れておいてください。前駆体濃縮キット(材料表)から50μLのビオチン系統破壊抗体カクテルを、残りの450μLの細胞懸濁液に加えます。シェーカーで4°Cで15分間インキュベートします。
14. 15 mLの緩衝液を加え、チューブを300 x gで遠心分離し、4°Cで5分間分。遠心分離機からチューブを収集し、上清をデカントします。ペレットを460°Lのバッファで再サスペンドします。10 μL アリコートを取り出し、別の 1.5 mL チューブに入れておいてください。
15. 前駆体濃縮キット(材料表)からストレプトアビジン磁気ビーズを50μLを残りの450μL細胞懸濁液に加えます。シェーカーで4°Cで15分間インキュベートします。
16. 15 mLの緩衝液を加え、チューブを300 x gで遠心分離し、4°Cで5分間分。遠心分離機からチューブを収集し、上清をデカントします。ペレットを5mLの緩衝液で再サスペンドし、溶液を15mLチューブに移します。
17. チューブを自動セルセパレータ(材料の表)に持って行きます。洗浄プログラムを実行して、細胞分離器のチューブをすすいでプライムします。サンプルと2本の回収管をチューブホルダーに置きます。"枯渇" プログラムを使用して分離を実行します。実行が終了したら、自動セル区切り文字から正の分数と負の分数を収集します。
    注:自動セルセパレータがない場合、ユーザーは手動磁気カラムと対応する磁石をユーザーマニュアルに従って使用できます。ユーザーは、手動による分離のプロセスが自動化されたプロセスよりも遅いことを念頭に置く必要があります。また、手動列は目詰まりが起こりやすくなります。したがって、サンプルをゆっくりと希釈し、列に読み込むようにお勧めします。
18. 正の分数を破棄します。負の分数チューブをバッファで埋めます。チューブを300 x gで遠心分離し、4°Cで5分間。
19. 一方、材料表及び表1に記載の最終体積溶液の200μLにおける最終体積溶液と単色制御の1mLで抗体ミックスを調製する。
    注:TMRMと緑色蛍光ミトコンドリア染色を幹細胞マーカー染色と組み合わせる場合は、CD150-PEをCD150-PEcy5、ストレプトアビジン-Txをストレプトアビジン-パックオレンジと交換してください。
20. 遠心分離機からサンプルチューブを収集し、上清をデカントします。抗体ミックスの1 mLでペレットを再サスペンドします。各単色制御管(系統を除く)に10μLのセル(ステップ1.13から)を加えます。系統単色チューブに10μLのセル(ステップ1.14から)を加えます。
21. 45分間シェーカーでサンプルと単色のコントロールチューブを4°Cでインキュベートし、氷のバケツを蓋またはアルミ箔で覆います。
22. すべてのチューブに緩衝液を充填し、4°Cで5分間300 x gで遠心分離機を充填します。上清を破棄し、200°Lのバッファで1mLのバッファとシングルカラーコントロールでサンプルを再サスペンドします。
23. サンプルとシングルカラーコントロールを5 mLフィルタートップFACSチューブに転送します。
24. チューブを選別機に持ち込み、400μLの幹細胞膨張培地を含む1.5mLチューブにHSC集団(図1Aのゲーティング戦略)を選別します。

2. 造血幹細胞のEx Vivo培養

1. ソートされた細胞を含むチューブを収集します(細胞抽出についてはセクション1を参照してください)。チューブを300 x gで遠心分離し、4°Cで5分間。ペレットを外さずに上清の大部分を軽く取り除き、細胞ペレットの上に50~80μLを残します。これにより、セルの損失を最小限に抑えることができます。
2. 幹細胞膨張培地中の細胞ペレットを、試験する条件の数に応じて最終体積に再サスペンドする(培養の井戸/状態当たり100°Lのカウント)。
3. 幹細胞膨張培地、幹細胞因子(200ng/mL)、FLT3リガンド(4ng/mL)、ペンストレップ系抗生物質(1%)を含む2倍培養培地を調製(2x基底媒体;材料表)。
4. 96 U底井戸プレート(材料表)を処理した無菌組織培養物を取り、細胞が培養される井戸を特定する(図1Bのプレート設計)。
   注:彼らは蒸発の影響を受けやすいので、ユーザーは、限界井戸を避けることをお勧めします。
5. これらの井戸に、ステップ2.3で調製した2x基底媒体の100μLを入れます。NRでよくマークされた100x NR溶液の2°Lを追加します(材料の表)。24 時間ごとに NR を補充します。
   注:補充は NR に固有です。他の代謝調節剤は補充を必要とするかもしれないし、必要ないかもしれない。
6. 2x基底培地を含むウェルの上にステップ2.2で調製した細胞の種子100μL。この実験では、ウェル当たりのHSCシード数は800~1,000細胞であった。
7. 2x基礎培地を含む5つの余分な井戸を準備します。これらのそれぞれに100,000個の全骨髄細胞(ステップ1.13から)を加え、100μLの幹細胞膨張培地に再懸濁し、培養後のサイトメトリー分析の染色制御として使用する。
   注:ユーザーが培養後の分析のために幹細胞マーカーとミトコンドリアマーカーを組み合わせる場合は、前駆者集団(Ckit+細胞またはLKSCD150-細胞のいずれか)をさらにソートすることをお勧めします。これらの選別前駆者を染色制御ウェルに播種し、培養後サイトメトリー分析を行う。単一の染色色ごとに1ウェルを準備します。
8. 周囲のすべての井戸に200μLのオートクレーブ水を入れ、細胞を含む井戸からの蒸発を減らします。培養期間(72時間)の間、37°Cと5%CO2のインキュベーターにプレートを乱さずにおきます。プレートを取り外して24時間ごとにNRを補充し、インキュベーターに戻します。

3. ミトコンドリア質量と膜電位の測定

1. 培養期間の終わりに、幹細胞増殖培地(材料表)にTMRM(20μM)とミトトラッカーグリーン(10μM)(緑色蛍光染色)の100x溶液を調製する。
2. 各試験ウェルに100x TMRM溶液2μL、100x緑色蛍光染色液2μLを加えます。TMRMコントロールウェルに100x TMRMの2 μLを追加します。ミトトラッカーコントロールに100x緑色蛍光染色の2μLを加えます。プレートを37°Cのインキュベーターに戻し、5%CO₂を45分間置き、プレートの上部をアルミホイルで覆います。
   注:ベラパミル(ABCポンプ阻害剤)による追加のコントロールは、ABCポンプ媒介色素流出をテストする必要がある場合に調製することができる。このために、TMRMおよび緑色蛍光染色の染色前に、試験井戸1時間の1つに50μMベラパミルを加えます。
3. インキュベーターからプレートを取り出し、300 x gで5分間遠心分離します。標準FACSバッファ(PBS-1 mM EDTA-P/S-2%FBS)を200μL加え、300 x gでプレートを遠心分離し、上清を取り除きます。この洗浄ステップ3xを繰り返します。ユーザーは、直接光への露出を最小限に抑えるために、プレートが常に箔で覆われていることを確認する必要があります。
   注:ユーザーがミトコンドリア染色と幹細胞染色を組み合わせる必要がある場合、サンプルはすべての幹細胞マーカーの抗体ミックスでインキュベートする必要があり、単色コントロールは30〜45分間4°Cで個別の抗体で別々に染色する必要があります。
   注:すべてのステップで、ユーザーはアルミニウム箔で覆われたプレートを維持する必要があります。ユーザーは、この追加の染色ステップとその後の洗浄ステップは、追加の細胞損失につながる可能性があることに注意する必要があります。
4. FACSバッファーの200°Lで細胞を再サスペンドし、FACSチューブに転送します。
5. フローサイトメーターでサンプルを実行します(図1を参照)。WBMを含む単色チューブは次のとおりです: (1) 未染色;(2) DAPI;(3) TMRM (PE);(4) 緑色蛍光染色 (FITC);(5) 完全な汚れ(PEおよびFITC)。
6. まず、マシンをセットアップするための単色コントロールを取得します。マシン上で実行中のソフトウェアを使用して、補正を計算します。補正が適用されたら、HSC サンプルを取得し、できるだけ多くのイベントを記録します。
   注:幹細胞とミトコンドリアマーカーを組み合わせる場合、ユーザーはTMRM(PE)、CD150(PE-Cy5)、およびSca-1(APC)間の補償に特に注意する必要があります。また、サンプルは、染色後すぐに実行する必要があります。
7. サイトメーターから FACS ファイルをエクスポートし、解析ソフトウェア上のデータを分析します (材料表) 。
   1. 分析のために、分析ソフトウェアでファイルを開きます。FSC-AおよびSSC-Aゲーティングを使用して、細胞集団を同定する。DAPI 負の分数 (生細胞) をプロットする前に、次のゲートで単一の部分を識別します。ライブセルゲートでは、TMRMと緑色蛍光染色チャネルで等高線プロットを作成し、それぞれΔΔmと質量を測定します(図2A)。ライブセルゲート内のこれら2チャンネルの平均蛍光強度(MFI)をエクスポートします。
   2. TMRM 低ゲートは、TMRM チャネルの肩の人口に基づいて設定されます。TMRMシングルカラーコントロールを使用して、この肩の母集団を識別してゲートを設定できます。TMRMローゲート内のセルの生の比率をコントロールにエクスポートし、プロット用の検定サンプルを作成します。

結果

図1では、マウス骨髄からの造血幹細胞の分離と、そのex生体内培養のためのプレートのレイアウトに対するゲーティング戦略を示す。図1Aは、SSC-A/FSC-Aプロットにおけるリンパ球画分の同定を示す。ダブレットはシングルトゲートで除去され、続いてDAPIシグナルの不在による生細胞の同定を行った。系統-Sca1+cKit+によって定義される

ディスカッション

HSC機能の厳しい調節は、生物の生涯の間に安定した造馬を維持するために重要である。体内の様々な他の細胞タイプと同様に、HSC機能の調節に寄与する重要な成分は細胞代謝である。私たちの研究室⁹および他の^2、3からの以前の研究は、HSCにおける明確な代謝状態を維持する上でミトコンドリアの重要性を含んでいた。マウス骨髄から分離されたHS...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL FACS tubes	Falcon	352235	Sample preparation
96-U bottom plate	Corning	3799	Cell culture
AutoMACS pro separator	Miltenyi Biotec		Automatic Cell separation
BD FACS AriaIII	Becton and Dickinson		Cell sorting
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit	BD	558451	Lineage depletion
BD LSRII	Becton and Dickinson		FACS acquisition machine
BD-DIVA	Becton and Dickinson		Acquisition software
CD150 PE	Biolegend	115904	Antibody staining mix
CD150 PE-Cy5	Biolegend	115912	Antibody staining mix
CD48 PB	Biolegend	103418	Antibody staining mix
Centrifuge- 5810R	Eppendorf		Centrifugation
Ckit PeCy7	Biolegend	105814	Antibody staining mix
Flow jo	FlowJo LLC		FACS Analysis software
GraphPad-Prism	GraphPad		Plotting data into graphs
Mitotracker Green	Invitrogen	M7514	Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM
Nicotinamide Riboside (NR)	Custom synthesized in house		Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM
PBS	CHUV	1000324	Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
Pen-Strep (P/S)	Life technologies	15140122	Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
RBC Lysis buffer	Biolegend	420301	Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)	RnD	427-FL-005/CF	Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL
Recombinant mouse stem cell factor (SCF)	RnD	455-MC-010/CF	Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL
Sca1 APC	Thermo Fisher Scientific	17-5981-82	Antibody staining mix
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium	SIGMA	S0192	Ex vivo culture
Streptavidin Pac orange	Life Technologies	S32365	Antibody staining mix
Streptavidin Tx red	Life Technologies	S872	Antibody staining mix
TMRM	Invitrogen	T668	Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM
Ultra pure EDTA	Invitrogen	15575-038	Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM