Medición de la masa mitocondrial y el potencial de la membrana en células madre hematopoyéticas y células T por citometría de flujo

Resumen

Aquí describimos un método confiable para medir la masa mitocondrial y el potencial de membrana en células madre hematopoyéticas cultivadas ex vivo y células T.

Resumen

Un equilibrio fino de reposo, auto-renovación y diferenciación es clave para preservar la piscina de células madre hematopoyéticas (HSC) y mantener la producción de por vida de todas las células sanguíneas maduras. En los últimos años el metabolismo celular ha surgido como un regulador crucial de la función hSC y el destino. Hemos demostrado previamente que la modulación del metabolismo mitocondrial influye en el destino del HSC. Específicamente, al desacoplar químicamente la cadena de transporte de electrones pudimos mantener la función HSC en condiciones de cultivo que normalmente inducen una rápida diferenciación. Sin embargo, limitar los números de HSC a menudo impide el uso de ensayos estándar para medir el metabolismo de HSC y, por lo tanto, predecir su función. Aquí, informamos de un simple ensayo de citometría de flujo que permite la medición confiable del potencial de la membrana mitocondrial y la masa mitocondrial en células escasas como los HSC. Discutimos el aislamiento de los HSC de la médula ósea del ratón y la medición de la masa mitocondrial y el potencial de membrana después del cultivo ex vivo. Como ejemplo, mostramos la modulación de estos parámetros en hSC a través del tratamiento con un modulador metabólico. Además, ampliamos la aplicación de esta metodología en los linfocitos T derivados de la sangre periférica humana y los linfocitos infiltrantes de tumores humanos (TIL), mostrando diferencias dramáticas en sus perfiles mitocondriales, posiblemente reflejando diferentes células T Funcionalidad. Creemos que este ensayo se puede emplear en los exámenes para identificar moduladores del metabolismo mitocondrial en varios tipos de células en diferentes contextos.

Introducción

Las células madre hematopoyéticas (HSC) son una pequeña población de células que residen en la médula ósea que aseguran la producción de sangre y homeostasis a lo largo de la vida útil de un organismo. Los HSC median este proceso dando lugar a progenitores que a su vez producen linajes de células sanguíneas maduras diferenciadas terminalmente a través de varias rondas de división celular y pasos de diferenciación bien orquestados¹. Es importante destacar que los HSC producen su energía a través de la glucólisis anaeróbica. Por el contrario, los progenitores hematopoyéticos más comprometidos y activos cambian su metabolismo hacia el metabolismo mitocondrial^2,3,4. Este estado metabólico distinto se cree para proteger los HSC sin daño celular infligido por especies reactivas de oxígeno (ROS) producidas por las mitocondrias activas, manteniendo así su función in vivo a largo plazo^5,6,7,8. La medición directa del estado metabólico de HSC es desafiante y a menudo de bajo rendimiento debido a sus números limitados. Aquí, describimos un ensayo basado en citometría de flujo para la medición robusta del potencial de la membrana mitocondrial (m) utilizando fluorescencia del éster metílico de tetrametilrhodamina (TMRM), y masa mitocondrial usando una mancha mitocondrial fluorescente verde (Mitotracker Green) en HSCs. Hemos demostrado previamente que el bajo-m es un marcador funcional de buena fidelidad de los HSC⁹ altamente purificados y moduladores metabólicos capaces de reducir la función de mejora de los HSCs^9,10. Aquí proponemos el uso de nuestro método sobre el perfilado mitocondrial de HSCs como estrategia para identificar moléculas novedosas capaces de mejorar el potencial de reconstitución sanguínea a largo plazo de los HSC.

A modo de ejemplo, demostramos que este ensayo mide de forma fiable la reducción de la HSC- m en la exposición a la vitamina B3 riboside de nicotinamida analógica (NR). En consecuencia, en nuestro estudio recientemente publicado demostramos que NR mejora fuertemente la recuperación de sangre después del trasplante en los sistemas de ratón y ratón humanizado mejorando directamente el tallo hematopoyético y las funciones progenitoras¹⁰. La capacidad de estos moduladores metabólicos es de gran valor clínico teniendo en cuenta que una tasa de mortalidad del 25% está relacionada con el retraso en la sangre y la recuperación inmune en pacientes posttrasplantes^11,12.

Además, proporcionamos evidencia de que esta metodología se puede aplicar para la caracterización del perfil metabólico y la función de las células T humanas. En los últimos años, el desarrollo de la terapia celular adoptiva (ACT) utilizando linfocitos infiltrantes tumorales autólogos (TIL) se ha convertido en el enfoque más eficaz para ciertos tipos de cáncer avanzado con pronóstico extremadamente desfavorable (por ejemplo, melanoma metastásico, donde >50% de los pacientes responden al tratamiento y hasta el 24% de los pacientes tienen regresión completa)¹³. Sin embargo, los TIL que albergan suficiente actividad antitumoral son difíciles de generar¹⁴. La amplia proliferación y estimulación que sufren los TIL durante la expansión ex vivo causan agotamiento de los tcelulares y senescencia que perjudican dramáticamente la respuesta antitumoral de los células T¹⁵. Es importante destacar que la capacidad antitumoral de los Til está estrechamente ligada a su metabolismo^16,17 y los enfoques destinados a modular el metabolismo a través de la inhibición de la vía PI3K/Akt han producido resultados alentadores^18,19. Por esta razón, comparamos el número de células T derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y TIL derivados del paciente, y demostramos que las células T menos diferenciadas de PBMC tienen una masa mitocondrial y de células mitocondriales más baja en comparación con los TIL diferenciados terminalmente.

Prevemos que este ensayo se puede utilizar para identificar nuevos moduladores metabólicos que mejoran la función de HSC y T a través de la modulación de la función de la célula T.

Protocolo

Todos los experimentos descritos en el manuscrito siguen las directrices de nuestra institución y se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación suiza para la experimentación animal (Autorización: VD3194) y para la investigación de muestras humanas (Protocolo: 235/14; CER-VD 2017-00490)

1. Extracción de células madre hematopoyéticas

1. Comprar ratones de tipo salvaje C57BL6 / J y mantenerlos en la casa de animales durante al menos una semana para reducir el estrés asociado al transporte.
2. El día del experimento, eutanasia el ratón usando la asfixia de CO_2.
3. Rocíe el ratón con 70% de etanol para esterilizar el pelaje y corte el ratón en el vientre usando herramientas quirúrgicas estándar, como tijeras de disección y fórceps, para cortar los huesos del fémur y la tibia de las patas traseras.
4. Retire los músculos unidos al fémur, la tibia y la pelvis usando una toalla de papel suave y coloque los huesos limpios en un tubo de 50 ml que contenga PBS con 1 mM de EDTA (buffer) sobre hielo.
5. Rocíe un mortero y pestle con 70% de etanol y colóquelo en una campana de cultivo celular. Esterilízalo con UV durante 30 minutos después de la esterilización Enjuague el mortero y pestle con tampón para eliminar restos de etanol.
6. Coloque los huesos limpios con un tampón (10 ml) en el mortero y aplaste suavemente para que la médula ósea salga en suspensión. Ahora, recoja la suspensión celular y pásela a través de un colador de células de 70 m en un tubo de 50 ml para obtener una suspensión de una sola célula.
7. Repita el paso 1.6 hasta que se haya extraído toda la médula ósea y los restos óseos se hayan vuelto blancos.
8. Coloque los tubos de 50 ml que contengan la suspensión de células únicas de la médula ósea en una centrífuga. Ejecuta la centrífuga a 300 x g durante 10 min a 4oC para peletizar las células.
9. Mientras tanto, prepare 10 ml de 1 tampón de lisis RBC en agua destilada autoclave. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 m.
10. Recoger el tubo de muestra de la centrífuga y decantar el sobrenadante. Pipetear el 1x tampón de lisis RBC(Tabla de materiales)en el pellet de celda. Desaloje el pellet y prepare una solución homogénea pipeteando hacia arriba y hacia abajo un par de veces. Deje que el tubo esté a temperatura ambiente durante 1-2 minutos para que se produzca la lisis RBC. Detenga el proceso de lisis llenando el tubo con el tampón.
11. Colocar el tubo sobre una centrífuga y girar a 300 x g durante 5 min a 4 oC. Recoger el tubo de la centrífuga y decantar el sobrenadante. Resuspende el pellet añadiendo 10 ml de tampón y filtre la solución en un nuevo tubo de 50 ml a través de un colador de células de 70 m para eliminar los residuos debidos a la lisis RBC.
12. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min a 4oC. Recoger el tubo de la centrífuga y decantar el sobrenadante. Resuspenda el pellet en 500 ml de tampón.
13. Retire una alícuota de 100 l y guárdela en un tubo separado de 1,5 ml. Añadir 50 l de cóctel de anticuerpos de agotamiento del linaje de la biotina desde el kit de enriquecimiento del progenitor(Tabla de Materiales)a los 450 ml restantes de suspensión celular. Incubar a 4oC en una coctelera durante 15 min.
14. Añadir 15 ml de tampón y centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min a 4 oC. Recoger el tubo de la centrífuga y decantar el sobrenadante. Resuspenda el pellet en 460 ml de tampón. Retire una alícuota de 10 l y guárdela en un tubo separado de 1,5 ml.
15. Añadir 50 l de perlas magnéticas de estreptavidina desde el kit de enriquecimiento de progenitores(Tabla de materiales),a la suspensión celular restante de 450 l. Incubar a 4oC en una coctelera durante 15 min.
16. Añadir 15 ml de tampón y centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min a 4 oC. Recoger el tubo de la centrífuga y decantar el sobrenadante. Resuspenda el pellet en 5 ml de tampón y transfiera la solución a un tubo de 15 ml.
17. Lleve el tubo a un separador de celdas automatizado(Tabla de materiales). Ejecute un programa de lavado para enjuagar y preparar el tubo del separador de celdas. Coloque la muestra y dos tubos de recogida en el soporte del tubo. Realice la separación utilizando el programa"Deplete". Recoja las fracciones positivas y negativas del separador de celdas automatizado una vez finalizada la ejecución.
    NOTA: En ausencia de un separador de celda automático los usuarios pueden utilizar columnas magnéticas manuales e imanes correspondientes, según el manual del usuario. Los usuarios deben tener en cuenta que el proceso de separación manual es más lento que el automatizado. Además, las columnas manuales son más propensas a la obstrucción. Por lo tanto, se recomienda a los usuarios diluir la muestra y cargar en la columna lentamente.
18. Deseche la fracción positiva. Llene el tubo de fracción negativa con tampón. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min a 4oC.
19. Mientras tanto, prepare la mezcla de anticuerpos en 1 ml de solución de volumen final y los controles de un solo color en 200 ml de solución de volumen final, tal como se describe en la Tabla de materiales y la Tabla 1.
    NOTA: Si el TMRM y la mancha mitocondrial fluorescente verde deben combinarse con la tinción del marcador de células madre, sustituya el CD150-PE por CD150-PEcy5 y el rojo Streptavidin-Tx con Streptavidin-Pac Orange.
20. Recoger el tubo de muestra de la centrífuga y decantar el sobrenadante. Resuspenda el pellet en 1 ml de mezcla de anticuerpos. Añadir 10 l de celdas (a partir del paso 1.13) en cada uno de los tubos de control de un solo color (excepto el linaje). Añadir 10 l de células (a partir del paso 1.14) en el tubo de un solo color del linaje.
21. Incubar la muestra y los tubos de control de un solo color a 4 oC en una coctelera durante 45 minutos.
22. Llenar todos los tubos con tampón y centrífuga a 300 x g durante 5 min a 4 oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda la muestra en 1 ml de controles de búfer y de un solo color en 200 ml de tampón.
23. Transfiera la muestra y los controles de un solo color a tubos FACS superiores de filtro de 5 ml.
24. Lleve los tubos a la máquina de clasificación y clasifique la población de HSC (estrategia de gating en la Figura 1A)en tubos de 1,5 ml que contengan 400 ml de medio de expansión de células madre.

2. Cultura Ex Vivo de Células Madre Hematopoyéticas

1. Recoger tubos que contengan células ordenadas (ver sección 1 para la extracción de celdas). Centrifugar los tubos a 300 x g durante 5 min a 4oC. Retire suavemente la mayor parte del sobrenadante sin desalojar el pellet y deje 50-80 l encima del pellet celular. Esto minimiza la pérdida de células.
2. Resuspenda el pellet celular en el medio de expansión de células madre a un volumen final dependiendo del número de condiciones a probar (cuenta de 100 ml por pozo/condición de cultivo).
3. Preparar un medio de cultivo 2x que contenga medio de expansión de células madre, factor de células madre (200 ng/ml), ligando FLT3 (4 ng/ml) y antibióticos con estreptococos (1%) (2x medio basal; Tabla de Materiales).
4. Tome un cultivo de tejido estéril tratado 96 U-bottom bien plate(Tabla de Materiales) e identifique los pozos donde se cultivarán las células (diseño de placa en la Figura 1B).
   NOTA: Se recomienda a los usuarios evitar pozos marginales, ya que son más susceptibles a la evaporación.
5. Poner 100 l de 2x medio basal previamente preparado en el paso 2.3 en estos pozos. En el NR marcado bien añadir 2 L de una solución de 100x NR(Tabla de materiales). Reponer NR cada 24 h.
   NOTA: El reabastecimiento es específico de NR. Otros moduladores metabólicos pueden o no necesitar reposición.
6. Semilla de 100 l de células preparadas en el paso 2.2 en la parte superior de los pozos que contienen 2x medio basal. En este experimento, el número de HSC sembrados por pozo estaba entre 800-1.000 células.
7. Preparar cinco pozos adicionales que contengan 2x medio basal. En cada una de ellas se suman 100.000 células enteras de médula ósea (a partir del paso 1.13) resuspendidas en 100 l de medio de expansión de células madre para ser utilizadas como controles de tinción para el análisis de citometría de flujo posterior al cultivo.
   NOTA: Si los usuarios desean combinar marcadores de células madre y marcadores mitocondriales para el análisis posterior al cultivo, se recomienda ordenar adicionalmente la población de progenitores (células Ckit+ o células LKSCD150- ). Semilla estos progenitores ordenados en los pozos de control de tinción para el análisis de citometría de flujo post cultivo. Prepare un pozo por color de mancha única.
8. Poner 200 l de agua autoclave en todos los pozos circundantes para reducir la evaporación de los pozos que contienen células. Dejar la placa intacta en una incubadora a 37oC y 5%_co2 durante el período de cultivo (72 h). Retire la placa para reponer NR cada 24 h y vuelva a colocarla en la incubadora.

3. Medición de la masa mitocondrial y el potencial de la membrana

1. Al final del período de cultivo, prepare una solución de 100x de TMRM (20 m) y verde Mitotracker (10 m) (mancha fluorescente verde) en el medio de expansión de células madre(Tabla de materiales).
2. Añadir 2 l de solución TMRM de 100x y 2 l de solución de manchas fluorescentes verdes de 100x en cada uno de los pozos de ensayo. Añadir 2 l de 100x TMRM en el pozo de control TMRM. Añadir 2 l de 100x mancha fluorescente verde en el pozo de control Mitotracker. Vuelva a colocar la placa de nuevo en una incubadora a 37oC y 5%_CO2 durante 45 min. Cubrir la parte superior de la placa con papel de aluminio.
   NOTA: Se puede preparar un control adicional con Verapamil (inhibidor de la bomba ABC) si es necesario probar el eflujo de tinte mediado por la bomba ABC. Para ello, añadir 50 M de Verapamil en uno de los pozos de prueba 1 h antes de la tinción de TMRM y la mancha fluorescente verde.
3. Retire la placa de la incubadora y centrifugarla a 300 x g durante 5 min. Invierta la placa para retirar el sobrenadante. Añadir 200 l de tampón FACS estándar (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), centrifugar la placa a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante. Repita este paso de lavado 3x. Los usuarios deben asegurarse de que la placa siempre está cubierta con papel de aluminio, para proporcionar una exposición mínima a la luz directa.
   NOTA: Si los usuarios necesitan combinar la tinción mitocondrial con la tinción de células madre, la muestra tendrá que ser incubada con una mezcla de anticuerpos de todos los marcadores de células madre y los controles de un solo color tendrán que ser teñidos con anticuerpos individuales por separado a 4 oC durante 30-45 min.
   NOTA: En todos los pasos los usuarios deben mantener la placa cubierta con papel de aluminio. Los usuarios deben tener en cuenta que este paso de tinción adicional y los pasos de lavado subsiguientes pueden resultar en la pérdida de celda adicional.
4. Resuspenda las células en 200 ml de tampón FACS y transfiera a tubos FACS.
5. Ejecute las muestras en el cytómetro de flujo (consulte la figura 1). Los tubos de un solo color que contienen WBM incluyen: (1) Sin mancha; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); 4) mancha fluorescente verde (FITC); (5) Mancha completa (PE y FITC).
6. En primer lugar, adquiera los controles de un solo color para configurar la máquina. Utilice el software en ejecución en el equipo para calcular la compensación. Una vez aplicada la compensación, adquiera la muestra de HSC y registre tantos eventos como sea posible.
   NOTA: Si se combinan las células madre y los marcadores mitocondriales, los usuarios deben tener especial cuidado con la compensación entre TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) y Sca-1 (APC). Además, las muestras deben ejecutarse inmediatamente después de la tinción.
7. Exportar los archivos FACS desde el citometro y analizar los datos en un software de análisis (Tabla de materiales).
   1. Para el análisis, abra el archivo en el software de análisis. El uso de FSC-A y SSC-A identifica la población celular. Identifique los singlets en las puertas siguientes antes de trazar la fracción negativa DAPI (células vivas). En la puerta de la celda viva, haga una gráfica de contorno en el canal de tinción fluorescente verde y TMRM para medir el número de masa y la masa, respectivamente(Figura 2A). Exporte la intensidad media de fluorescencia (IMF) de estos dos canales en la puerta de la célula viva.
   2. La compuerta baja TMRM se establece en función de la población del hombro en el canal TMRM. El control de un solo color TMRM se puede utilizar para identificar esta población de hombros para fijar la puerta. Exporte la proporción de celdas activas en la puerta baja TMRM en su control y pruebe muestras para el trazado.

Resultados

En la Figura 1 mostramos la estrategia de gating para el aislamiento de células madre hematopoyéticas de la médula ósea del ratón y el diseño de la placa para su cultivo ex vivo. La Figura 1A muestra la identificación de la fracción de linfocito en la gráfica SSC-A/FSC-A. Los dobletes fueron eliminados en la puerta singlete seguido de la identificación de células vivas por la ausencia de señal DAPI. Se identificó la población de LK...

Discusión

Una regulación estricta de la función HSC es importante para mantener una hematopoyesis estable durante la vida útil de un organismo. Al igual que varios otros tipos de células en el cuerpo, un componente clave que contribuye a la regulación de la función HSC es el metabolismo celular. Estudios previos de nuestro laboratorio⁹ y otros^2,3 han implicado la importancia de las mitocondrias en el mantenimiento de un estado metabólico dist...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL FACS tubes	Falcon	352235	Sample preparation
96-U bottom plate	Corning	3799	Cell culture
AutoMACS pro separator	Miltenyi Biotec		Automatic Cell separation
BD FACS AriaIII	Becton and Dickinson		Cell sorting
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit	BD	558451	Lineage depletion
BD LSRII	Becton and Dickinson		FACS acquisition machine
BD-DIVA	Becton and Dickinson		Acquisition software
CD150 PE	Biolegend	115904	Antibody staining mix
CD150 PE-Cy5	Biolegend	115912	Antibody staining mix
CD48 PB	Biolegend	103418	Antibody staining mix
Centrifuge- 5810R	Eppendorf		Centrifugation
Ckit PeCy7	Biolegend	105814	Antibody staining mix
Flow jo	FlowJo LLC		FACS Analysis software
GraphPad-Prism	GraphPad		Plotting data into graphs
Mitotracker Green	Invitrogen	M7514	Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM
Nicotinamide Riboside (NR)	Custom synthesized in house		Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM
PBS	CHUV	1000324	Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
Pen-Strep (P/S)	Life technologies	15140122	Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
RBC Lysis buffer	Biolegend	420301	Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)	RnD	427-FL-005/CF	Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL
Recombinant mouse stem cell factor (SCF)	RnD	455-MC-010/CF	Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL
Sca1 APC	Thermo Fisher Scientific	17-5981-82	Antibody staining mix
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium	SIGMA	S0192	Ex vivo culture
Streptavidin Pac orange	Life Technologies	S32365	Antibody staining mix
Streptavidin Tx red	Life Technologies	S872	Antibody staining mix
TMRM	Invitrogen	T668	Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM
Ultra pure EDTA	Invitrogen	15575-038	Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM