Misurazione della massa mitocondriale e del potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche e t-cellule da parte della citometria di flusso

Riepilogo

Qui descriviamo un metodo affidabile per misurare la massa mitocondriale e il potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche coltivate nell'ex vivo e nelle cellule T.

Abstract

Un raffinato equilibrio di quiescenza, auto-rinnovamento e differenziazione è fondamentale per preservare il pool di cellule staminali ematopoietiche (HSC) e mantenere la produzione permanente di tutte le cellule del sangue mature. Negli ultimi anni il metabolismo cellulare è emerso come un regolatore cruciale della funzione ESC e del destino. Abbiamo dimostrato in precedenza che la modulazione del metabolismo mitocondriale influenza il destino HSC. In particolare, sganciando chimicamente la catena di trasporto degli elettroni siamo stati in grado di mantenere la funzione HSC in condizioni di coltura che normalmente inducono una rapida differenziazione. Tuttavia, limitare i numeri HSC spesso preclude l'uso di saggi standard per misurare il metabolismo hSC e quindi prevedere la loro funzione. Qui, segnaliamo un semplice saggio di citometria di flusso che consente la misurazione affidabile del potenziale della membrana mitocondriale e della massa mitocondriale in cellule scarse come gli HSC. Discutiamo l'isolamento degli HSC dal midollo osseo del topo e la misurazione della massa mitocondriale e della membrana potenziale cultura post ex vivo. Ad esempio, mostriamo la modulazione di questi parametri in HSC tramite il trattamento con un modulatore metabolico. Inoltre, estendiamo l'applicazione di questa metodologia sulle cellule T derivate dal sangue periferico umano e sui linfociti infiltranti del tumore umano (TIL), mostrando differenze drammatiche nei loro profili mitocondriali, probabilmente riflettendo diverse cellule T Funzionalità. Crediamo che questo saggio possa essere impiegato negli screening per identificare i modulatori del metabolismo mitocondriale in vari tipi di cellule in contesti diversi.

Introduzione

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono una piccola popolazione di cellule che risiedono nel midollo osseo che assicurano la produzione di sangue e l'omeostasi per tutta la vita di un organismo. Gli HSC mediano questo processo dando origine a progenitori che a loro volta producono lignaggi di cellule del sangue mature differenziate terminalmente tramite diversi cicli di divisione cellulare e passaggi di differenziazione ben orchestrati¹. È importante sottolineare che gli HSC producono la loro energia attraverso la glicolisi anaerobica. Al contrario, i progenitori ematopoietici più impegnati e attivi cambiano il loro metabolismo verso il metabolismo mitocondriale^2,3,4. Si ritiene che questo stato metabolico distinto protegga gli HSC dai danni cellulari inflitti dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS) prodotte dai mitocondri attivi, mantenendo così la loro funzione in vivo a lungo termine^5,6,7^,8. La misurazione diretta dello stato metabolico HSC è impegnativa e spesso bassa produttività a causa del loro numero limitato. In questo caso, descriviamo un saggio basato sulla citometria di flusso per una misurazione robusta del potenziale della membrana mitocondriale (m) usando la fluorescenza di tetrametilrhodamie (TMRM) e la massa mitocondriale usando una macchia mitocondriale verde (Mitotracker Green) negli HSC. In precedenza abbiamo dimostrato che il basso zofm è un marcatore funzionale in buona fede di HSC⁹ altamente purificati e modulatori metabolici in grado di abbassare la^funzioneHSC, 9^,10. Qui proponiamo l'uso del nostro metodo sulla profilazione mitocondriale degli HSC come strategia per identificare nuove molecole in grado di migliorare il potenziale di ricostituzione del sangue a lungo termine degli HSC.

Ad esempio, dimostriamo che questo test misura in modo affidabile l'abbassamento dell'HSC , che si snoda dopo l'esposizione al riboside alla nicotina analogico di vitamina B3 (NR). Di conseguenza, nel nostro studio recentemente pubblicato dimostriamo che NR migliora fortemente il recupero del sangue posttrapianto in entrambi i sistemi murini e minorati migliorando direttamente le funzioni di stelo e progenitore ematopoietico¹⁰. La capacità di tali modulatori metabolici è di grande valore clinico considerando che un tasso di mortalità del 25% è legato al ritardo nel sangue e al recupero immunitario nei pazienti post-trapiantati^11,12.

Inoltre, forniamo la prova che questa metodologia può essere applicata per la caratterizzazione del profilo metabolico e della funzione delle cellule T umane. Negli ultimi anni, lo sviluppo della terapia cellulare adottiva (ACT) utilizzando l'infiltrazione autologica del tumore dei linfociti (TIL) è diventato l'approccio più efficace per alcuni tipi di cancro avanzato con prognosi estremamente sfavorevole (ad esempio, melanoma metastatico, dove >50% dei pazienti risponde al trattamento e fino al 24% dei pazienti ha una regressione completa)¹³. Tuttavia, i TIL che ospitano un'attività antitumorale sufficiente sono difficili da generare¹⁴. L'estesa proliferazione e stimolazione che i TIL subiscono durante l'espansione ex vivo causano l'esaurimento e la senescenza delle cellule T che compromettono drammaticamente la risposta antitumorale delle cellule T¹⁵. È importante sottolineare che la capacità antitumorale dei TIL è strettamente legata al loro metabolismo^16,17 e approcci volti a modulare il metabolismo attraverso l'inibizione del percorso PI3K/Akt hanno prodotto risultati incoraggianti^18,19 . Per questo motivo, confrontiamo le cellule T derivate dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) e i TIL derivati dal paziente, e mostriamo che le cellule T derivate da PBMC meno differenziate hanno una massa t-m e mitocondriale inferiore rispetto ai TIL differenziati terminalmente.

Ipotichiamo che questo assaggio possa essere utilizzato per identificare nuovi modulatori metabolici che migliorano la funzione delle cellule HSC e T attraverso la modulazione di zm.

Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti nel manoscritto seguono le linee guida della nostra istituzione e sono stati effettuati in conformità con la legge svizzera per la sperimentazione animale (Autorizzazione: VD3194) e per la ricerca su campioni umani (Protocollo: 235/14; CER-VD 2017-00490)

1. Estrazione di cellule staminali ematopoietiche

1. Acquistare topi di tipo selvatico C57BL6/J e tenerli nella casa degli animali per almeno una settimana per ridurre lo stress associato al trasporto.
2. Il giorno dell'esperimento, eutanasia il topo usando l'asfissia di CO_2.
3. Spruzzare il mouse con il 70% di etanolo per sterilizzare la pelliccia e tagliare aprire il topo al ventre utilizzando strumenti chirurgici standard, come forbici dissezione e pinze, per tagliare il femore e le ossa di tibia dalle zampe posteriori.
4. Rimuovere i muscoli attaccati al femore, alla tibia e al bacino utilizzando un tovagliolo di carta morbido e posizionare le ossa pulite in un tubo da 50 mL contenente PBS con 1 mM EDTA (buffer) sul ghiaccio.
5. Spruzzare un mortaio e pestello con il 70% di etanolo e metterlo in una cappa di coltura cellulare. Sterilizzare con UV per 30 min. Post sterilizzazione risciacquare il mortaio e pestello con tampone per rimuovere le tracce di etanolo.
6. Mettere le ossa pulite con un cuscinetto (10 mL) nel mortaio e schiacciarle delicatamente per ottenere il midollo osseo in sospensione. Ora, raccogliere la sospensione cellulare e passarlo attraverso un colino cellulare di 70 m in un tubo da 50 mL per ottenere una singola sospensione cellulare.
7. Ripetere il passaggio 1.6 fino a quando tutto il midollo osseo è stato estratto e i detriti ossei sono diventati bianchi.
8. Posizionare i tubi da 50 mL contenenti la sospensione a cella singola del midollo osseo su una centrifuga. Eseguire la centrifuga a 300 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per pelletare le cellule.
9. Nel frattempo, preparare 10 mL di 1x tampone di lisi RBC in acqua distillata autoclavificata. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 m.
10. Raccogliere il tubo campione dalla centrifuga e decantare il supernatante. Pipette il buffer di lisi 1x RBC (Tabella dei materiali) sul pellet cellulare. Slogare il pellet e preparare una soluzione omogenea pipeting su e giù un paio di volte. Lasciare che il tubo sia a temperatura ambiente per 1–2 min affinché si verifichi la lisi RBC. Arrestare il processo di lisi riempiendo il tubo con il buffer.
11. Posizionare il tubo su una centrifuga e ruotare a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere il tubo dalla centrifuga e decantare il supernatante. Risospendere il pellet aggiungendo 10 mL di tampone e filtrare la soluzione in un nuovo tubo da 50 mL tramite un colino cellulare da 70 m per rimuovere i detriti dovuti alla lisi RBC.
12. Centrifugare il tubo a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere il tubo dalla centrifuga e decantare il supernatante. Risospendere il pellet in 500 - L di buffer.
13. Rimuovere 100 aliquote e conservare in un tubo separato da 1,5 mL. Aggiungere 50 l di biotina di deplezione anticorpale dal kit di arricchimento del progenitore (Tabella dei materiali) ai restanti 450 -L di sospensione cellulare. Incubare a 4 gradi centigradi su uno shaker per 15 min.
14. Aggiungere 15 mL di tampone e centrifugare il tubo a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere il tubo dalla centrifuga e decantare il supernatante. Risospendere il pellet in 460 l l di buffer. Rimuovere un'aliquota di 10 le e conservarla in un tubo separato da 1,5 mL.
15. Aggiungete 50 l di perline magnetiche streptavidindale dal kit di arricchimento del progenitore (Table of Materials), alle restanti 450 sospensioni cellulari l. Incubare a 4 gradi centigradi su uno shaker per 15 min.
16. Aggiungere 15 mL di tampone e centrifugare il tubo a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere il tubo dalla centrifuga e decantare il supernatante. Risospendere il pellet in 5 mL di tampone e trasferire la soluzione in un tubo da 15 mL.
17. Portare il tubo in un separatore di celle automatico (Tabella dei materiali). Eseguire un programma di lavaggio per risciacquare e prime il tubo del separatore di cella. Posizionare il campione e due tubi di raccolta sul supporto del tubo. Eseguire la separazione utilizzando il programma "Deplete". Raccogliere le frazioni positive e negative dal separatore di cella automatizzato una volta terminata la corsa.
    NOT: In assenza di un separatore di celle automatico gli utenti possono utilizzare colonne magnetiche manuali e magneti corrispondenti, per il manuale dell'utente. Gli utenti dovrebbero tenere a mente che il processo di separazione manuale è più lento di quello automatizzato. Inoltre, le colonne manuali sono più inclini a intasamento. Pertanto, si consiglia agli utenti di diluire il campione e caricare lentamente sulla colonna.
18. Scartare la frazione positiva. Riempire il tubo frazione negativa con tampone. Centrifugare il tubo a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
19. Nel frattempo, preparare la miscela di anticorpi in 1 mL di soluzione di volume finale e i controlli monocolore in 200 -L della soluzione di volume finale, come descritto nella Tabella dei materiali e tabella 1.
    NOT: Se il TMRM e la macchia mitocondriale fluorescente verde devono essere combinati con la colorazione del marcatore di cellule staminali, sostituire CD150-PE con CD150-PEcy5 e Streptavidin-Tx rosso con Streptavidin-Pac Orange.
20. Raccogliere il tubo campione dalla centrifuga e decantare il supernatante. Risospendere il pellet in 1 mL di miscela di anticorpi. Aggiungere 10 celle (dal punto 1,13) in ciascuno dei tubi di controllo monocolore (tranne il lignaggio). Aggiungere 10 celle (dal punto 1,14) nel tubo di colore singolo di lignaggio.
21. Incubare il campione e i tubi di controllo monocolore a 4 gradi centigradi su uno shaker per 45 min. coprire il secchio di ghiaccio con un coperchio o un foglio di alluminio.
22. Riempire tutti i tubi con tampone e centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Eliminare il supernatante e sospendere nuovamente il campione in 1 mL di buffer e controlli a colore singolo in 200 l di buffer.
23. Trasferire il campione e i controlli a colore singolo in tubi FACS del filtro da 5 mL.
24. Portare i tubi alla selezionatrice e ordinare la popolazione HSC (strategia di raccolta in Figura 1A)in tubi da 1,5 mL contenenti 400 l di mezzo di espansione delle cellule staminali.

2. Ex Vivo Cultura delle Cellule Staminali Ematopoietiche

1. Raccogliere i tubi contenenti celle ordinate (vedere la sezione 1 per l'estrazione delle celle). Centrifugare i tubi a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere delicatamente la maggior parte del supernatante senza spostare il pellet e lasciare 50-80 -L in cima al pellet cellulare. Questo riduce al minimo la perdita di cellule.
2. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di espansione delle cellule staminali a un volume finale a seconda del numero di condizioni da testare (contare per 100 l per pozzo/condizione di coltura).
3. Preparare un mezzo di coltura 2x contenente il mezzo di espansione delle cellule staminali, il fattore delle cellule staminali (200 ng/mL), il ligando FLT3 (4 ng/mL) e gli antibiotici pen-strep (1%) (2x mezzo basale; Tabella dei materiali).
4. Prendere una coltura di tessuto sterile trattata 96 piastra U-fondo (Tabella dei materiali) e identificare i pozzi in cui le cellule saranno coltivate (disegno piatto in Figura 1B).
   NOT: Gli utenti sono invitati a evitare pozzi marginali, in quanto sono più suscettibili all'evaporazione.
5. In questi pozzetti mettere 100 l di mezzo basale 2x precedentemente preparato al punto 2.3. Nella NR marcato bene aggiungere 2 L di una soluzione 100x NR (Tabella dei materiali). Rifornire NR ogni 24 ore.
   NOT: Il rifornimento è specifico per NR. Altri modulatori metabolici possono o non possono avere bisogno di rifornimento.
6. Seme 100 L di cellule preparate al punto 2.2 in cima ai pozzi contenenti 2x mezzo basale. In questo esperimento il numero di HSC di semi per pozzo era tra 800-1.000 cellule.
7. Preparare cinque pozzi aggiuntivi contenenti 2x medie basali. In ognuna di queste aggiungi 100.000 cellule intero del midollo osseo (dal punto 1.13) risospese in 100 , l di mezzo di espansione delle cellule staminali da utilizzare come controlli di colorazione per l'analisi della citometria del flusso post-coltura.
   NOT: Se gli utenti vogliono combinare marcatori di cellule staminali e marcatori mitocondriali per l'analisi post-coltura si consiglia di ordinare ulteriormente la popolazione progenitrice (cellule Ckit o cellule LKSCD150-). Seme questi progenitori ordinati nei pozzi di controllo della colorazione per l'analisi della citometria del flusso post-cultura. Preparare un pozzo per ogni colore macchia singola.
8. Mettete 200 l di acqua autoclave in tutti i pozzi circostanti per ridurre l'evaporazione da pozzi contenenti cellule. Lasciare la piastra indisturbata in un'incubatrice a 37 e al 5% di CO₂ per la durata del periodo di coltura (72 h). Togliere la piastra per rifornire NR ogni 24 h e rimetterla nell'incubatrice.

3. Misurazione della Massa Mitocondriale e del Potenziale membrana

1. Alla fine del periodo di coltura preparate una soluzione 100x di TMRM (20 m) e Mitotracker verde (10 M) (macchia fluorescente verde) in mezzo di espansione delle cellule staminali (Tabella dei materiali).
2. Aggiungete 2 gradi l di 100x soluzione TMRM e 2 gradi di macchia fluorescente verde da 100 volte in ciascuno dei pozzetti di prova. Aggiungere bene 2 -L di 100x TMRM nel controllo TMRM. Aggiungete bene 2 ll di 100 x di macchie fluorescenti verdi nel controllo Mitotracker. Rimettere la piastra di nuovo in un'incubatrice a 37 gradi centigradi e al 5% di CO₂ per 45 min.
   NOT: Un ulteriore controllo con Verapamil (inibitore della pompa ABC) può essere preparato se la pompa ABC mediato efflux deve essere testato. Per questo, aggiungere 50 M verapamil in uno dei pozzetti di prova 1 h prima di colorare per TMRM e macchia fluorescente verde.
3. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e centrificarla a 300 x g per 5 min. Invertire la piastra per rimuovere il supernatante. Aggiungere 200 l di buffer FACS standard (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), centrifugare la piastra a 300 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante. Ripetere questo passaggio di lavaggio 3x. Gli utenti devono assicurarsi che la piastra sia sempre ricoperta di lamina, per fornire un'esposizione minima alla luce diretta.
   NOT: Se gli utenti devono combinare la colorazione mitocondriale con la colorazione delle cellule staminali, il campione dovrà essere incubato con una combinazione di anticorpi di tutti i marcatori di cellule staminali e i controlli monocolore dovranno essere macchiati con anticorpi individuali separatamente a 4 gradi centigradi per 30-45 min.
   NOT: A tutti i passi gli utenti devono tenere la piastra coperta con lamina di alluminio. Gli utenti devono notare che questa fase di colorazione supplementare e successive fasi di lavaggio può provocare ulteriori perdite di cellule.
4. Risospendere le cellule in 200 - L di TAC tampone e trasferire ai tubi FACS.
5. Eseguire gli esempi sul citometro di flusso (vedere figura 1). I tubi monocolore contenenti WBM includono: (1) Unstained; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) macchia fluorescente verde (FITC); (5) Macchia completa (PE e FITC).
6. Acquisire innanzitutto i controlli monocolore per configurare la macchina. Utilizzare il software in esecuzione sulla macchina per calcolare la compensazione. Una volta applicata la compensazione, acquisire il campione HSC e registrare il maggior numero possibile di eventi.
   NOT: Se si combinano le cellule staminali e i marcatori mitocondriali, gli utenti devono prestare particolare attenzione alla compensazione tra TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) e Sca-1 (APC). Inoltre, i campioni devono essere eseguiti immediatamente dopo la colorazione.
7. Esportare i file FACS dal citometro e analizzare i dati su un software di analisi (Tabella dei materiali).
   1. Per l'analisi, aprire il file sul software di analisi. L'utilizzo di FSC-A e SSC-A per identificare la popolazione cellulare. Identificare i singlet nei gate successivi prima di tracciare la frazione negativa DAPI (cellule vive). Nel cancello della cella animata fare un grafico di contorno nel TMRM e canale di macchia fluorescente verde per misurare , rispettivamente , m e massa (Figura 2A). Esportare l'intensità media di fluorescenza (FI) di questi due canali nel cancello della cella animata.
   2. Il cancello basso TMRM è impostato in base alla popolazione di spalla nel canale TMRM. Il controllo a colore singolo TMRM può essere utilizzato per identificare questa popolazione di spalla per impostare il cancello. Esportare la percentuale di live di celle nel cancello basso TMRM nel controllo e campioni di test per la stampa.

Risultati

Nella Figura 1 mostriamo la strategia di gating per l'isolamento delle cellule staminali ematopoietiche dal midollo osseo del topo e il layout della piastra per la loro cultura ex vivo. La figura 1A mostra l'identificazione della frazione dei linfociti nel grafico SSC-A/FSC-A. I doppietti sono stati rimossi nel cancello singolo seguito dall'identificazione delle cellule vive dall'assenza di segnale DAPI. È stata identificata la popolazione LKS,...

Discussione

Una stretta regolazione della funzione HSC è importante per mantenere l'ematopoiesi stabile durante la vita di un organismo. Come vari altri tipi di cellule nel corpo, un componente chiave che contribuisce alla regolazione della funzione HSC è il metabolismo cellulare. Studi precedenti dal nostro laboratorio⁹ e altri^2,3 hanno implicato l'importanza dei mitocondri nel mantenere uno stato metabolico distinto negli HSC. A causa del numero e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL FACS tubes	Falcon	352235	Sample preparation
96-U bottom plate	Corning	3799	Cell culture
AutoMACS pro separator	Miltenyi Biotec		Automatic Cell separation
BD FACS AriaIII	Becton and Dickinson		Cell sorting
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit	BD	558451	Lineage depletion
BD LSRII	Becton and Dickinson		FACS acquisition machine
BD-DIVA	Becton and Dickinson		Acquisition software
CD150 PE	Biolegend	115904	Antibody staining mix
CD150 PE-Cy5	Biolegend	115912	Antibody staining mix
CD48 PB	Biolegend	103418	Antibody staining mix
Centrifuge- 5810R	Eppendorf		Centrifugation
Ckit PeCy7	Biolegend	105814	Antibody staining mix
Flow jo	FlowJo LLC		FACS Analysis software
GraphPad-Prism	GraphPad		Plotting data into graphs
Mitotracker Green	Invitrogen	M7514	Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM
Nicotinamide Riboside (NR)	Custom synthesized in house		Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM
PBS	CHUV	1000324	Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
Pen-Strep (P/S)	Life technologies	15140122	Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
RBC Lysis buffer	Biolegend	420301	Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)	RnD	427-FL-005/CF	Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL
Recombinant mouse stem cell factor (SCF)	RnD	455-MC-010/CF	Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL
Sca1 APC	Thermo Fisher Scientific	17-5981-82	Antibody staining mix
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium	SIGMA	S0192	Ex vivo culture
Streptavidin Pac orange	Life Technologies	S32365	Antibody staining mix
Streptavidin Tx red	Life Technologies	S872	Antibody staining mix
TMRM	Invitrogen	T668	Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM
Ultra pure EDTA	Invitrogen	15575-038	Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM