Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux

Résumé

Ici nous décrivons une méthode fiable pour mesurer la masse mitochondriale et le potentiel de membrane dans les cellules souches hématopoïétiques et les cellules T cultivées ex vivo.

Résumé

Un bel équilibre de quiescence, d'auto-renouvellement et de différenciation est essentiel pour préserver le bassin de cellules souches hématopoïétiques (HSC) et maintenir la production à vie de toutes les cellules sanguines matures. Ces dernières années, le métabolisme cellulaire a émergé comme un régulateur crucial de la fonction HSC et le destin. Nous avons précédemment démontré que la modulation du métabolisme mitochondrial influence le destin de HSC. Plus précisément, en découplant chimiquement la chaîne de transport d'électrons, nous avons pu maintenir la fonction HSC dans des conditions de culture qui induisent normalement une différenciation rapide. Cependant, la limitation des nombres de HSC empêche souvent l'utilisation des essais standard pour mesurer le métabolisme de HSC et donc prévoir leur fonction. Ici, nous rapportons un essai simple de cytométrie de flux qui permet la mesure fiable du potentiel de membrane mitochondrique et de la masse mitochondrique dans les cellules rares telles que HSCs. Nous discutons l'isolement des HSCde de la moelle osseuse de souris et la mesure de la masse mitochondriale et de la culture post ex vivo potentielle de membrane. Par exemple, nous montrons la modulation de ces paramètres dans les HSC par le traitement avec un modulateur métabolique. En outre, nous étendons l'application de cette méthodologie sur les lymphocytes T périphériques humains dérivés du sang et les lymphocytes infiltrants de tumeur humaine (TILs), montrant des différences dramatiques dans leurs profils mitochondriaux, reflétant probablement différentes cellules T Fonctionnalité. Nous croyons que cet analyse peut être employé dans les criblages pour identifier des modulateurs du métabolisme mitochondrique dans différents types de cellules dans différents contextes.

Introduction

Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) sont une petite population de cellules résidant dans la moelle osseuse assurant la production sanguine et l'homéostasie tout au long de la vie d'un organisme. Les HSC font la médiation de ce processus en donnant naissance à des progéniteurs qui, à leur tour, produisent des lignées de cellules sanguines matures différenciées en phase terminale par plusieurs cycles de division cellulaire et des étapes de différenciation bien orchestrées¹. Fait important, les HSC produisent leur énergie par glycolyse anaérobie. En revanche, les progéniteurs hématopoïétiques plus engagés et actifs commutent leur métabolisme vers le métabolisme mitochondrial^2,3,4. Cet état métabolique distinct est censé protéger les HSC contre les dommages cellulaires infligés par les espèces réactives d'oxygène (ROS) produites par les mitochondries actives, maintenant ainsi leur fonction in vivo à long terme^5,6,7,8. La mesure directe de l'état métabolique de HSC est provocante et souvent faible débit en raison de leur nombre limité. Ici, nous décrivons un essai basé sur la cytométrie d'écoulement pour la mesure robuste du potentiel de membrane mitochondriale (M) utilisant la fluorescence de méthyle de méthylàure de térameramethylrhodamine (TMRM), et la masse mitochondrique utilisant une tache mitochondriale fluorescente verte (Mitotracker Vert) dans HSCs. Nous avons déjà démontré que le bas -m est un marqueur fonctionnel de bonne foi des HSC fortement purifiés⁹ et des modulateurs métaboliques capables d'abaisser la fonction d'amélioration de HSCs^9,10. Ici nous proposons l'utilisation de notre méthode sur le profilage mitochondrial de HSCs comme stratégie pour identifier de nouvelles molécules capables d'améliorer le potentiel à long terme de reconstitution de sang des HSC.

À titre d'exemple, nous démontrons que cet analyse mesure de façon fiable l'abaissement de HSC'm lors de l'exposition à la vitamine B3 analog nicotinamide riboside (NR). En conséquence, dans notre étude récemment éditée nous démontrons que NR améliore fortement la posttransplantation de récupération de sang dans les systèmes de souris et humanisés de souris en améliorant directement les fonctions hématopoïétiques de tige et d'ancêtre^10. La capacité de ces modulateurs métaboliques est d'une grande valeur clinique considérant qu'un taux de mortalité de 25% est lié au retard dans le sang et à la récupération immunisée dans les patients posttransplantés^11,12.

En outre, nous fournissons la preuve que cette méthodologie peut être appliquée pour la caractérisation du profil métabolique et de la fonction des lymphocytes T humains. Ces dernières années, le développement de la thérapie cellulaire adoptive (ACT) utilisant des lymphocytes infiltrants de tumeur autologue (TILs) est devenu l'approche la plus efficace pour certains types de cancer avancé avec le pronostic extrêmement défavorable (par exemple, mélanome métastatique, où 'gt;50% de patients répondent au traitement et jusqu'à 24% de patients ont la régression complète)¹³. Cependant, les TILs hébergeant une activité antitumorale suffisante sont difficiles à générer¹⁴. La prolifération et la stimulation étendues que les TILs subissent pendant l'expansion ex vivo causent l'épuisement et la sénescence de cellules T qui altèrent considérablement la réponse antitumorale de cellule T^15. Fait important, la capacité antitumorale des TIL est étroitement liée à leur métabolisme^16,17 et les approches visant à moduler le métabolisme par l'inhibition de la voie PI3K/Akt ont produit des résultats encourageants^18,19. Pour cette raison, nous comparons les cellules T dérivées de cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) et de TIL dérivées du patient, et montrons que les lymphocytes T moins différenciés dérivés de PBMC ont une masse inférieure et mitochondriale par rapport aux TIL différenciés en phase terminale.

Nous envisageons que cet analyse peut être utilisé pour identifier de nouveaux modulateurs métaboliques qui améliorent la fonction HSC et les lymphocytes T par la modulation de l'amon.

Protocole

Toutes les expériences décrites dans le manuscrit suivent les directives de notre institution et ont été réalisées conformément au droit suisse pour l'expérimentation animale (Autorisation: VD3194) et pour la recherche portant sur des échantillons humains (Protocole: 235/14; CER-VD 2017-00490)

1. Extraction hématopoïétique des cellules souches

1. Achetez des souris sauvages de type C57BL6/J et gardez-les dans la maison des animaux pendant au moins une semaine pour réduire le stress associé au transport.
2. Le jour de l'expérience, euthanasiez la souris à l'aide de l'asphyxie au CO_2.
3. Vaporiser la souris avec 70% d'éthanol pour stériliser la fourrure et ouvrir la souris au ventre en utilisant des outils chirurgicaux standard, tels que les ciseaux de dissection et les forceps, pour couper le fémur et les os du tibia des pattes postérieures.
4. Retirez les muscles attachés au fémur, au tibia et au bassin à l'aide d'une serviette en papier souple et placez les os nettoyés dans un tube de 50 ml contenant du PBS avec 1 mM EDTA (tampon) sur la glace.
5. Vaporiser un mortier et un pilon avec 70 % d'éthanol et le placer dans une hotte de culture cellulaire. Stérilisez-le avec des UV pendant 30 min. Après la stérilisation, rincez le mortier et pilons avec tampon pour éliminer les traces d'éthanol.
6. Mettre les os propres avec un tampon (10 ml) dans le mortier et les écraser délicatement pour sortir la moelle osseuse en suspension. Maintenant, collectez la suspension cellulaire et passez-la à travers une passoire à cellules de 70 m dans un tube de 50 ml pour obtenir une suspension à cellule unique.
7. Répétez l'étape 1.6 jusqu'à ce que toute la moelle osseuse ait été extraite et que les débris osseux soient devenus blancs.
8. Placez le tube (s) de 50 ml contenant la suspension à cellule unique de moelle osseuse sur une centrifugeuse. Faire fonctionner la centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 oC pour granuler les cellules.
9. Pendant ce temps, préparer 10 ml de tampon de lyse RBC 1x dans de l'eau distillée autoclaved. Filtrer la solution à l'intermédiaire d'un filtre de 0,22 m.
10. Recueillir le tube de l'échantillon de la centrifugeuse et décant le supernatant. Pipette le tampon de lyse 1x RBC (Table des Matériaux) sur la pastille cellulaire. Déloger la pastille et préparer une solution homogène en faisant monter et descendre à quelques reprises. Laisser le tube être à température ambiante pendant 1 h 2 pour que la lyse RBC se produise. Arrêtez le processus de lyse en remplissant le tube avec le tampon.
11. Placer le tube sur une centrifugeuse et faire tourner à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Recueillir le tube de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre le granule en ajoutant 10 ml de tampon et filtrer la solution dans un nouveau tube de 50 ml via une passoire à cellules de 70 m pour enlever les débris en raison de la lyse RBC.
12. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Recueillir le tube de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre la pastille dans 500 l'un de tampon.
13. Retirer un aliquot de 100 l et conserver dans un tube séparé de 1,5 ml. Ajoutez 50 L de cocktail d'anticorps d'épuisement de la lignée de biotine du kit d'enrichissement de l'ancêtre (Table of Materials) aux 450 l'autre de suspension cellulaire. Incuber à 4 oC sur un shaker pendant 15 min.
14. Ajouter 15 ml de tampon et centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Recueillir le tube de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre la pastille dans 460 l'un de tampon. Retirer un aliquot de 10 l et conserver dans un tube séparé de 1,5 ml.
15. Ajouter 50 l de perles magnétiques streptavidin es du kit d'enrichissement de l'ancêtre (Table of Materials), à la suspension cellulaire restante de 450 l. Incuber à 4 oC sur un shaker pendant 15 min.
16. Ajouter 15 ml de tampon et centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Recueillir le tube de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre la pastille dans 5 ml de tampon et transférer la solution dans un tube de 15 ml.
17. Prendre le tube à un séparateur cellulaire automatisé (Table des matériaux). Exécuter un programme de lavage pour rincer et amorcer le tube du séparateur cellulaire. Placez l'échantillon et deux tubes de collecte sur le support du tube. Effectuer la séparation à l'aide du programme «Deplete». Recueillir les fractions positives et négatives du séparateur cellulaire automatisé une fois la course terminée.
    REMARQUE: En l'absence d'un séparateur cellulaire automatique, les utilisateurs peuvent utiliser des colonnes magnétiques manuelles et des aimants correspondants, selon le manuel de l'utilisateur. Les utilisateurs doivent garder à l'esprit que le processus de séparation manuelle est plus lent que celui automatisé. En outre, les colonnes manuelles sont plus sujettes à l'engorgement. Par conséquent, il est conseillé aux utilisateurs de diluer l'échantillon et de charger lentement sur la colonne.
18. Jeter la fraction positive. Remplissez le tube de fraction négative avec un tampon. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 oC.
19. Pendant ce temps, préparer le mélange d'anticorps dans 1 ml de solution de volume final et les commandes d'une seule couleur dans 200 L de solution de volume final comme décrit dans tableau des matériaux et tableau 1.
    REMARQUE: Si le TMRM et la tache mitochondriale fluorescente verte doivent être combinés avec la coloration de marqueur de cellules souches, puis remplacez CD150-PE avec CD150-PEcy5 et Streptavidin-Tx rouge avec Streptavidin-Pac Orange.
20. Recueillir le tube de l'échantillon de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre la pastille dans 1 ml de mélange d'anticorps. Ajouter 10 l de cellules (à partir de l'étape 1.13) dans chacun des tubes de contrôle d'une seule couleur (à l'exception de la lignée). Ajouter 10 l de cellules (à partir de l'étape 1.14) dans le tube de couleur unique de la lignée.
21. Incuber l'échantillon et les tubes de commande d'une seule couleur à 4 oC sur un shaker pendant 45 min. Couvrir le seau à glace d'un couvercle ou d'une feuille d'aluminium.
22. Remplir tous les tubes de tampon et de centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant et suspendez l'échantillon dans 1 ml de tampon et de commandes d'une seule couleur dans 200 l'un de tampon.
23. Transférer l'échantillon et les commandes unicolores sur des tubes FACS de 5 ml.
24. Acqu'on trouve les tubes jusqu'à la machine de tri et triez la population de HSC (stratégie de gating dans la figure 1A)dans des tubes de 1,5 ml contenant 400 l de milieu d'expansion des cellules souches.

2. Ex Vivo Culture of Hematopoietic Stem Cells

1. Recueillir des tubes contenant des cellules triées (voir la section 1 pour l'extraction cellulaire). Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirez délicatement la majeure partie du supernatant sans déloger la pastille et laissez 50 à 80 l sur le dessus de la pastille cellulaire. Cela minimise la perte cellulaire.
2. Resuspendre le granule cellulaire dans le milieu d'expansion des cellules souches à un volume final dépendant du nombre de conditions à tester (compte zettant pour 100 L par puits/condition de culture).
3. Préparer un milieu de culture 2x contenant un milieu d'expansion des cellules souches, un facteur de cellules souches (200 ng/mL), un ligand FLT3 (4 ng/mL) et des antibiotiques pen-strep (1 %) (2x milieu basal; Tableau des matériaux).
4. Prenez une culture stérile de tissu traitée 96 U-bottom plaque de puits (Tableau des matériaux) et d'identifier les puits où les cellules seront cultivées (conception de plaque dans la figure 1B).
   REMARQUE: Il est conseillé aux utilisateurs d'éviter les puits marginaux, car ils sont plus sensibles à l'évaporation.
5. Mettre 100 ll de milieu basal 2x préalablement préparé à l'étape 2.3 dans ces puits. Dans le NR marqué bien ajouter 2 'L d'une solution NR 100x (Tableau des Matériaux). Réapprovisionnez NR toutes les 24 h.
   REMARQUE: Le réapprovisionnement est spécifique à NR. D'autres modulateurs métaboliques peuvent ou ne peuvent pas avoir besoin de reconstitution.
6. Graines 100 l de cellules préparées à l'étape 2.2 sur les puits contenant 2x milieu basal. Dans cette expérience, le nombre de HSC ensedus par puits se trouvaient entre 800 et 1 000 cellules.
7. Préparer cinq puits supplémentaires contenant 2x milieu basal. Dans chacune de ces cellules ajouter 100.000 cellules entières de moelle (à partir de l'étape 1.13) resuspendues dans 100 'L de milieu d'expansion de cellules souches pour être utilisé comme contrôles de coloration pour l'analyse de cytométrie de flux de post-culture.
   REMARQUE: Si les utilisateurs veulent combiner des marqueurs de cellules souches et des marqueurs mitochondriaux pour l'analyse post-culture, il est recommandé de trier en outre la population progénitrice (cellules CkitMD ou LKSCD150- cellules). Ensemencez ces progéniteurs triés dans les puits de contrôle de coloration pour l'analyse de cytométrie de flux de post-culture. Préparer un puits par couleur de tache unique.
8. Mettre 200 ll d'eau autoclaved dans tous les puits environnants pour réduire l'évaporation des puits contenant des cellules. Laisser la plaque intacte dans un incubateur à 37 oC et 5 % de CO₂ pendant toute la durée de la période de culture (72 h). Retirez la plaque pour reconstituer NR toutes les 24 h et placez-la de nouveau dans l'incubateur.

3. Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire

1. À la fin de la période de culture, préparez une solution 100x de TMRM (20 M) et de vert Mitotracker (10 M) (tache fluorescente verte) dans le milieu d'expansion des cellules souches(Tableau des matériaux).
2. Ajouter 2 ll de la solution TMRM 100x et 2 l de solution de tache fluorescente verte de 100x dans chacun des puits d'essai. Ajouter 2 L de 100x TMRM dans le puits de commande TMRM. Ajouter 2 ll de tache fluorescente verte de 100x dans le puits de commande Mitotracker. Remettre la plaque dans un incubateur à 37 oC et 5 % de CO₂ pendant 45 min. Couvrir le dessus de la plaque de papier d'aluminium.
   REMARQUE: Un contrôle supplémentaire avec Verapamil (inhibiteur de pompe ABC) peut être préparé si l'efflux de colorant médié par la pompe ABC doit être testé. Pour cela, ajouter 50 M Verapamil dans l'un des puits d'essai 1 h avant de coloration pour TMRM et tache fluorescente verte.
3. Retirer la plaque de l'incubateur et la centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Inverser la plaque pour enlever le supernatant. Ajouter 200 oL de tampon FACS standard (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), centrifuger la plaque à 300 x g pendant 5 min. Retirez le supernatant. Répétez cette étape de lavage 3x. Les utilisateurs doivent s'assurer que la plaque est toujours recouverte de papier d'aluminium, afin d'offrir une exposition minimale à la lumière directe.
   REMARQUE: Si les utilisateurs ont besoin de combiner la coloration mitochondriale avec la coloration des cellules souches, l'échantillon devra être incubé avec un mélange d'anticorps de tous les marqueurs de cellules souches et les contrôles d'une seule couleur devront être tachés avec des anticorps individuels séparément à 4 oC pendant 30 à 45 min.
   REMARQUE: À toutes les étapes, les utilisateurs doivent garder la plaque recouverte de papier d'aluminium. Les utilisateurs doivent noter que cette étape de coloration supplémentaire et les étapes de lavage ultérieures peuvent entraîner une perte cellulaire supplémentaire.
4. Resuspendre les cellules dans 200 l de tampon FACS et transférer dans les tubes FACS.
5. Exécuter les échantillons sur le cytomètre d'écoulement (voir Figure 1). Les tubes de couleur unique contenant WBM comprennent : (1) Non taché; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) tache fluorescente verte (FITC); (5) Tache complète (PE et FITC).
6. D'abord acquérir les commandes unicolores pour configurer la machine. Utilisez le logiciel en cours d'exécution sur la machine pour calculer la compensation. Une fois la compensation appliquée, acquérez l'échantillon de HSC et enregistrez autant d'événements que possible.
   REMARQUE: Si les marqueurs de cellules souches et mitochondriales sont combinés, les utilisateurs doivent être particulièrement prudents avec la compensation entre TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5), et Sca-1 (APC). En outre, les échantillons doivent être exécutés immédiatement après coloration.
7. Exporter les fichiers FACS à partir du cytomètre et analyser les données sur un logiciel d'analyse (Tableau des Matériaux).
   1. Pour l'analyse, ouvrez le fichier sur le logiciel d'analyse. L'utilisation de FSC-A et sSC-A pour identifier la population cellulaire. Identifiez les singlets dans les portes suivantes avant de tracer la fraction négative DAPI (cellules vivantes). Dans la porte des cellules vivantes faire une parcelle de contour dans le TMRM et vert canal de taches fluorescentes pour mesurer la masse et la masse, respectivement (Figure 2A). Exporter l'intensité moyenne de fluorescence (IMF) de ces deux canaux dans la porte des cellules vivantes.
   2. La porte basse TMRM est fixée en fonction de la population d'épaules dans le canal TMRM. Le contrôle tMRM d'une seule couleur peut être utilisé pour identifier cette population d'épaules pour définir la porte. Exportez la proportion de cellules vivantes dans la porte basse de TMRM dans votre contrôle et testez des échantillons pour tracer.

Résultats

Dans la figure 1, nous montrons la stratégie de gating pour l'isolement des cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse de la souris et la disposition de la plaque pour leur culture ex vivo. La figure 1A montre l'identification de la fraction de lymphocyte dans la parcelle SSC-A/FSC-A. Les doublets ont été enlevés dans la porte de singlet suivie par l'identification des cellules vivantes par l'absence du signal de DAPI. La popu...

Discussion

Une régulation serrée de la fonction HSC est importante pour maintenir l'hématopoiesis stable pendant la vie d'un organisme. Comme divers autres types de cellules dans le corps, un composant clé qui contribue à la régulation de la fonction HSC est le métabolisme cellulaire. Des études antérieures de notre laboratoire⁹ et d'autres^2,3 ont impliqué l'importance des mitochondries dans le maintien d'un état métabolique distinct dans...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL FACS tubes	Falcon	352235	Sample preparation
96-U bottom plate	Corning	3799	Cell culture
AutoMACS pro separator	Miltenyi Biotec		Automatic Cell separation
BD FACS AriaIII	Becton and Dickinson		Cell sorting
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit	BD	558451	Lineage depletion
BD LSRII	Becton and Dickinson		FACS acquisition machine
BD-DIVA	Becton and Dickinson		Acquisition software
CD150 PE	Biolegend	115904	Antibody staining mix
CD150 PE-Cy5	Biolegend	115912	Antibody staining mix
CD48 PB	Biolegend	103418	Antibody staining mix
Centrifuge- 5810R	Eppendorf		Centrifugation
Ckit PeCy7	Biolegend	105814	Antibody staining mix
Flow jo	FlowJo LLC		FACS Analysis software
GraphPad-Prism	GraphPad		Plotting data into graphs
Mitotracker Green	Invitrogen	M7514	Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM
Nicotinamide Riboside (NR)	Custom synthesized in house		Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM
PBS	CHUV	1000324	Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
Pen-Strep (P/S)	Life technologies	15140122	Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
RBC Lysis buffer	Biolegend	420301	Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)	RnD	427-FL-005/CF	Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL
Recombinant mouse stem cell factor (SCF)	RnD	455-MC-010/CF	Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL
Sca1 APC	Thermo Fisher Scientific	17-5981-82	Antibody staining mix
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium	SIGMA	S0192	Ex vivo culture
Streptavidin Pac orange	Life Technologies	S32365	Antibody staining mix
Streptavidin Tx red	Life Technologies	S872	Antibody staining mix
TMRM	Invitrogen	T668	Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM
Ultra pure EDTA	Invitrogen	15575-038	Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM