Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

Resumo

Aqui descrevemos um método confiável para medir a massa mitocondrial e o potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas cultivadas ex vivo e células T.

Resumo

Um bom equilíbrio de quiescência, auto-renovação e diferenciação é fundamental para preservar a piscina de células-tronco hematopoiéticas (HSC) e manter a produção ao longo da vida de todas as células sanguíneas maduras. Nos últimos anos, o metabolismo celular emergiu como um regulador crucial da função hsc e destino. Nós demonstramos previamente que a modulação do metabolismo mitocondrial influencia o destino de HSC. Especificamente, ao desacoplado quimicamente a cadeia de transporte de elétrons, fomos capazes de manter a função HSC em condições culturais que normalmente induzem a diferenciação rápida. No entanto, limitar os números do HSC muitas vezes impede o uso de ensaios padrão para medir o metabolismo do HSC e, portanto, prever sua função. Aqui, relatamos um ensaio de citometria de fluxo simples que permite a medição confiável do potencial da membrana mitocondrial e massa mitocondrial em células escassas, como HSCs. Discutimos o isolamento de HSCs da medula óssea do rato e a medição da massa mitocondrial e da cultura pós-vivo potencial de membrana. Como exemplo, mostramos a modulação desses parâmetros em HSCs por meio de tratamento com modulador metabólico. Além disso, ampliamos a aplicação dessa metodologia sobre células T derivadas do sangue periférico humano e linfocitos infiltrados de tumores humanos (TILs), mostrando diferenças dramáticas em seus perfis mitocondriais, possivelmente refletindo diferentes células T Funcionalidade. Acreditamos que este ensaio pode ser empregado em exames para identificar moduladores do metabolismo mitocondrial em vários tipos de células em diferentes contextos.

Introdução

As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são uma pequena população de células que residem na medula óssea, garantindo a produção sanguínea e a homeostase ao longo da vida útil de um organismo. HSCs mediar este processo, dando origem a progenitores que, por sua vez, produzem linhagens de células sanguíneas maduras diferenciadas terminalmente através de várias rodadas de divisão celular e passos de diferenciação bem orquestrada¹. É importante ressaltar que os HSCs produzem sua energia através da glicolíse anaeróbica. Em contraste, progenitores hematopoiéticos mais comprometidos e ativos mudam seu metabolismo para o metabolismo mitocondrial^2,3,4. Acredita-se que este estado metabólico distinto proteja os HSCs de danos celulares infligidos por espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidas por mitocôndrias ativas, mantendo assim sua função in vivo de longo prazo^5,6,7,8. A medição direta do estado metabólico do HSC é desafiadora e muitas vezes baixa taxa de rendimento devido aos seus números limitados. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em citometria de fluxo para a medição robusta do potencial da membrana mitocondrial (Δ Já demonstramos anteriormente que o baixo Δém é um marcador funcional de boa-fé de HSCs altamente purificados⁹ e moduladores metabólicos capazes de reduzir a função de MSCs^9,10. Aqui propomos o uso de nosso método no perfil mitocondrial de HSCs como estratégia para identificar novas moléculas capazes de melhorar o potencial de reconstituição do sangue a longo prazo dos HSCs.

Como exemplo, demonstramos que este ensaio mede de forma confiável a redução do HSC Δm após a exposição à vitamina B3 analógico nicotinamida ribosía (NR). Assim, em nosso estudo recentemente publicado, demonstramos que a NR melhora fortemente o pós-transplante de recuperação do sangue em ambos os sistemas de camundongos de camundongos e de camundongos humanizados, melhorando diretamente o tronco hematopoiético e as funções progenitoras¹⁰. A capacidade de tais moduladores metabólicos é de grande valor clínico, considerando que uma taxa de mortalidade de 25% está ligada ao atraso no sangue e recuperação imunológica em pacientes pós-transplantados^11,12.

Além disso, fornecemos evidências de que essa metodologia pode ser aplicada para a caracterização do perfil metabólico e função das células T humanas. Nos últimos anos, o desenvolvimento da terapia celular adotiva (ACT) usando tumor autólogo infiltrando linfócitos (TILs) tornou-se a abordagem mais eficaz para certos tipos de câncer avançado com prognóstico extremamente desfavorável (por exemplo, melanoma metastático, onde >50% dos pacientes respondem ao tratamento e até 24% dos pacientes têm regressão completa)¹³. No entanto, TILs que abrigam atividade antitumoral suficiente são difíceis de gerar¹⁴. A proliferação extensa e estimulação que as TILs sofrem durante a expansão ex vivo causam exaustão e senescência das células T que prejudicam drasticamente a resposta antitumoral de células T¹⁵. Importante, a capacidade antitumoral dos TILs é lig firmemente a seu metabolismo^16,17 e as aproximações visadas modular o metabolismo com a inibição do caminho de PI3K/Akt produziram resultados encorajadores^18,19. Por esta razão, comparamos o Δ, de células T derivadas de células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) e TILs de operários do paciente, e mostramos que as células T derivadas de PBMC menos diferenciadas têm menor massa de δe e mitocondrial em comparação com TILs terminalmente diferenciadas.

Nós imaginamos que este ensaio pode ser usado para identificar os moduladores metabólicos novos que melhoram a função da pilha de HSC e de T através da modulação de Δ.

Protocolo

Todos os experimentos descritos no manuscrito seguem as diretrizes de nossa instituição e foram realizados de acordo com a lei suíça para experimentação animal (Autorização: VD3194) e para pesquisas envolvendo amostras humanas (Protocolo: 235/14; CER-VD 2017-00490)

1. Extração hematopoiética de células-tronco

1. Compre ratos C57BL6/J do tipo selvagem e mantenha-os na casa animal no mínimo uma semana para reduzir o esforço transporte-associado.
2. No dia do experimento, eutanásia o mouse usando asfixia CO_2.
3. Pulverizar o rato com 70% de etanol para esterilizar a pele e abrir o rato na barriga usando ferramentas cirúrgicas padrão, como tesouras de dissecação e fórceps, para cortar os ossos do fêmur e tíbia das pernas traseiras.
4. Retire os músculos ligados ao fêmur, tíbia e a pélvis usando uma toalha de papel macia e coloque os ossos limpos em um tubo de 50 mL contendo PBS com 1 mM EDTA (buffer) no gelo.
5. Pulverizar um almofariz e pilão com 70% de etanol e colocá-lo em um capuz de cultura celular. Esterilizá-lo com UV por 30 minutos. Pós esterilização enxaguar a argamassa e pilão com tampão para remover vestígios de etanol.
6. Coloque os ossos limpos com algum buffer (~ 10 mL) na argamassa e esmagá-los suavemente para obter a medula óssea para fora em suspensão. Agora, recolher a suspensão celular e passá-lo através de um filtro de célula de 70 μm em um tubo de 50 mL para obter uma única suspensão celular.
7. Repita o passo 1.6 até que toda a medula óssea tenha sido extraída e os detritos ósseos fiquem brancos.
8. Coloque o tubo de 50 mL (s) contendo a suspensão de célula única medula óssea em uma centrífuga. Executar a centrífuga a 300 x g por 10 min a 4 °C para pelotas das células.
9. Enquanto isso, prepare 10 mL de 1x RBC lysis buffer em água destilada autocllavada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm.
10. Recolher o tubo de amostra da centrífuga e decantar o supernatant. Pipeta o tampão de lyse 1x RBC(Tabela de Materiais)na pelota celular. Desalojar a pelota e preparar uma solução homogênea por pipetting cima e para baixo algumas vezes. Permita que o tubo esteja à temperatura ambiente por 1-2 min para a lyse RBC ocorrer. Pare o processo de lyse enchendo o tubo com o buffer.
11. Coloque o tubo em uma centrífuga e gire a 300 x g por 5 min a 4 °C. Recolher o tubo da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota adicionando 10 mL de buffer e filtre a solução em um novo tubo de 50 mL através de um filtro de célula de 70 μm para remover os detritos devido à lyse RBC.
12. Centrífuga do tubo a 300 x g por 5 min a 4 °C. Recolher o tubo da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota em 500 μL de buffer.
13. Retire um alíquot de 100 μL e mantenha-se em um tubo separado de 1,5 mL. Adicione 50 μL de coquetel de anticorpos de esgotamento da linhagem de biotina do kit de enriquecimento progenitor(Mesa de Materiais)aos 450 μL restantes de suspensão celular. Incubar a 4 °C em uma coqueteleira por 15 min.
14. Adicione 15 mL de buffer e centrífuga o tubo a 300 x g por 5 min a 4 °C. Recolher o tubo da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota em 460 μL de buffer. Retire um alíquot de 10 μL e mantenha-se em um tubo separado de 1,5 mL.
15. Adicione 50 μL de contas magnéticas de streptavidin do kit de enriquecimento de progenitor(Tabela de Materiais),à suspensão celular restante de 450 μL. Incubar a 4 °C em uma coqueteleira por 15 min.
16. Adicione 15 mL de buffer e centrífuga o tubo a 300 x g por 5 min a 4 °C. Recolher o tubo da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota em 5 mL de buffer e transfira a solução para um tubo de 15 mL.
17. Leve o tubo para um separador de células automatizado(Tabela de Materiais). Executar um programa de lavagem para enxaguar e preparar a tubulação do separador celular. Coloque a amostra e dois tubos de coleta no suporte do tubo. Realizar a separação usando o programa"Esgotar". Colete as frações positivas e negativas do separador de células automatizado uma vez que a corrida tenha terminado.
    Nota: Na ausência de um separador automático de células, os usuários podem usar colunas magnéticas manuais e ímãs correspondentes, de acordo com o manual do usuário. Os usuários devem ter em mente que o processo de separação manual é mais lento do que o automatizado. Além disso, as colunas manuais são mais propensas a entupimento. Portanto, os usuários são aconselhados a diluir a amostra e carregar na coluna lentamente.
18. Descarte a fração positiva. Encha o tubo de fração negativa com tampão. Centrífuga do tubo a 300 x g por 5 min a 4 °C.
19. Enquanto isso, prepare a mistura de anticorpos em 1 mL de solução de volume final e os controles de cor única em 200 μL de solução de volume final, conforme descrito na Tabela de Materiais e tabela 1.
    Nota: Se o TMRM e a mancha mitocondrial fluorescente verde devem ser combinados com a coloração do marcador da pilha de haste, substitua então CD150-PE com CD150-PEcy5 e vermelho de Streptavidin-Tx com laranja de Streptavidin-Pac.
20. Recolher o tubo de amostra da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota em 1 mL de mistura de anticorpos. Adicione 10 μL de células (a partir do passo 1.13) em cada um dos tubos de controle de cor única (exceto linhagem). Adicione 10 μL de células (a partir do passo 1.14) no tubo de cor única linhagem.
21. Incubar a amostra e tubos de controle de cor única a 4 °C em uma coqueteleira por 45 minutos. Cubra o balde de gelo com uma tampa ou folha de alumínio.
22. Encha todos os tubos com tampão e centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatant e resuspenda a amostra em 1 mL de controles de buffer e de cor única em 200 μL de buffer.
23. Transfira a amostra e os controles de cor única para tubos FACS topos do filtro 5 mL.
24. Leve os tubos para a máquina de classificação e classificar a população HSC (estratégia gating na Figura 1A)em tubos de 1,5 mL contendo 400 μL de meio de expansão de células-tronco.

2. Ex Vivo Cultura de Células-Tronco Hematopoiéticas

1. Coletar tubos contendo células classificadas (ver seção 1 para extração celular). Centrífuga s os tubos a 300 x g por 5 min a 4 °C. Remova delicadamente a maioria do supernatant sem desalojar a pelota e deixe 50-80 μL sobre a pelota da pilha. Isso minimiza a perda celular.
2. Resuspende a pelota celular na expansão de células-tronco média a um volume final dependente do número de condições a serem testadas (contagem de 100 μL por poço/condição de cultura).
3. Prepare um meio de cultura 2x contendo fator de expansão de células-tronco, fator de células-tronco (200 ng/mL), ligand FLT3 (4 ng/mL) e antibióticos de pen-strep (1%) (2x médio basal; Tabela de Materiais).
4. Pegue uma cultura de tecido estéril tratado 96 U-bottom placa bem(Tabela de Materiais)e identificar os poços onde as células serão cultivadas (design da placa na Figura 1B).
   Nota: Os usuários são aconselhados a evitar poços marginais, pois são mais suscetíveis à evaporação.
5. Coloque 100 μL de 2x médio basal previamente preparado na etapa 2.3 nestes poços. Na NR marcada bem adicionar 2 μL de uma solução 100x NR(Tabela de Materiais). Reabastecer NR a cada 24 h.
   Nota: O reabastecimento é específico para a NR. Outros moduladores metabólicos podem ou não precisar de reposição.
6. Semente 100 μL das pilhas preparadas na etapa 2.2 sobre os poços que contêm o meio basal de 2x. Neste experimento, o número de HSCs semeados por poço estava entre 800-1.000 células.
7. Prepare cinco poços extras contendo 2x médio basal. Em cada uma delas adiciona 100.000 células inteiras de medula óssea (do passo 1.13) resuspendidas em 100 μL de meio de expansão de células-tronco para serem usadas como controles de coloração para análise de citometria pós-cultura.
   Nota: Se os usuários quiserem combinar marcadores de células-tronco e marcadores mitocondriais para análise pós-cultura, recomenda-se, adicionalmente, classificar a população de progenitores (células Ckit+ ou células LKSCD150). Semente estes progenitores classificados nos poços de controle de coloração para análise de citometria pós-cultura. Prepare um poço por única cor de mancha.
8. Coloque 200 μL de água autocllavada em todos os poços circundantes para reduzir a evaporação de poços contendo células. Deixe a placa intacta em uma incubadora a 37 °C e 5% CO₂ para a duração do período de cultura (72 h). Retire a placa para reabastecer NR a cada 24 h e colocá-lo de volta na incubadora.

3. Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana

1. Ao final do período cultural, prepare uma solução 100x de TMRM (20 μM) e Mitotracker verde (10 μM) (mancha fluorescente verde) no meio de expansão de células-tronco(Tabela de Materiais).
2. Adicione 2 μL da solução TMRM 100x e 2 μL de 100x solução de mancha fluorescente verde em cada um dos poços de teste. Adicione 2 μL de 100x TMRM no poço de controle TMRM. Adicione 2 μL de 100x mancha fluorescente verde no controle Mitotracker bem. Coloque a placa de volta em uma incubadora a 37 °C e 5% CO₂ para 45 min. Cubra a parte superior da placa com papel alumínio.
   Nota: Um controle adicional com Verapamil (inibidor da bomba ABC) pode ser preparado se a bomba ABC mediado dintileflux tineflux precisa ser testado. Para isso, adicione 50 μM Verapamil em um dos poços de teste 1 h antes de colorir para TMRM e mancha fluorescente verde.
3. Retire a placa da incubadora e centrífuga-lo a 300 x g por 5 min. Invert a placa para remover o supernatant. Adicione 200 μL de buffer FACS padrão (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), centrífuga a placa em 300 x g por 5 min. Retire o supernatant. Repita este passo de lavagem 3x. Os usuários devem garantir que a placa seja sempre coberta com papel alumínio, para fornecer exposição mínima à luz direta.
   Nota: Se os usuários precisarem combinar a coloração mitocondrial com coloração de células-tronco, a amostra precisará ser incubada com uma mistura de anticorpos de todos os marcadores de células-tronco e os controles de cor única precisarão ser manchados com anticorpos individuais separadamente a 4 °C por 30-45 min.
   Nota: Em todas as etapas os usuários devem manter a placa coberta com folha de alumínio. Os usuários devem notar que esta etapa de coloração adicional e etapas de lavagem subsequentes podem resultar em perda adicional de células.
4. Resuspenda as células em 200 μL de buffer FACS e transfira para tubos FACS.
5. Executar as amostras no citometro de fluxo (ver Figura 1). Os tubos de cor simples que contêm WBM incluem: (1) Unstained; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) mancha fluorescente verde (FITC); (5) Mancha total (PE e FITC).
6. Primeiro adquirir os controles de cor única para configurar a máquina. Use o software de execução na máquina para calcular a compensação. Uma vez aplicada uma compensação, adquirir a amostra HSC e registrar tantos eventos quanto possível.
   Nota: Se as células-tronco e marcadores mitocondriais são combinados, os usuários precisam ser particularmente cuidadosos com a compensação entre TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) e Sca-1 (APC). Além disso, as amostras devem ser executadas imediatamente após a coloração.
7. Exportar os arquivos FACS do citometro e analisar os dados em um software de análise(Tabela de Materiais).
   1. Para a análise, abra o arquivo sobre o software de análise. Usando FSC-A e SSC-A gating identificar a população celular. Identifique as anotações nos portões ao lado antes de traçar a fração negativa da DAPI (células vivas). No portão celular ao vivo fazer um lote de contorno no TMRM e canal mancha fluorescente verde para medir Δ 'm e massa, respectivamente (Figura 2A). Exportar a intensidade média da fluorescência (MFI) destes dois canais na porta viva da pilha.
   2. A porta baixa de TMRM é ajustada baseada na população do ombro na canaleta de TMRM. O controle de cor única TMRM pode ser usado para identificar essa população de ombro para definir o portão. Exportar a proporção de células vivas no portão baixo TMRM em seu controle e amostras de teste para conspirar.

Resultados

Na Figura 1 mostramos a estratégia de gating para o isolamento das células-tronco hematopoiéticas da medula óssea do rato e o layout da placa para sua cultura ex vivo. A Figura 1A mostra a identificação da fração de linfócitos na trama do SSC-A/FSC-A. Os doublets foram removidos na porta do singlet seguida pela identificação de pilhas vivas pela ausência do sinal de DAPI. A população de LKS, definida pela linhagem- Sca1⁺...

Discussão

Uma regulamentação rigorosa da função do HSC é importante para manter a hematopoiese estável durante a vida de um organismo. Como vários outros tipos de células no corpo, um componente-chave que contribui para a regulação da função HSC é o metabolismo celular. Estudos anteriores do nosso laboratório⁹ e outros^2,3 implicaram a importância das mitocôndrias na manutenção de um estado metabólico distinto em HSCs. Devido ao n?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL FACS tubes	Falcon	352235	Sample preparation
96-U bottom plate	Corning	3799	Cell culture
AutoMACS pro separator	Miltenyi Biotec		Automatic Cell separation
BD FACS AriaIII	Becton and Dickinson		Cell sorting
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit	BD	558451	Lineage depletion
BD LSRII	Becton and Dickinson		FACS acquisition machine
BD-DIVA	Becton and Dickinson		Acquisition software
CD150 PE	Biolegend	115904	Antibody staining mix
CD150 PE-Cy5	Biolegend	115912	Antibody staining mix
CD48 PB	Biolegend	103418	Antibody staining mix
Centrifuge- 5810R	Eppendorf		Centrifugation
Ckit PeCy7	Biolegend	105814	Antibody staining mix
Flow jo	FlowJo LLC		FACS Analysis software
GraphPad-Prism	GraphPad		Plotting data into graphs
Mitotracker Green	Invitrogen	M7514	Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM
Nicotinamide Riboside (NR)	Custom synthesized in house		Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM
PBS	CHUV	1000324	Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
Pen-Strep (P/S)	Life technologies	15140122	Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
RBC Lysis buffer	Biolegend	420301	Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)	RnD	427-FL-005/CF	Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL
Recombinant mouse stem cell factor (SCF)	RnD	455-MC-010/CF	Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL
Sca1 APC	Thermo Fisher Scientific	17-5981-82	Antibody staining mix
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium	SIGMA	S0192	Ex vivo culture
Streptavidin Pac orange	Life Technologies	S32365	Antibody staining mix
Streptavidin Tx red	Life Technologies	S872	Antibody staining mix
TMRM	Invitrogen	T668	Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM
Ultra pure EDTA	Invitrogen	15575-038	Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM