Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Messung des mitochondrialen Massen- und Membranpotenzials in ex vivo kultivierten hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen.

Zusammenfassung

Ein feines Gleichgewicht aus Ruhe, Selbsterneuerung und Differenzierung ist der Schlüssel, um den hämatopoetischen Stammzellpool (HSC) zu erhalten und die lebenslange Produktion aller reifen Blutkörperchen aufrechtzuerhalten. In den letzten Jahren hat sich der Zellstoffwechsel zu einem entscheidenden Regulator der HSC-Funktion und des Schicksals entwickelt. Wir haben bereits gezeigt, dass die Modulation des mitochondrialen Stoffwechsels das Schicksal des HSC beeinflusst. Insbesondere konnten wir durch die chemische Entkopplung der Elektronentransportkette die HSC-Funktion unter Kulturbedingungen aufrechterhalten, die normalerweise eine schnelle Differenzierung induzieren. Die Begrenzung der HSC-Zahlen schließt jedoch häufig die Verwendung von Standard-Assays aus, um den HSC-Stoffwechsel zu messen und daher ihre Funktion vorherzusagen. Hier berichten wir über einen einfachen Durchflusszytometrie-Assay, der eine zuverlässige Messung des mitochondrialen Membranpotenzials und der mitochondrialen Masse in knappen Zellen wie HSCs ermöglicht. Wir diskutieren die Isolierung von HSCs aus dem Knochenmark der Maus und die Messung von mitochondrialen Masse- und Membranpotenzialen nach ex vivo Kultur. Als Beispiel zeigen wir die Modulation dieser Parameter in HSCs über die Behandlung mit einem Metabolenmodulator. Darüber hinaus erweitern wir die Anwendung dieser Methode auf menschliche periphere, blutabgeleitete T-Zellen und menschliche Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TILs), die dramatische Unterschiede in ihren mitochondrialen Profilen aufweisen, die möglicherweise verschiedene T-Zellen widerspiegeln. Funktionalität. Wir glauben, dass dieser Assay in Screenings eingesetzt werden kann, um Modulatoren des mitochondrialen Stoffwechsels in verschiedenen Zelltypen in verschiedenen Kontexten zu identifizieren.

Einleitung

Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) sind eine kleine Population von Zellen, die im Knochenmark leben und die Blutproduktion und Homöostase während der gesamten Lebensdauer eines Organismus gewährleisten. HSCs vermitteln diesen Prozess, indem sie Vorläufer hervorrufen, die wiederum endlos differenzierte reife Blutzelllinien über mehrere Zellteilungsrunden und gut orchestrierte Differenzierungsschritte¹erzeugen. Wichtig ist, dass HSCs ihre Energie über anaerobe Glykolykose erzeugen. Im Gegensatz dazu schalten engagiertere und aktive hämatopoetische Vorläufer ihren Stoffwechsel in Richtung mitochondrialer Stoffwechsel^2,3,4. Dieser ausgeprägte Stoffwechselzustand wird geglaubt, um die HSCs vor zellulären Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) durch aktive Mitochondrien verursacht zu schützen, wodurch ihre langfristige in vivo Funktion^5,6,7,8. Die direkte Messung des HSC-Stoffwechselzustands ist eine Herausforderung und aufgrund ihrer begrenzten Anzahl oft geringer Durchsatz. Hier beschreiben wir einen strömungszytometriebasierten Assay zur robusten Messung des mitochondrialen Membranpotentials (M) mit Tetramethylrhodinmethylester (TMRM) Fluoreszenz und mitochondrialer Masse unter Verwendung eines grünen fluoreszierenden mitochondrialen Flecks (Mitotracker Green) in HSCs. Wir haben bereits gezeigt, dass low 'm ein bona-fide funktioneller Marker von hochgereinigten HSCs⁹ und metabolischen Modulatoren ist, die in der Lage sind, die HSCs-Funktion^9,10zu verbessern. Hier schlagen wir die Verwendung unserer Methode auf HSCs mitochondriale Profilierung als Strategie zur Identifizierung neuartiger Moleküle vor, die in der Lage sind, das langfristige Rekonstitutionspotenzial der HSCs zu verbessern.

Als Beispiel zeigen wir, dass dieser Assay zuverlässig die Senkung von HSC-M bei Exposition gegenüber Vitamin B3-analogem Nicotinamid-Ribosid (NR) misst. Dementsprechend zeigen wir in unserer kürzlich veröffentlichten Studie, dass NR die Blutrückgewinnung nach der Transplantation sowohl in Maus- als auch in humanisierten Maussystemen stark verbessert, indem es die hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferfunktionen direkt verbessert¹⁰. Die Kapazität solcher metabolischen Modulatoren ist von großem klinischen Wert, wenn man bedenkt, dass eine 25% Sterberate mit Verzögerungen bei der Blut- und Immunregeneration bei posttransplantierten Patienten verbunden ist^11,12.

Darüber hinaus liefern wir Beweise dafür, dass diese Methode für die Charakterisierung des metabolischen Profils und der Funktion menschlicher T-Zellen angewendet werden kann. In den letzten Jahren ist die Entwicklung der Adoptivzelltherapie (ACT) mit autologen Tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) zum effektivsten Ansatz für bestimmte Arten von fortgeschrittenem Krebs mit extrem ungünstiger Prognose (z. B. metastasierendes Melanom, bei dem >50% der Patienten auf eine Behandlung ansprechen und bis zu 24% der Patienten eine vollständige Regression haben)^geworden. TiLs, die eine ausreichende Antitumoraktivität haben, sind jedoch schwierig,¹⁴zu erzeugen. Die umfangreiche Proliferation und Stimulation, die TILs während der Ex-vivo-Expansion erfahren, verursacht T-Zell-Erschöpfung und Seneszenz, die die T-Zell-Antitumorreaktion dramatisch beeinträchtigen¹⁵. Wichtig ist, dass die antitumorale Kapazität der TILs eng mit ihrem Stoffwechsel^16,17 verbunden ist und Ansätze, die darauf abzielen, den Stoffwechsel durch die Hemmung des PI3K/Akt-Signalwegs zu modulieren, ermutigende Ergebnisse hervorgebracht haben^18,19. Aus diesem Grund vergleichen wir die von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) und patientenabgeleiteten TILs gewonnenen T-Zellen und zeigen, dass weniger differenzierte PBMC-abgeleitete T-Zellen eine niedrigere Und mitochondriale Masse aufweisen als endlos differenzierte TILs.

Wir stellen uns vor, dass dieser Assay verwendet werden kann, um neuartige metabolische Modulatoren zu identifizieren, die die HSC- und T-Zellfunktion durch die Modulation von m verbessern.

Protokoll

Alle im Manuskript beschriebenen Experimente folgen den Richtlinien unserer Institution und wurden nach schweizerischem Tierversuchsrecht (Zulassung: VD3194) und für die Forschung an menschlichen Proben durchgeführt (Protokoll: 235/14; CER-VD 2017-00490)

1. Hämatopoetische Stammzellextraktion

1. Kaufen Sie wilde Mäuse des Typs C57BL6/J und halten Sie sie mindestens eine Woche im Tierheim, um transportassoziierten Stress zu reduzieren.
2. Am Tag des Experiments, euthanisieren Sie die Maus mit CO 2-Erstickung.
3. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, um das Fell zu sterilisieren und schneiden Sie die Maus am Bauch mit Standard-Chirurgischen Werkzeugen, wie Sezierschere und Zange, um den Oberschenkelknochen und Tibiaknochen von den Hinterbeinen zu schneiden.
4. Entfernen Sie die Muskeln, die an Oberschenkelknochen, Tibia und Becken befestigt sind, mit einem weichen Papiertuch und legen Sie die gereinigten Knochen in ein 50 ml-Rohr mit PBS mit 1 mM EDTA (Puffer) auf Eis.
5. Einen Mörtel und Einen Stößel mit 70% Ethanol besprühen und in eine Zellkulturhaube geben. Sterilisieren Sie es mit UV für 30 min. Nach der Sterilisation spülen Sie den Mörtel und Stößel mit Puffer, um Spuren von Ethanol zu entfernen.
6. Legen Sie die sauberen Knochen mit etwas Puffer (ca. 10 ml) in den Mörtel und zerkleinern Sie sie vorsichtig, um das Knochenmark in Suspension heraus zu bekommen. Sammeln Sie nun die Zellsuspension und leiten Sie sie durch ein 70-m-Zellsieb in ein 50 ml-Rohr, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
7. Wiederholen Sie Schritt 1.6, bis das gesamte Knochenmark extrahiert wurde und der Knochenrest weiß geworden ist.
8. Legen Sie die 50 ml Tube(n) mit der Einzelzellsuspension des Knochenmarks auf eine Zentrifuge. Führen Sie die Zentrifuge bei 300 x g 10 min bei 4 °C, um die Zellen zu pellet.
9. In der Zwischenzeit 10 ml 1x RBC-Lysepuffer in autoklaviertem destilliertem Wasser vorbereiten. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-mm-Filter.
10. Sammeln Sie das Probenrohr aus der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Pipette den 1x RBC Lyse Puffer (Tabelle der Materialien) auf dem Zellpellet. Das Pellet austreiben und eine homogene Lösung vorbereiten, indem man ein paar Mal auf und ab pfeift. Lassen Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 1-2 min für die RBC-Lyse auftreten. Stoppen Sie den Lyseprozess, indem Sie das Rohr mit dem Puffer füllen.
11. Das Rohr auf eine Zentrifuge legen und bei 300 x g bei 4 °C 5 min drehen. Sammeln Sie das Rohr von der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie 10 ml Puffer hinzufügen und filtern Sie die Lösung über ein 70-ml-Zellsieb in ein neues 50 ml-Rohr, um die Trümmer aufgrund der RBC-Lyse zu entfernen.
12. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Sammeln Sie das Rohr von der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in 500 l Puffer aus.
13. Entfernen Sie ein 100 L Aliquot und halten Sie es in einem separaten 1,5 ml-Rohr auf. Fügen Sie den verbleibenden 450 l Biotin-L-Antikörper-Antikörpercocktail aus dem Vorläuferanreicherungskit(Tabelle der Materialien) zu den restlichen 450 l Zellsuspension hinzu. Bei 4 °C auf einem Shaker 15 min inkubieren.
14. 15 ml Puffer hinzufügen und das Rohr bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrieren. Sammeln Sie das Rohr von der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in 460 L Puffer aus. Entfernen Sie ein 10 L Aliquot und halten Sie es in einem separaten 1,5 ml-Rohr auf.
15. Fügen Sie der verbleibenden 450-L-Zellsuspension 50 L Streptavidin-Magnetperlen aus dem Vorläuferanreicherungskit(Materialtabelle)hinzu. Bei 4 °C auf einem Shaker 15 min inkubieren.
16. 15 ml Puffer hinzufügen und das Rohr bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrieren. Sammeln Sie das Rohr von der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Das Pellet in 5 ml Puffer wieder aufhängen und die Lösung in ein 15 ml Rohr übertragen.
17. Nehmen Sie das Rohr zu einem automatisierten Zellabscheider (Tabelle der Materialien). Führen Sie ein Waschprogramm aus, um die Schläuche des Zellabscheiders zu spülen und zu grundieren. Legen Sie die Probe und zwei Sammelrohre auf den Rohrhalter. Führen Sie die Trennung mit dem Programm "Deplete" durch. Sammeln Sie die positiven und die negativen Brüche aus dem automatisierten Zelltrennzeichen, sobald der Lauf beendet ist.
    HINWEIS: In Ermangelung eines automatischen Zellabscheiders können die Benutzer manuelle Magnetsäulen und entsprechende Magnete gemäß der Bedienungsanleitung verwenden. Die Benutzer sollten bedenken, dass der Prozess der manuellen Trennung langsamer ist als der automatisierte. Außerdem sind die manuellen Spalten anfälliger für Verstopfungen. Daher wird Benutzern empfohlen, die Probe zu verdünnen und die Spalte langsam zu belasten.
18. Entsorgen Sie den positiven Bruch. Füllen Sie das negative Bruchrohr mit Puffer. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
19. In der Zwischenzeit bereiten Sie den Antikörpermix in 1 ml Endvolumenlösung und die einfarbigen Steuerungen in 200 l Endvolumenlösung vor, wie in Tabelle der Materialien und Tabelle 1beschrieben.
    HINWEIS: Wenn das TMRM und der grüne fluoreszierende mitochondriale Fleck mit Stammzellmarkerfärbung kombiniert werden sollen, dann ersetzen Sie CD150-PE durch CD150-PEcy5 und Streptavidin-Tx rot durch Streptavidin-Pac Orange.
20. Sammeln Sie das Probenrohr aus der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Das Pellet in 1 ml Antikörpermischung wieder aufhängen. Fügen Sie in jedem der einfarbigen Steuerröhrchen (außer Linie) 10 L Zellen (ab Schritt 1.13) hinzu. Fügen Sie 10 L Zellen (ab Schritt 1.14) in die Einfarbigröhre der Abstammung ein.
21. Inkubieren Sie die Proben- und einfarbigen Steuerrohre bei 4 °C auf einem Shaker für 45 min. Bedecken Sie den Eiskübel mit einem Deckel oder einer Aluminiumfolie.
22. Füllen Sie alle Rohre mit Puffer und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und setzen Sie die Probe in 1 ml Puffer- und einfarbigen Steuerelementen in 200 L Puffer wieder aus.
23. Übertragen Sie die Probe und die einfarbigen Steuerungen auf 5 ml Filteroben-FACS-Rohre.
24. Nehmen Sie die Rohre zur Sortiermaschine und sortieren Sie die HSC-Population (Gating-Strategie in Abbildung 1A) in 1,5 ml-Rohren, die 400 l Stammzellausdehnungsmedium enthalten.

2. Ex-Vivo-Kultur hämatopoetischer Stammzellen

1. Sammeln Sie Rohre mit sortierten Zellen (siehe Abschnitt 1 für die Zellextraktion). Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstandes, ohne das Pellet zu lösen, und lassen Sie 50–80 l auf dem Zellpellet. Dadurch wird der Zellverlust minimiert.
2. Das Zellpellet im Stammzellexpansionsmedium abhängig von der Anzahl der zu testenden Bedingungen auf ein endgültiges Volumen aussetzen (Anzahl 100 l pro Brunnen/Kulturzustand).
3. Vorbereitung eines 2x Kulturmediums mit Stammzellexpansionsmedium, Stammzellfaktor (200 ng/ml), FLT3-Ligand (4 ng/ml) und Pen-Strep-Antibiotika (1%) (2x Basalmedium; Materialtabelle).
4. Nehmen Sie eine sterile Gewebekultur behandelt 96 U-Boden-Brunnenplatte (Tabelle der Materialien) und identifizieren Sie die Brunnen, in denen die Zellen kultiviert werden (Plattendesign in Abbildung 1B).
   HINWEIS: Benutzern wird empfohlen, marginale Brunnen zu vermeiden, da sie anfälliger für Verdunstung sind.
5. Legen Sie 100 l 2x Basalmedium, das zuvor in Schritt 2.3 hergestellt wurde, in diese Brunnen. In der markierten NR gut 2 l einer 100x NR-Lösung (Materialtabelle )hinzufügen. Nr alle 24 h auffüllen.
   HINWEIS: Die Auffüllung ist spezifisch für NR. Andere Stoffwechselmodulatoren können nachgefüllt werden oder auch nicht.
6. Samen 100 l Zellen, die in Schritt 2.2 auf den Brunnen mit 2x Basalmedium hergestellt werden. In diesem Experiment lagen die HSCs pro Bohrkörper zwischen 800 und 1.000 Zellen.
7. Bereiten Sie fünf zusätzliche Brunnen mit 2x Basalmedium vor. In jeder dieser addieren 100.000 ganze Knochenmarkzellen (ab Schritt 1.13) resuspendiert in 100 l Stammzellausdehnungsmedium als Färbung Spirierungssteuerungen für die Postkultur-Flow-Zytometrie-Analyse verwendet werden.
   HINWEIS: Wenn Benutzer Stammzellmarker und mitochondriale Marker für die Postkulturanalyse kombinieren möchten, wird empfohlen, zusätzlich die Vorläuferpopulation zu sortieren (entweder Ckit+-Zellen oder LKSCD150-Zellen). Samen diese sortierten Vorläufer in den Färbekontrollbrunnen für die Postkultur-Flow-Zytometrie-Analyse. Bereiten Sie einen Brunnen pro einzelnen Fleckenfarbe vor.
8. Legen Sie 200 l autoklaviertes Wasser in alle umliegenden Brunnen, um die Verdunstung aus Brunnen, die Zellen enthalten, zu reduzieren. Lassen Sie die Platte ungestört in einem Inkubator bei 37 °C und 5%_CO2 für die Dauer des Kulturzeitraums (72 h). Entfernen Sie die Platte, um NR alle 24 h aufzufüllen und legen Sie sie wieder in den Inkubator.

3. Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotentials

1. Am Ende der Kulturperiode bereiten Sie eine 100-fache Lösung von TMRM (20 m) und Mitotracker grün (10 m) (grüner fluoreszierender Fleck) im Stammzellausdehnungsmedium(Materialtabelle)vor.
2. Fügen Sie in jeder der Testbrunnen 2 l 100x TMRM-Lösung und 2 l 100x grüne fluoreszierende Fleckenlösung hinzu. Fügen Sie 2 l von 100x TMRM in die TMRM-Steuerung ein. Fügen Sie 2 l von 100x grünen fluoreszierenden Fleck in der Mitotracker-Steuerung gut hinzu. Legen Sie die Platte für 45 min wieder in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO_2. Bedecken Sie die Plattenoberseite mit Aluminiumfolie.
   HINWEIS: Eine zusätzliche Steuerung mit Verapamil (ABC-Pumpenhemmer) kann vorbereitet werden, wenn ABC-Pumpe vermittelten Farbstoff Efflux getestet werden muss. Dazu fügen Sie 50 M Verapamil in eine der Testbrunnen 1 h vor der Färbung für TMRM und grüne fluoreszierende Flecken.
3. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 5 min. Umkehren Sie die Platte, um den Überstand zu entfernen. Fügen Sie 200 l Standard-FACS-Puffer (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS) hinzu, zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3x. Der Anwender muss sicherstellen, dass die Platte immer mit Folie bedeckt ist, um eine minimale Lichteinwirkung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Wenn Benutzer die mitochondriale Färbung mit Stammzellfärbung kombinieren müssen, muss die Probe mit einem Antikörpermix aus allen Stammzellmarkern inkubiert werden, und die einfarbigen Kontrollen müssen mit einzelnen Antikörpern separat bei 4 °C für 30–45 min gefärbt werden.
   HINWEIS: Bei allen Schritten müssen die Benutzer die Platte mit Aluminiumfolie bedeckt halten. Benutzer müssen beachten, dass dieser zusätzliche Färbeschritt und nachfolgende Waschschritte zu einem zusätzlichen Zellverlust führen können.
4. Setzen Sie die Zellen in 200 L FACS-Puffer aus und übertragen Sie sie in FACS-Rohre.
5. Führen Sie die Proben auf dem Durchflusszytometer aus (siehe Abbildung 1). Einfarbige Röhren, die WBM enthalten, sind: (1) Unstained; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) grüner fluoreszierender Fleck (FITC); (5) Voller Fleck (PE und FITC).
6. Erwerben Sie zunächst die einfarbigen Steuerelemente, um die Maschine einzurichten. Verwenden Sie die laufende Software auf dem Computer, um die Kompensation zu berechnen. Sobald die Kompensation angewendet wurde, erwerben Sie die HSC-Probe und zeichnen Sie so viele Ereignisse wie möglich auf.
   HINWEIS: Wenn die Stammzell- und mitochondrialen Marker kombiniert werden, müssen die Anwender besonders vorsichtig sein mit der Kompensation zwischen TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) und Sca-1 (APC). Außerdem sollten die Proben sofort nach der Färbung ausgeführt werden.
7. Exportieren Sie die FACS-Dateien aus dem Zytometer und analysieren Sie die Daten auf einer Analysesoftware (Tabelle der Materialien).
   1. Öffnen Sie für die Analyse die Datei auf der Analysesoftware. Identifizieren Sie mit FSC-A und SSC-A gating die Zellpopulation. Identifizieren Sie Singlets in den nächsten Gates, bevor Sie den negativen DAPI-Anteil (live cells) plotten. Im Live-Zell-Tor erstellen Sie ein Konturdiagramm im TMRM- und grünen fluoreszierenden Fleckenkanal, um die Größe bzw. masse zu messen (Abbildung 2A). Exportieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) dieser beiden Kanäle im Live-Zell-Gate.
   2. Das TMRM Low Gate wird basierend auf der Schulterpopulation im TMRM-Kanal eingestellt. Die TMRM Einfarbigsteuerung kann verwendet werden, um diese Schulterpopulation zu identifizieren, um das Tor einzustellen. Exportieren Sie den Anteil der Lebenden Zellen im TMRM Low Gate in Ihrer Steuerung und testen Sie Proben zum Plotten.

Ergebnisse

In Abbildung 1 zeigen wir die Gating-Strategie zur Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus dem Mausknochenmark und das Layout der Platte für ihre Ex-vivo-Kultur. Abbildung 1A zeigt die Identifizierung des Lymphozytenanteils im SSC-A/FSC-A-Diagramm. Doublets wurden im Singlet-Gate entfernt, gefolgt von der Identifizierung von lebenden Zellen durch das Fehlen eines DAPI-Signals. Die LKS-Population, definiert durch Abstammung - Sca1⁺

Diskussion

Eine strenge Regulierung der HSC-Funktion ist wichtig, um eine stabile Hämatopoese während der Lebensdauer eines Organismus aufrechtzuerhalten. Wie verschiedene andere Zelltypen im Körper ist ein Schlüsselbestandteil, der zur Regulierung der HSC-Funktion beiträgt, der Zellstoffwechsel. Frühere Studien aus unserem Labor⁹ und anderen^2,3 haben die Bedeutung von Mitochondrien für die Aufrechterhaltung eines ausgeprägten Stoffwechselzus...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL FACS tubes	Falcon	352235	Sample preparation
96-U bottom plate	Corning	3799	Cell culture
AutoMACS pro separator	Miltenyi Biotec		Automatic Cell separation
BD FACS AriaIII	Becton and Dickinson		Cell sorting
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit	BD	558451	Lineage depletion
BD LSRII	Becton and Dickinson		FACS acquisition machine
BD-DIVA	Becton and Dickinson		Acquisition software
CD150 PE	Biolegend	115904	Antibody staining mix
CD150 PE-Cy5	Biolegend	115912	Antibody staining mix
CD48 PB	Biolegend	103418	Antibody staining mix
Centrifuge- 5810R	Eppendorf		Centrifugation
Ckit PeCy7	Biolegend	105814	Antibody staining mix
Flow jo	FlowJo LLC		FACS Analysis software
GraphPad-Prism	GraphPad		Plotting data into graphs
Mitotracker Green	Invitrogen	M7514	Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM
Nicotinamide Riboside (NR)	Custom synthesized in house		Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM
PBS	CHUV	1000324	Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
Pen-Strep (P/S)	Life technologies	15140122	Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
RBC Lysis buffer	Biolegend	420301	Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)	RnD	427-FL-005/CF	Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL
Recombinant mouse stem cell factor (SCF)	RnD	455-MC-010/CF	Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL
Sca1 APC	Thermo Fisher Scientific	17-5981-82	Antibody staining mix
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium	SIGMA	S0192	Ex vivo culture
Streptavidin Pac orange	Life Technologies	S32365	Antibody staining mix
Streptavidin Tx red	Life Technologies	S872	Antibody staining mix
TMRM	Invitrogen	T668	Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM
Ultra pure EDTA	Invitrogen	15575-038	Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM