מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

Summary

כאן אנו מתארים שיטה אמינה למדוד מסה מיטוכונדריאלי פוטנציאל קרום בתאי גזע vivo המטפאות לשעבר תאים T.

Abstract

איזון נאה של שקט, התחדשות עצמית, ובידול הוא המפתח כדי לשמר את תא גזע המטבית (HSC) הבריכה ולשמור על ייצור לכל החיים של כדוריות הדם הבוגרות. בשנים האחרונות מטבוליזם הסלולר התפתחה כרגולטור המכריע של הפונקציה HSC והגורל. בעבר הדגמנו כי אפנון של מטבוליזם מיטוכונדריאלי השפעות הגורל HSC. באופן ספציפי, על ידי ביטול צימוד כימית שרשרת התחבורה אלקטרון הצלחנו לשמור על תפקוד HSC בתנאי התרבות, כי בדרך כלל לגרום בידול מהיר. עם זאת, הגבלת מספרי hsc לעתים קרובות מונע את השימוש בבחני למדוד את מטבוליזם hsc ולכן לחזות את תפקידם. כאן, אנו מדווחים על שיטת זרימה פשוטה cy, המאפשרת מדידה אמינה של פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי מסה מיטוכונדריאלי בתאים נדירים כגון HSCs. אנו דנים בבידוד של HSCs מתוך מח עצם העכבר ומדידה של מסה מיטוכונדריאלי, ממברנה פוטנציאל הפוסט לשעבר vivo התרבות. כדוגמה, אנו מציגים את האפנון של פרמטרים אלה ב HSCs באמצעות טיפול עם מאפנן מטבולית. יתר על כן, אנו להאריך את היישום של מתודולוגיה זו על הגוף האנושי הנגזר דם בתאי T ואת הגידול האנושי החדירה לימפוציטים (TILs), מראה הבדלים דרמטיים פרופילים מיטוכונדריאלי שלהם, אולי המשקף תא T שונים פונקציונליות. אנו מאמינים שניתן ליישם את האפשרות הזאת בהקרנות כדי לזהות מודולטורים של חילוף חומרים מיטוכונדריאלי בסוגי תאים שונים בהקשרים שונים.

Introduction

תאי גזע המטפאות (HSCs) הם אוכלוסייה קטנה של תאים המתגוררים במח העצם להבטיח ייצור דם הומאוסטזיס במהלך חייו של אורגניזם. HSCs מתווך תהליך זה על ידי מתן ושלתי כי בתורו לייצר סופני הבדיל תאי דם בוגרים באמצעות מספר סיבובים של החטיבה התא ו מאורגן היטב שלבים¹. חשוב מכך, HSCs לייצר את האנרגיה שלהם באמצעות גליקוליזיס אנאירובית. לעומת זאת, מחויבים יותר פעיל המטפאות ושלתי להחליף את חילוף החומרים שלהם לכיוון חילוף החומרים מיטוכונדריאלי^2,3,4. מצב זה מטבולית ברורים הוא האמין להגן על HSCs מפני נזק הסלולר שנגרמו על ידי מינים חמצן תגובתי (ROS) המיוצר על ידי active מיטוa, ובכך שמירה על הטווח הארוך שלהם בפונקציה vivo^5,6,7,8. מדידה ישירה של מצב מטבולית HSC היא מאתגרת ולעתים קרובות תפוקה נמוכה בשל המספרים המוגבלים שלהם. כאן, אנו מתארים שיטת הזרימה cy, מבוסס על מדידה חזקה של פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ΔΨm) באמצעות מתיל הטטרמתיל (TMRM) ניאון, ומסה מיטוכונדריאלי באמצעות כתם ירוק מיטוכונדריאלי ירוקה (Mitotracker גרין) ב HSCs. הדגמנו בעבר כי נמוך ΔΨm הוא סמן פונקציונלי בתום-בלבד של מטוהרים מאוד HSCs⁹ ו מודולים מטבולית מסוגל להוריד ΔΨm לשפר HSCs פונקציה^9,10. כאן אנו מציעים להשתמש בשיטה שלנו על HSCs פרופיל מיטוכונדריאלי כמו אסטרטגיה כדי לזהות מולקולות הרומן מסוגל לשפר את הפוטנציאל לטווח ארוך של HSCs דם מחדש.

לדוגמה, אנו מדגימים כי האפשרות הזו מודדת באופן אמין את הורדת HSC ΔΨm בעת החשיפה לויטמין B3 באמצעות הריבוסייד (NR). לפיכך, במחקר שפורסם לאחרונה שלנו אנו מדגימים כי ע"נ בחוזקה התאוששות ההתאוששות דם בשני העכבר ההומניסטיים מערכות העכבר על ידי שיפור ישיר גזע המטתית ופונקציות מחולל הקדמון¹⁰. הקיבולת של מודולטורים כגון זה הוא בעל ערך קליני גדול בהתחשב בכך 25% שיעור התמותה מקושר לעיכוב בדם והתאוששות החיסונית בחולים מושתלים^11,12.

יתר על כן, אנו מספקים ראיות כי מתודולוגיה זו ניתן להחיל על האפיון של פרופיל חילוף החומרים ותפקוד של תאי T האדם. בשנים האחרונות, התפתחות של טיפול בתאים המאמצת (ACT) באמצעות גידול אוטוולוגי החדירה לימפוציטים (TILs) הפך את הגישה היעילה ביותר עבור סוגים מסוימים של סרטן מתקדם עם פרוגנוזה שלילי מאוד (למשל, מלנומה גרורתית, שם > 50% של חולים להגיב לטיפול עד 24% מהחולים יש רגרסיה מלאה)¹³ עם זאת, TILs מחסה פעילות אנטי סרטניים מספיק קשה ליצור¹⁴. התפשטות נרחבת וגירוי כי TILs לעבור במהלך הרחבת לשעבר vivo לגרום לתשישות תא T והזדקנות כי לפגוע באופן דרמטי התגובה תא אנטי הגידול¹⁵. חשוב מכך, הקיבולת האנטי מוסרית TILs מקושרת הדוק לחילוף החומרים שלהם^16,17 וגישות שמטרתן לווסת את חילוף החומרים באמצעות עיכוב של מסלול PI3K/akt הפיק לעודד תוצאות^18,19. מסיבה זו, אנו משווים את ΔΨm של תאים שמקורם בתאי דם היקפיים מוניונקה (PBMCs) ואת החולה נגזר TILs, ולהראות כי הבדיל פחות PBMC-נגזר בתאי T יש ΔΨm נמוך יותר מסה מיטוכונדריאלי לעומת TILs הבדיל סופני.

אנו מסוגלים לדמיין שניתן להשתמש בתיקון זה כדי לזהות מאפטורים מטבולית חדשניים המשפרים את פונקציית התאים HSC ו-T באמצעות האפנון של ΔΨm.

Protocol

כל הניסויים המתוארים בכתב היד מתבצעים לפי ההנחיות של המוסד שלנו ובוצעו בהתאם לחוק השוויצרי לניסויים בבעלי חיים (אישור: VD3194) ולמחקר הכרוך בדגימות אנושיות (פרוטוקול: 235/14; מלצר 2017-00490)

1. שליפת תאי גזע

1. לרכוש פראי סוג C57BL6/J עכברים ולשמור אותם בבית בעלי חיים לפחות שבוע כדי להפחית את התחבורה הקשורים למתח.
2. ביום הניסוי, המתת החסד את העכבר באמצעות שיתוף₂ חנק.
3. רסס את העכבר עם 70% אתנול כדי לחטא את הפרווה ולחתוך לפתוח את העכבר על הבטן באמצעות כלים כירורגי רגיל, כגון מספריים לחיתוך מלקחיים, כדי לחתוך את עצם הירך ואת עצמות השוקה מן הרגליים האחוריות.
4. הסר את השרירים המחוברים לעצם הירך, השוקה, ואת האגן באמצעות מגבת נייר רכה ומניחים את העצמות הנקיות בצינור 50 mL המכיל PBS עם 1 מ"מ EDTA (מאגר) על הקרח.
5. רסס מרגמה ומכתש עם 70% אתנול ומניחים אותו במכסה של תרבות התא. לעקר אותו עם UV במשך 30 דקות. פוסט עיקור לשטוף את המרגמה ואת הפילינג עם מאגר כדי להסיר עקבות של אתנול.
6. שים את העצמות הנקיות עם מאגר מסוים (~ 10 מ"ל) בחומר המליטה ולמחוץ אותם בעדינות כדי לקבל את מח העצם בהשעיה. עכשיו, לאסוף את ההשעיה התא ולהעביר אותו דרך מסננת תא 70 יקרומטר לתוך שפופרת 50 mL כדי לקבל השעיה תא יחיד.
7. חזור על שלב 1.6 עד שכל מח העצם הופק ושברי העצם הפך לבן.
8. מניחים את שפופרת 50 mL (s) המכיל את מח העצם השעיה תא יחיד על צנטריפוגה. הפעל את הצנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' כדי לעבור את התאים.
9. בינתיים, להכין 10 מ ל של מאגר הליזה 1x RBC במים מזוקקים אוטוקלאויים. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
10. לאסוף את השפופרת לדוגמה מתוך הצנטריפוגה ו לדקנט supernatant. פיפטה מאגר הליזה 1 x RBC (טבלת חומרים) על הגלולה תא. להוציא את הגלולה ולהכין פתרון הומוגנית על ידי מלטף למעלה ולמטה כמה פעמים. אפשר לצינור להיות בטמפרטורת החדר במשך 1 – 2 דקות להתרחשות הליזה RBC. להפסיק את תהליך הפירוק על ידי מילוי הצינור עם המאגר.
11. מניחים את הצינור על צנטריפוגה ו ספין ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לאסוף את הצינור מהצנטריפוגה ולקחת את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה על ידי הוספת 10 מ ל של מאגר ולסנן את הפתרון לתוך צינור חדש 50 mL באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר כדי להסיר את הפסולת בשל הליזה rbc.
12. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לאסוף את הצינור מהצנטריפוגה ולקחת את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה ב-500 μL של מאגר.
13. הסר מ100 μl סדרת מחלקים ושמור בשפופרת נפרדת של 1.5 mL. הוסף 50 μl של שושלת היוחסין של ביוטין מפחית את קוקטייל הנוגדן מערכת העשרה הקדמון (טבלת חומרים) עד הנותרים 450 μl של השעיית תא. דגירה ב 4 ° c על שייקר עבור 15 דקות.
14. הוסף 15 מ ל של מאגר וצנטריפוגה את הצינור ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לאסוף את הצינור מהצנטריפוגה ולקחת את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה ב-460 μL של מאגר. להסיר 10 μl סדרת מחלקים ולשמור בצינור 1.5 mL נפרד.
15. הוסף 50 μL של חרוזים streptavidin מגנטיים מערכת העשרה מחולל הקדמון (טבלת חומרים), אל ההשעיה הנותרים 450 התאים μl. דגירה ב 4 ° c על שייקר עבור 15 דקות.
16. הוסף 15 מ ל של מאגר וצנטריפוגה את הצינור ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לאסוף את הצינור מהצנטריפוגה ולקחת את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה ב-5 מ ל של מאגר והעבר את הפתרון לשפופרת של 15 מ ל.
17. קח את השפופרת למפריד תאים אוטומטי (טבלה של חומרים). הפעל תוכנית כביסה לשטוף הראש אבובים של מפריד התא. מניחים את המדגם ושני שפופרות אוסף על מחזיק הצינור. בצע הפרדה באמצעות התוכנית "לרוקן". אסוף את השברים החיוביים והשליליים ממפריד התאים האוטומטי לאחר שהריצה הסתיימה.
    הערה: בהעדר מפריד תאים אוטומטי, המשתמשים יכולים להשתמש בטורים מגנטיים ידניים ומגנטים תואמים, לפי המדריך למשתמש. על המשתמשים לזכור שתהליך ההפרדה הידנית איטי יותר מהאוטומטי. כמו כן, העמודות הידניות מועדים יותר לסתימת. לכן, מומלץ למשתמשים לדלל את המדגם ולטעון אותו באיטיות.
18. למחוק את השבר החיובי. מלא את צינור השבר השלילי במאגר. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
19. בינתיים, להכין את שילוב הנוגדן ב 1 מ ל של פתרון הנפח הסופי ואת הפקדים צבע יחיד ב 200 μL של פתרון הנפח הסופי כפי שמתואר בטבלה של חומרים ושולחן 1.
    הערה: אם TMRM ואת הכתם הירוק מיטוכונדריאלי ירוקה הם להיות משולבים עם כתמי סמן תא גזע, לאחר מכן להחליף CD150-PE עם CD150-PEcy5 ו Streptavidin-Tx אדום עם Streptavidin-Pac תפוז.
20. לאסוף את השפופרת לדוגמה מתוך הצנטריפוגה ו לדקנט supernatant. השהה מחדש את הגלולה ב 1 mL של תערובת נוגדנים. הוסף 10 μL של תאים (משלב 1.13) בכל אחד מצינורות הבקרה של צבע אחד (למעט שושלת יוחסין). הוסף 10 μL של תאים (משלב 1.14) בצינור היוחסין בצבע יחיד.
21. מודטה את המדגם ואת צינורות בקרת צבע יחיד ב 4 ° c על שייקר עבור 45 דקות. לכסות את דלי קרח עם מכסה או רדיד אלומיניום.
22. למלא את כל הצינורות עם מאגר צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את המדגם באחד מ-mL של פקדי מאגר וצבע יחיד ב-200 μL של מאגר.
23. העבר את המדגם ואת בקרי הצבע הבודד ל-5 מ ל מסנני מסנן של FACS.
24. קח את הצינורות אל מכונת מיון ולמיין את אוכלוסיית HSC (לעבור אסטרטגיה באיור 1א) בצינורות 1.5 ML המכילים 400 μl של תא גזע הרחבת בינונית.

2. לשעבר התרבות הVivo של תאי גזע המטבטיים

1. לאסוף צינורות המכילים תאים ממוינים (ראה סעיף 1 להפקת התא). צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. הסירו בעדינות את רוב הסופרנטנט מבלי להסיר את הגלולה ולהשאיר 50 – 80 μL על גבי הגלולה התא. פעולה זו מצמצמת את אובדן התאים.
2. להשעות מחדש את הגלולה התא בינונית הרחבת תא גזע לכרך הסופי תלוי במספר התנאים להיבדק (לספור עבור 100 μL לכל טוב/מצב של תרבות).
3. הכנת מדיום התרבות 2x המכיל בינונית הרחבת תא גזע, מקדם תא גזע (200 ng/ml), FLT3 ליגנד (4 ng/ml) ואנטיביוטיקה עט-דלקת (1%) (2x בינונית בסיס; טבלה של חומרים).
4. קח תרבות רקמה סטרילית שטופלו 96 U-תחתון צלחת הבאר (טבלת חומרים) ולזהות את הבארות שבו התאים יהיו תרבותיים (עיצוב צלחת באיור 1B).
   הערה: מומלץ למשתמשים להימנע מבארות שוליים, שכן הם רגישים יותר לאידוי.
5. שים 100 μL של בינוני 2x בסיס שהוכן בעבר בשלב 2.3 בבארות אלה. ב-NR מסומן היטב להוסיף 2 μL של פתרון 100 x NR (טבלת חומרים). . לחדש את נאט ו כל 24 שעות
   הערה: חידוש מלאי הוא ספציפי ל-NR. מאפטורים מטבוליים אחרים עשויים או אינם זקוקים לחידוש מלאי.
6. זרעי 100 μL של תאים שהוכנו בשלב 2.2 על גבי הבארות המכילות מדיום בסיס 2x. בניסוי זה מספר HSCs הזרע לבאר היו בין 800 – 1000 תאים.
7. הכינו חמש בארות נוספות המכילות מדיום בסיס 2x. בכל אחד מאלה להוסיף 100,000 מלאה במח העצם תאים (משלב 1.13) מושעה ב 100 μL של הרחבת תא גזע בינונית לשמש לצביעת פקדים עבור הודעה לאחר זרימת התרבות הניתוח cy, לנסות.
   הערה: אם משתמשים רוצים לשלב סמנים תא גזע סמנים מיטוכונדריאלי עבור ניתוח תרבות פוסט מומלץ למיין בנוסף את אוכלוסיית הקדמון (או תאי Ckit או תאים LKSCD150-תאים). זרעים אלה מיון ושלתי בבארות בקרת הצביעת עבור הצבת התרבות זרימת cy try ניתוח. להכין אחד טוב לכל צבע הכתם.
8. שים 200 μL של מים אוטוקלשים בכל הבארות שמסביב כדי להפחית אידוי מבארות המכילות תאים. השאירו את הצלחת מופרעת בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ למשך תקופת התרבות (72 h). הסר את הצלחת לחדש את ה-NR כל 24 שעות ולמקם אותו בחממה.

3. מדידה של מסה מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה

1. בסוף תקופת התרבות להכין פתרון 100x של TMRM (20 μM) ו Mitotracker ירוק (10 μM) (כתם פלורסנט ירוק) בינונית תא גזעהרחבה (טבלת חומרים).
2. הוסף 2 μL של פתרון TMRM של 100x ו-2 μL של פתרון צבע פלורסנט ירוק באורך 100x בכל אחת מבארות הבדיקה. הוסף 2 μL של 100x TMRM בבקרת TMRM היטב. הוסף 2 μL של כתם פלורסנט ירוק 100x בבקרת Mitotracker היטב. מניחים את הצלחת חזרה בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ עבור 45 דקות לכסות את החלק העליון של הצלחת עם רדיד אלומיניום.
   הערה: שליטה נוספת עם Verapamil (מעכבי משאבת ABC) יכול להיות מוכן אם ABC משאבת מתווכת לצבוע מתווך צריך להיבדק. בשביל זה, להוסיף 50 μM Verapamil באחת הבארות הבדיקה 1 h לפני הכתמים עבור TMRM וצבע פלורסנט ירוק.
3. להסיר את הצלחת מן החממה ו צנטריפוגה אותו ב 300 x g עבור 5 דקות. להפוך את הצלחת כדי להסיר את supernatant. הוסף 200 μL של מאגר FACS סטנדרטי (PBS-1 מ"מ EDTA-P/S-2% FBS), צנטריפוגה את הצלחת ב 300 x g עבור 5 דקות.. הסר את הסופרנטאנט חזור על שטיפת השלב הזה 3 x. על המשתמשים לוודא שלוחית הצלחת תמיד מכוסה בנייר כסף, כדי לספק חשיפה מינימלית לאור ישיר.
   הערה: אם משתמשים צריכים לשלב את הכתמים מיטוכונדריאלי עם כתמים תא גזע, המדגם יצטרך להיות מודקרת עם שילוב נוגדן של כל סמני תא גזע ושולטת צבע יחיד יהיה צורך להיות מוכתם עם נוגדנים בודדים בנפרד על 4 ° צ' עבור 30 – 45 דקות.
   הערה: בכל השלבים משתמשים חייבים לשמור על הצלחת מכוסה רדיד אלומיניום. על המשתמשים לשים לב שצעד מכתים נוסף זה ושלבי הכביסה הבאים עלולים לגרום לאבדן תאים נוסף.
4. השהה מחדש את התאים ב-200 μL של מאגר FACS והעבר לצינורות של FACS.
5. הפעל את הדגימות על הזרם cytometer (ראה איור 1). צינורות צבע יחיד המכילים WBM כוללים: (1) ללא ויטראז; (2) ממשק DAPI; (3) TMRM (PE); (4) צבע פלורסנט ירוק (FITC); (5) מלוא הכתמים (PE ו-FITC).
6. ראשית רכוש את פקדי הצבע היחיד כדי להגדיר את המחשב. השתמש בתוכנה הפועלת במחשב כדי לחשב את הפיצוי. לאחר החלת פיצוי, לרכוש את הדוגמה HSC ולהקליט כמה שיותר אירועים.
   הערה: אם תא הגזע ואת סמנים מיטוכונדריאלי משולבים, המשתמשים צריכים להיות זהירים במיוחד עם פיצוי בין TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5), ו-סקה-1 (APC). כמו כן, יש להפעיל את הדגימות מיד לאחר הצביעת.
7. יצא את קבצי ה-FACS מהציטומטר ונתח את הנתונים בתוכנת ניתוח (טבלת חומרים).
   1. לניתוח, פתח את הקובץ בתוכנת הניתוח. השימוש ב-FSC-A ו-אס. אס. מזהה את אוכלוסיית התאים. זיהוי הזינגטים בשערים הבאים לפני התוויית השבר השלילי של DAPI (תאים חיים). בשער התאים החיים להפוך את העלילה מתאר ב TMRM וירוק הכתם בערוץ פלורסנט למדוד ΔΨm ו מסה, בהתאמה (איור 2א). לייצא את עוצמת הזריחה הממוצע (MFI) של שני ערוצים אלה בשער התא החי.
   2. השער הנמוך של TMRM מוגדר בהתבסס על אוכלוסיית הכתפיים בערוץ TMRM. ניתן להשתמש בפקד הצבע היחיד של TMRM כדי לזהות אוכלוסיית כתף זו כדי להגדיר את השער. לייצא את הפרופורציה של החיים של תאים בשער הנמוך TMRM בשליטתך ולבדוק דגימות עבור התוויית המידע.

תוצאות

באיור 1 , אנו מראים את אסטרטגיית הפריסה לבידוד של תאי גזע המטבטיים מתוך מח עצם העכבר והפריסה של הצלחת עבור תרבות vivo ex שלהם. איור 1A מראה את הזיהוי של שבר לימפוציט ב-אס. אס. אס/fsc-מזימה. כאשר הוסרו ממנו בשער הזינגטים ולאחריו זיהוי תאים חיים על-ידי היעדר א?...

Discussion

התקנה הדוקה של הפונקציה HSC חשוב לשמור על המטפיאה יציבה במהלך חייו של אורגניזם. כמו סוגים שונים של תאים אחרים בגוף, רכיב מפתח שתורם לוויסות הפונקציה HSC הוא חילוף החומרים הסלולר. מחקרים קודמים מהמעבדה שלנו⁹ ואחרים 2^,3 יש מעורבים את החשיבות של^{המיטומטר}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL FACS tubes	Falcon	352235	Sample preparation
96-U bottom plate	Corning	3799	Cell culture
AutoMACS pro separator	Miltenyi Biotec		Automatic Cell separation
BD FACS AriaIII	Becton and Dickinson		Cell sorting
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit	BD	558451	Lineage depletion
BD LSRII	Becton and Dickinson		FACS acquisition machine
BD-DIVA	Becton and Dickinson		Acquisition software
CD150 PE	Biolegend	115904	Antibody staining mix
CD150 PE-Cy5	Biolegend	115912	Antibody staining mix
CD48 PB	Biolegend	103418	Antibody staining mix
Centrifuge- 5810R	Eppendorf		Centrifugation
Ckit PeCy7	Biolegend	105814	Antibody staining mix
Flow jo	FlowJo LLC		FACS Analysis software
GraphPad-Prism	GraphPad		Plotting data into graphs
Mitotracker Green	Invitrogen	M7514	Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM
Nicotinamide Riboside (NR)	Custom synthesized in house		Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM
PBS	CHUV	1000324	Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
Pen-Strep (P/S)	Life technologies	15140122	Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
RBC Lysis buffer	Biolegend	420301	Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)	RnD	427-FL-005/CF	Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL
Recombinant mouse stem cell factor (SCF)	RnD	455-MC-010/CF	Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL
Sca1 APC	Thermo Fisher Scientific	17-5981-82	Antibody staining mix
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium	SIGMA	S0192	Ex vivo culture
Streptavidin Pac orange	Life Technologies	S32365	Antibody staining mix
Streptavidin Tx red	Life Technologies	S872	Antibody staining mix
TMRM	Invitrogen	T668	Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM
Ultra pure EDTA	Invitrogen	15575-038	Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM